CN112877323B - 一种自适应诱变筛选高产纤维素酶丝状真菌的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种自适应诱变筛选高产纤维素酶丝状真菌的方法及获得的突变菌株，具体涉及非洲哈茨木霉(Trichoderma afroharzianum)的突变。具体步骤包括：制备野生型非洲哈茨木霉孢子悬浮液；对野生型非洲哈茨木霉进行3轮诱变；诱变菌株的筛选；优良突变株酶活稳定性的测定。通过3轮自适应诱变对菌株进行诱变处理，诱变目的性强、实用性高。本发明方法最终诱变筛选获得一株纤维素酶活显著提升(FPA提升3.17倍、CMCase提升4.77倍、pNPCase提升3.86倍、pNPGase提升2.97倍)且遗传性状稳定的突变株MEA‑12，在工业纤维素酶制剂生产中具有重要价值。
Description
技术领域
本发明属于工业微生物技术领域，具体涉及一种自适应诱变筛选高产纤维素酶丝状真菌的方法及其获得的突变菌株。
背景技术
纤维素在自然界中分布广泛，是最有前景的生物转化原材料之一。作为传统化石能源的理想替代品，来自纤维素类生物质的纤维燃料乙醇引起各国的关注。纤维燃料乙醇可以通过热化学方法以及生物化学方法生产。纤维素酶是将纤维素类生物质转化为可发酵糖以生产燃料乙醇的关键。此过程中使用的纤维素酶是复合酶，即含内切葡聚糖酶(EC3.2.1.4)，纤维二糖水解酶(EC3.2.1.91)和β-葡萄糖苷酶(EC 3.2.1.21)，根据C1-Cx假说，上述3种纤维素酶协同作用将纤维素转化为葡萄糖。目前，已知能够产生纤维素酶的微生物有细菌、真菌、放线菌。丝状真菌与其它微生物来源相比具有更高的分泌能力而被认为是最有潜力的纤维素酶生产菌。
通过自然选育获得的丝状真菌大多酶活性较低、酶系不全，远不能满足工业生产要求，所以选育高纤维素酶产量和质量的菌株是拓展纤维素酶应用范围的根本。非定向诱变育种方法因其适用广泛、操作简单、成本低廉等优点成为微生物育种的重要途经。诱变育种技术根据所用诱变介质的不同，主要分为物理诱变和化学诱变。然而，不同诱变介质的优缺点不一，化学诱变剂的使用能大幅度提高目标菌株酶活，但所得突变株在传代过程中易发生回复突变，同样的情况也经常存在于紫外诱变过程中(光复活修复，Photoreactivation Repair)，而ARTP与重离子体此类诱变源所得突变株的遗传稳定性良好但酶活的提升幅度却不高，如何权衡突变体正向突变率与遗传稳定性是今后研究过程中的一大重点。此外，单轮诱变与多轮诱变也会影响最终诱变效果，单一诱变技术的重复处理往往会降低突变效率。
此外，针对非洲哈茨木霉(Trichoderma afroharzianum)进行有效突变获得高产纤维素酶的菌株也非常困难。
发明内容
本发明的目的在于克服现有诱变技术的不足之处，提供了一种自适应诱变筛选高产纤维素酶丝状真菌的方法，解决了上述背景技术中的问题。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：提供了一种自适应诱变筛选高产纤维素酶丝状真菌的方法，包括如下步骤：
(1)将野生型非洲哈茨木霉进行试管斜面培养；
在步骤(1)中，所述野生型非洲哈茨木霉购于中国工业微生物菌种保藏管理中心，菌株保藏编号：CICC 40189；所述野生型非洲哈茨木霉试管斜面培养的条件为在28℃，培养5～7d；所述野生型非洲哈茨木霉的培养基为查氏培养基：蔗糖30.0g，NaNO3 3.0g，MgSO4·7H2O 0.5g，KCl 0.5g，FeSO4·4H2O 0.01g，K2HPO4 1.0g，琼脂15.0g，加去离子水定容至1.0L，pH6.0～6.5，121℃灭菌20min。
(2)制备野生型非洲哈茨木霉孢子悬浮液；
在步骤(2)中，所述制备野生型非洲哈茨木霉孢子悬浮液的具体方法为：取培养5～7d的野生型非洲哈茨木霉试管斜面，加入适量1％生理盐水，冲洗后转移至含100mL 1％生理盐水的250mL锥形瓶，锥形瓶中含玻璃珠若干，30℃、180rpm振荡15min，将液体转移至另一250mL空锥形瓶，锥形瓶中含玻璃珠若干、瓶颈填充脱脂棉，30℃、180rpm振荡15min，用血球计数板计数，调整孢子数量为1×107～1×108个/mL，即得野生型非洲哈茨木霉孢子悬浮液，以上试剂耗材均做灭菌处理。
(3)对野生型非洲哈茨木霉进行3轮诱变；
在步骤(3)中，所述对野生型非洲哈茨木霉进行3轮诱变的具体方法为：
1)甲基硝基亚硝基胍(N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine，MNNG)诱变：取0.1g 98％MNNG试剂溶解于1mL丙酮配制成10％MNNG溶液；用移液枪移取970μL野生型非洲哈茨木霉孢子悬浮液与30μL 10％MNNG溶液，置于恒温摇床中，30℃、180rpm振荡处理，选择处理时间为0min、10min、20min、30min、40min、50min、60min、70min、80min、90min；诱变处理结束后，12000rpm离心3min弃上清，1％生理盐水洗涤沉淀2次，制成新的孢子悬浮液；取100μL诱变后孢子悬浮液涂布至改良CMC-Na平板，30℃恒温培养3～5d；
2)甲基磺酸乙酯(Ethyl methyl sulfonate，EMS)诱变：取99％EMS试剂与丙酮按体积比1:1混匀配制成50％EMS溶液；用移液枪移取970μL上一轮诱变后非洲哈茨木霉孢子悬浮液与30μL 50％EMS溶液，置于恒温摇床中，30℃、180rpm振荡处理，选择处理时间为0min、10min、20min、30min、40min、50min、60min、70min、80min、90min；诱变处理结束后，12000rpm离心3min弃上清，1％生理盐水洗涤沉淀2次，制成新的孢子悬浮液；取100μL诱变后孢子悬浮液涂布至改良七叶苷平板，30℃恒温培养3～5d；
3)常压室温等离子体(Atmospheric Room Temperature Plasma，ARTP)诱变：将ARTP-IIS型诱变育种仪紫外消杀15～30min并预热15～30min；用移液枪移取10μL上一轮诱变后非洲哈茨木霉孢子悬浮液均匀涂抹于载片上，置于诱变育种仪中辐射处理，选择处理时间为0s、30s、60s、90s、120s、150s、180s、210s、240s、270s；诱变处理结束后，将载片取出置于装有1mL 1％生理盐水的EP管中，涡旋充分振荡均匀，制成新的孢子悬浮液；取100μL诱变后孢子悬浮液涂布至改良MCC平板，30℃恒温培养3～5d。
(4)每轮诱变过程中诱变致死率与正突变率的计算；
在步骤(4)中，所述诱变致死率的计算公式为：
致死率(％)＝(空白对照平板菌落数-诱变平板菌落数)/空白对照平板菌落数×100％
所述正突变率的计算公式为：
正突变率(％)＝表观正突变菌落数/诱变平板菌落数×100％。
(5)诱变菌株的初筛与复筛；
在步骤(5)中，所述诱变菌株的初筛与复筛的具体方法为，初筛：第1轮诱变结束后，在长有菌落的改良CMC-Na平板上覆盖1mg/mL刚果红溶液，15min～30min后倒去刚果红溶液，加入1mol/L NaCl溶液，15min～30min后倒去NaCl溶液，挑选透明圈直径与菌落直径比值高于出发菌株的菌落，即表观正突变菌落；第2轮诱变结束后，在长有菌落的改良七叶苷平板上挑选颜色深且直径大的菌落，即表观正突变菌落；第3轮诱变结束后，在长有菌落的改良MCC平板上挑选透明圈直径与菌落直径比值高于出发菌株的菌落，即表观正突变菌落；
复筛：将表观正突变菌落接种于种子培养基，置于恒温摇床中，30℃、180rpm振荡培养2～4d，按10％接种量将种子接种至产酶发酵培养基，置于恒温摇床中，30℃、180rpm振荡培养6～8d，10000rpm离心取上清，参照GBT 35808-2018进行滤纸纤维素酶活(FPA)、内切纤维素酶活(CMCase)、外切纤维素酶活(pNPCase)、β-葡萄糖苷酶活(pNPGase)的测定。
(6)优良突变株酶活稳定性的测定。
在步骤(6)中，所述优良突变株酶活稳定性的测定方法为：将优良突变株从筛选平板挑出后接种至查氏培养基，28℃，培养4～6d，记为Ⅰ代，同样条件下，查氏培养基平板传代培养至Ⅶ代；将Ⅰ～Ⅶ代优良突变株按骤(5)中所述诱变菌株的复筛方法进行纤维素酶活测定。
本发明通过3轮自适应诱变对丝状真菌进行诱变处理，并与各改良筛选平板相结合，提高了突变效率，诱变目的性强、实用性高。本发明优化后的诱变条件为：第1轮MNNG诱变时间控制在50～70min，第2轮EMS诱变时间控制在60～80min，第3轮ARTP诱变时间控制在210～270s；上述3轮诱变，其诱变致死率均≥99％；在此条件下，更容易获得高产纤维素酶丝状真菌。
最终，通过本发明的方法获得了一株纤维素酶活显著提升(FPA提升3.17倍、CMCase提升4.77倍、pNPCase提升3.86倍、pNPGase提升2.97倍)且遗传性状稳定的突变株MEA-12，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期：2021年1月25日，保藏编号为CGMCC No.21438。
因此，本发明还提供一种高产纤维素酶非洲哈茨木霉(Trichodermaafroharzianum)的突变菌株MEA-12，其于2021年1月25日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.21438。
进一步地，本发明提供上述的突变菌株MEA-12在产纤维素酶中的应用，例如包括通过产酶发酵培养，从发酵液中收集纤维素酶的步骤。其中所述纤维素酶是FPA酶、CMCase酶、pNPCase酶、pNPGase酶中的一种或多种。更进一步地，本发明还提供上述的突变菌株MEA-12在在纤维素类生物质转化中的应用。
本发明还提供一种用于所述自适应诱变筛选高产纤维素酶丝状真菌的方法的试剂盒，其特征在于，包括下述试剂：
1)分别包装的诱变剂甲基硝基亚硝基胍和甲基磺酸乙酯；
2)分别包装的下述三种筛选培养基：
改良CMC-Na培养基，优选由下述制备方法制得：配方为CMC-Na 10.0g，尿素0.3g，胰蛋白胨0.75g，酵母提取物0.25g，(NH4)2SO4 1.4g，KH2PO4 2.0g，CaCl2 0.3g，MgSO4·7H2O0.3g，Triton X-100 2.0g，2-脱氧-D-葡萄糖5.0g，琼脂20.0g，Mandels微量元素营养盐1.0mL，加去离子水定容至1.0L，pH自然，121℃灭菌20min；
七叶苷平板培养基，由下述制备方法制得：七叶苷3.0g，柠檬酸铁0.5g，尿素0.3g，胰蛋白胨0.75g，酵母提取物0.25g，(NH4)2SO4 1.4g，KH2PO4 2.0g，CaCl2 0.3g，MgSO4·7H2O0.3g，Triton X-100 2.0g，2-脱氧-D-葡萄糖10.0g，琼脂20.0g，Mandels微量元素营养盐1.0mL，加去离子水定容至1.0L，pH自然，121℃灭菌20min；
改良MCC培养基，由下述制备方法制得：MCC 10.0g，尿素0.3g，胰蛋白胨0.75g，酵母提取物0.25g，(NH4)2SO4 1.4g，KH2PO4 2.0g，CaCl2 0.3g，MgSO4·7H2O 0.3g，Triton X-1002.0g，2-脱氧-D-葡萄糖50.0g，琼脂20.0g，Mandels微量元素营养盐1.0mL，加去离子水定容至1.0L，pH自然，121℃灭菌20min；其中，所述Mandels微量元素营养盐的配方为：FeSO4·7H2O 5.0g，ZnSO4·7H2O 1.4g，CoCl·6H2O 2.0g，MnSO4·H2O 1.6g，加去离子水定容至1.0L，pH自然，121℃灭菌20min。
进一步还包括：
分别包装的纤维素酶活，和/或内切纤维素酶活，和/或外切纤维素酶活，和/或β-葡萄糖苷酶活测定相关试剂；
更进一步还包括：
用于培养非洲哈茨木霉的查氏培养基。
针对产纤维素酶丝状真菌诱变效率不高的问题，本发明优化了产纤维素酶丝状真菌诱变的时间，并采用自适应诱变的方法，提高了突变效率，为快速高效筛选纤维素酶活高且遗传性状稳定的突变株提供了新思路；尤其是获得了一株高产纤维素酶且遗传性状稳定的突变株MEA-12。
附图说明
图1为每轮诱变过程中诱变致死率与正突变率。其中，a是第1轮MNNG诱变过程中诱变致死率与正突变率；b是第2轮EMS诱变过程中诱变致死率与正突变率；c是第3轮ARTP诱变过程中诱变致死率与正突变率。
图2为野生菌株及其3轮诱变获得优良突变株在不同筛选平板上的生长情况。其中，a是每轮诱变获得优良突变株在改良CMC-Na筛选平板(已作刚果红染色处理)上的生长情况；b是每轮诱变获得优良突变株在改良七叶苷筛选平板上的生长情况；c是每轮诱变获得优良突变株在改良MCC筛选平板上的生长情况；进一步地，TA是野生型非洲哈茨木霉菌株，M-84是第1轮诱变获得优良突变株，ME-10是第2轮诱变获得优良突变株，MEA-12是第3轮诱变获得优良突变株。
图3为野生菌株及其3轮诱变获得优良突变株4种纤维素酶活对比。其中，a是野生菌株及其3轮诱变获得优良突变株FPA酶活；b是野生菌株及其3轮诱变获得优良突变株CMCase酶活；c是野生菌株及其3轮诱变获得优良突变株pNPCase酶活；d是野生菌株及其3轮诱变获得优良突变株pNPGase酶活。
图4为优良突变株MEA-12的传代发酵。其中，a是优良突变株MEA-12传代发酵FPA酶活稳定性；b是优良突变株MEA-12传代发酵CMCase酶活稳定性；c是是优良突变株MEA-12传代发酵pNPCase酶活稳定性；d是优良突变株MEA-12传代发酵pNPGase酶活稳定性。
图5本发明自适应诱变筛选高产纤维素酶丝状真菌的方法步骤示意图。
具体实施方式
下面通过具体实施例进一步阐述本发明，以便更好理解本发明。
实验步骤：
本发明自适应诱变筛选高产纤维素酶丝状真菌的方法步骤示意图如图5所示。具体操作如下：
(1)将野生型非洲哈茨木霉进行试管斜面培养；
所述野生型非洲哈茨木霉购于中国工业微生物菌种保藏管理中心，菌株保藏编号：CICC40189；所述野生型非洲哈茨木霉试管斜面培养的条件为在28℃，培养6d；所述野生型非洲哈茨木霉的培养基为查氏培养基：蔗糖30.0g，NaNO3 3.0g，MgSO4·7H2O 0.5g，KCl0.5g，FeSO4·4H2O 0.01g，K2HPO4 1.0g，琼脂15.0g，加去离子水定容至1.0L，pH 6.0～6.5，121℃灭菌20min。
(2)制备野生型非洲哈茨木霉孢子悬浮液；
所述制备野生型非洲哈茨木霉孢子悬浮液的具体方法为：取培养6d的野生型非洲哈茨木霉试管斜面，加入适量1％生理盐水，冲洗后转移至含100mL 1％生理盐水的250mL锥形瓶，锥形瓶中含玻璃珠若干，30℃、180rpm振荡15min，将液体转移至另一250mL空锥形瓶，锥形瓶中含玻璃珠若干、瓶颈填充脱脂棉，30℃、180rpm振荡15min，用血球计数板计数，调整孢子数量为1×107～1×108个/mL，即得野生型非洲哈茨木霉孢子悬浮液，以上试剂耗材均做灭菌处理。
(3)对野生型非洲哈茨木霉进行3轮诱变；
所述对野生型非洲哈茨木霉进行3轮诱变的具体方法为：
1)甲基硝基亚硝基胍(N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine，MNNG)诱变：取0.1g 98％MNNG试剂溶解于1mL丙酮配制成10％MNNG溶液；用移液枪移取970μL野生型非洲哈茨木霉孢子悬浮液与30μL 10％MNNG溶液，置于恒温摇床中，30℃、180rpm振荡处理，选择处理时间为0min、10min、20min、30min、40min、50min、60min、70min、80min、90min；诱变处理结束后，12000rpm离心3min弃上清，1％生理盐水洗涤沉淀2次，制成新的孢子悬浮液；取100μL诱变后孢子悬浮液涂布至改良CMC-Na平板，30℃恒温培养4d；
2)甲基磺酸乙酯(Ethyl methyl sulfonate，EMS)诱变：取99％EMS试剂与丙酮按体积比1:1混匀配制成50％EMS溶液；用移液枪移取970μL上一轮诱变后非洲哈茨木霉孢子悬浮液与30μL 50％EMS溶液，置于恒温摇床中，30℃、180rpm振荡处理，选择处理时间为0min、10min、20min、30min、40min、50min、60min、70min、80min、90min；诱变处理结束后，12000rpm离心3min弃上清，1％生理盐水洗涤沉淀2次，制成新的孢子悬浮液；取100μL诱变后孢子悬浮液涂布至改良七叶苷平板，30℃恒温培养4d；
3)常压室温等离子体(Atmospheric Room Temperature Plasma，ARTP)诱变：将ARTP-IIS型诱变育种仪紫外消杀30min并预热15min；用移液枪移取10μL上一轮诱变后非洲哈茨木霉孢子悬浮液均匀涂抹于载片上，置于诱变育种仪中辐射处理，选择处理时间为0s、30s、60s、90s、120s、150s、180s、210s、240s、270s；诱变处理结束后，将载片取出置于装有1mL 1％生理盐水的EP管中，涡旋充分振荡均匀，制成新的孢子悬浮液；取100μL诱变后孢子悬浮液涂布至改良MCC平板，30℃恒温培养4d；
所述改良CMC-Na平板配方为：CMC-Na 10.0g，尿素0.3g，胰蛋白胨0.75g，酵母提取物0.25g，(NH4)2SO4 1.4g，KH2PO4 2.0g，CaCl2 0.3g，MgSO4·7H2O 0.3g，Triton X-1002.0g，2-脱氧-D-葡萄糖5.0g，琼脂20.0g，Mandels微量元素营养盐1.0mL，加去离子水定容至1.0L，pH自然，121℃灭菌20min；所述改良七叶苷平板配方为：七叶苷3.0g，柠檬酸铁0.5g，尿素0.3g，胰蛋白胨0.75g，酵母提取物0.25g，(NH4)2SO4 1.4g，KH2PO4 2.0g，CaCl20.3g，MgSO4·7H2O 0.3g，Triton X-100 2.0g，2-脱氧-D-葡萄糖10.0g，琼脂20.0g，Mandels微量元素营养盐1.0mL，加去离子水定容至1.0L，pH自然，121℃灭菌20min；所述改良MCC平板配方为：MCC 10.0g，尿素0.3g，胰蛋白胨0.75g，酵母提取物0.25g，(NH4)2SO4 1.4g，KH2PO42.0g，CaCl2 0.3g，MgSO4·7H2O 0.3g，Triton X-100 2.0g，2-脱氧-D-葡萄糖50.0g，琼脂20.0g，Mandels微量元素营养盐1.0mL，加去离子水定容至1.0L，pH自然，121℃灭菌20min；进一步地，所述Mandels微量元素营养盐的配方为：FeSO4·7H2O 5.0g，ZnSO4·7H2O1.4g，CoCl·6H2O 2.0g，MnSO4·H2O 1.6g，加去离子水定容至1.0L，pH自然，121℃灭菌20min。
(4)每轮诱变过程中诱变致死率与正突变率的计算；
所述诱变致死率的计算公式为：
致死率(％)＝(空白对照平板菌落数-诱变平板菌落数)/空白对照平板菌落数×100％
所述正突变率的计算公式为：
正突变率(％)＝表观正突变菌落数/诱变平板菌落数×100％。
(5)诱变菌株的初筛与复筛；
所述诱变菌株的初筛与复筛的具体方法为，初筛：第1轮诱变结束后，在长有菌落的改良CMC-Na平板上覆盖1mg/mL刚果红溶液，30min后倒去刚果红溶液，加入1mol/L NaCl溶液，15min后倒去NaCl溶液，挑选透明圈直径与菌落直径比值高于出发菌株的菌落，即表观正突变菌落；第2轮诱变结束后，在长有菌落的改良七叶苷平板上挑选颜色深且直径大的菌落，即表观正突变菌落；第3轮诱变结束后，在长有菌落的改良MCC平板上挑选透明圈直径与菌落直径比值高于出发菌株的菌落，即表观正突变菌落；复筛：将表观正突变菌落接种于种子培养基，置于恒温摇床中，30℃、180rpm振荡培养3d，按10％接种量将种子接种至产酶发酵培养基，置于恒温摇床中，30℃、180rpm振荡培养7d，10000rpm离心取上清，参照GBT35808-2018进行滤纸纤维素酶活(FPA)、内切纤维素酶活(CMCase)、外切纤维素酶活(pNPCase)、β-葡萄糖苷酶活(pNPGase)的测定。
(6)优良突变株酶活稳定性的测定。
所述优良突变株酶活稳定性的测定方法为：将优良突变株从筛选平板挑出后接种至查氏培养基，28℃，培养5d，记为Ⅰ代，同样条件下，查氏培养基平板传代培养至Ⅶ代；将Ⅰ～Ⅶ代优良突变株参照GBT 35808-2018进行纤维素酶活测定。
实验结果：
(1)每轮诱变过程中诱变致死率与正突变率曲线(见图1)
从图1中可以看出，在每轮诱变过程中，随着诱变时间的增加，菌株的致死率逐渐上升。第1轮MNNG诱变过程中，当诱变时间为50min时，菌株致死率达到99％以上，当诱变时间达到90min时，无菌体生长，结合正突变率曲线可知，第1轮诱变处理的最佳时间为50min；第2轮EMS诱变过程中，当诱变时间为60min时，菌株致死率达到99％以上，结合正突变率曲线可知，第2轮诱变处理的最佳时间为70min；第3轮ARTP诱变过程中，当诱变时间为210s时，菌株致死率达到99％以上，结合正突变率曲线可知，第3轮诱变处理的最佳时间为240s。
(2)每轮诱变过程中高产纤维素酶菌株的的初筛与复筛
经过第1轮MNNG诱变获得突变株总数为84株，结合改良CMC-Na平板初筛，透明圈直径与菌落直径比值高于出发菌株的菌落有24株，其中，有12株突变株在纤维素酶活复筛过程中的4种纤维素酶活均高于出发菌株，酶活最高的1株菌株编号为84，故将其命名为M-84；经过第2轮EMS诱变获得突变株总数为102株，结合改良七叶苷平板初筛，颜色深且直径大于出发菌株的菌落有27株，其中，有4株突变株在纤维素酶活复筛过程中的4种纤维素酶活均高于出发菌株，酶活最高的1株菌株编号为10，故将其命名为ME-10；经过第3轮ARTP诱变获得突变株总数为86株，结合改良MCC平板初筛，透明圈直径与菌落直径比值高于出发菌株的菌落有25株，其中，有18株突变株在纤维素酶活复筛过程中的4种纤维素酶活均高于出发菌株，酶活最高的1株菌株编号为12，故将其命名为MEA-12；野生菌株及其3轮诱变获得优良突变株在不同筛选平板上的生长情况及4种纤维素酶活对比见图2和图3。
(3)优良突变株MEA-12酶活稳定性分析
为了检测突变株MEA-12的遗传稳定性，对突变株MEA-12在平板上连续传代7次，并进行产酶发酵培养，检测每代发酵液中4种纤维素酶活性。结果如图4所示，其中a是优良突变株MEA-12传代发酵FPA酶活稳定性；b是优良突变株MEA-12传代发酵CMCase酶活稳定性；c是是优良突变株MEA-12传代发酵pNPCase酶活稳定性；d是优良突变株MEA-12传代发酵pNPGase酶活稳定性。从其结果可知，3轮自适应诱变产生的突变株MEA-12经7次传代后，4种纤维素酶活基本稳定，具有良好的遗传稳定性。
本发明采用自适应诱变方法，该方法基于微生物自适应实验室进化(Adaptivelaboratory evolution，ALE)，通过在不同诱变阶段人为调整筛选培养基(Screeningmedium，SM 1-3)组分以及环境因子(如代谢阻遏物)浓度实现丝状真菌综合产酶能力的提高。与以往诱变方式相比，ALE除提供了不同诱变源外还设计了对应每一诱变源的筛选培养基，诱变目的性强、实用性高。本发明方法最终获得一株纤维素酶活显著提升(FPA提升3.17倍、CMCase提升4.77倍、pNPCase提升3.86倍、pNPGase提升2.97倍)且遗传性状稳定的突变株MEA-12(已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期：2021年1月25日，保藏编号为CGMCC No.21438)，在工业纤维素酶制剂生产中具有重要价值。
以上所述，仅为本发明较佳实施例而已，故不能依此限定本发明实施的范围，即依本发明保护范围及说明书内容所作的等效变化与修饰，皆应仍属本发明涵盖的范围内。
Claims (2)
1.一种高产纤维素酶非洲哈茨木霉(Trichoderma afroharzianum)的突变菌株，其特征在于，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期：2021年1月25日，保藏编号为CGMCC No.21438。
2.根据权利要求1所述的突变菌株在产纤维素酶中的应用。
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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