CN114990102A - 一种产纤维素酶木霉菌株的复合诱变育种方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种产纤维素酶木霉菌株的复合诱变育种方法，从霉变甘蔗渣中筛选的木霉菌株A‑8经紫外线后筛选出酶活最高的菌株，再将筛选出的菌株经等离子体诱变处理后再筛选酶活性最高的菌株。本发明操作简单安全、诱变成功率高及能获得大量目的突变体。
Description
技术领域
本发明属于微生物遗传育种技术领域，尤其涉及一种产纤维素酶木霉菌株的复合诱变育种方法。
背景技术
甘蔗渣生物质主要由纤维素、半纤维素和木质素这三个成分组成，具有可再生、低成本、环境友好、生物相容、可生物降解等优点，有利于创造高附加值产品，保障能源安全以及解决环境污染问题。纤维素生物质的高值化、资源化利用已经成为研究热点，而甘蔗渣纤维素材料既节能又环保，在降解纤维素生物质的多种方法中，生物法较行之有效，纤维素的降解和转化利用的是微生物的次级代谢产物纤维素酶。几十年来，研究者们对各种真菌培养物进行了酶的筛选，但大多数真菌培养物尚未被发现。筛选出产酶能力强且酶活性高的野生菌株可以为企业带来较高的商业利润，而且对纤维素资源的有效利用具有重要意义。
但是使用传统的发酵优化已经很难进一步提高纤维素酶的产量，诱变选育技术是获取纤维素降解菌和提高其产酶能力较直接且有效的方式。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明一种产纤维素酶木霉菌株的复合诱变育种方法，将从霉变甘蔗渣中筛选的木霉菌株A-8经紫外线(Ultraviolet，UV)和等离子体(AtmosphericRoom Temperature Plasma，ARTP)进行复合诱变处理，以摇瓶培养测得的纤维素酶酶活为依据，快速简便获得新菌株。所述木霉菌株A-8,保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心CGMCC No.20746，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏时间为2020年10月26日。
为实现上述目的，本发明采用了以下的技术手段：
一种产纤维素酶木霉菌株的复合诱变育种方法，包括以下步骤：
(1)将所述的木霉菌株制备成孢子悬液后涂布于刚果红培养基上，在紫外线下辐照；
(2)选取步骤(1)获得的正突变菌株进行发酵，从中选取出酶活最高者；
(3)将步骤(2)获得的菌株经斜面培养后制成孢子悬液，用离子体诱变育种进行诱变；
(4)将经过步骤(3)获得的菌株以酶活为依据，筛选出高产纤维素酶的菌株。
所述紫外线辐照的条件是紫外线功率为15W，辐照距离为25cm，辐照时间4min。
所述离子体诱变时间为400s。
本发明获得的有益效果是：采用紫外线和等离子体进行复合诱变育种，操作简单安全，成功率高，能获得大量目的突变体。经过诱变处理后，得到一株突变菌株，纤维素酶酶活较出发菌株提高2.38倍。表明野生型菌株通过此诱变的方法可提高其产酶能力。
附图说明
图1为野生木霉在UV下不同辐照时间下的致死率；
图2为UV诱变菌株在ARTP诱变仪不同处理时间下的致死率；
图3为所获得的突变菌株遗传稳定性。
具体实施方式
下面通过具体实例对本发明作进一步的说明，本发明的实例是为了使本领域的技术人员更好地理解本发明，并不对本发明作任何的限制。
实施例1
本实施例采用木霉属A-8进行诱变育种的一个实施例。
(1)将木霉属A-8制备成孢子悬液后，在紫外线下辐照：
孢子悬液的制备
转接野生菌株木霉属A-8，30℃PDA斜面培养菌株5-7d产孢子，用1％Tween 80洗下墨绿色孢子，在振荡器上以12000r/min振荡5min，使孢子分布均匀，经脱脂棉过滤制成孢子悬液，采用血球计数板将孢子浓度控制在107个/mL左右。后续所用孢子悬液均按此法制备。
菌株的UV诱变
将制备出的孢子悬液，取200μL孢子悬液涂布于CMC-Na平板上，在辐照距离为25cm、紫外线功率为15W的条件下(紫外灯预热30min)，分别对菌株进行0、1、2、3、4、5、6、7、8、9和10min的辐照。将诱变的菌株悬液梯度稀释后接种于CMC-Na培养基上(需在红光条件下操作)，30℃避光 (用黑布包裹)培养48h，进行平板菌落计数，计算孢子致死率，并绘制出UV诱变孢子的致死曲线。以不经UV处理的菌株平板为对照，以照射时间为X 轴，致死率为Y轴，绘制野生菌株的UV诱变致死曲线，如图1所示。
根据菌株的UV诱变致死曲线，确定最适照射时间：另取200μL孢子悬液涂布于刚果红培养基上，按照上述步骤对其进行UV诱变及培养。取UV辐照功率为15W，辐照距离为25cm，辐照时间4min。
(2)选取正突变的菌株进行发酵复筛实验，发酵培养完成后，6000 r/min，4℃离心收集上清液，采用DNS比色法测定酶活，选出菌株中测得酶活最高者。
(3)UV突变菌株的ARTP诱变
以UV诱变后筛选得到酶活性最高的菌株(UV突变株)为出发菌株经斜面培养，制成孢子悬液，采用ARTP诱变育种仪进行诱变。移取1mL孢子菌悬液 (107个/mL)于无菌离心管中12000r/min，4℃，离心10min，去上清，加入等体积的5％甘油振荡重悬，取10μL重悬孢子液平铺到ARTP无菌专用载片上，放入ARTP仪器中分别照射0、100、200、300、400、500、600s，之后将不同处理时间的载片分别放入990μL无菌水中浸泡，振荡器最大频率振荡3-5 min以洗下载片上的菌体，再将菌液浓度稀释至104个/mL和103个/mL，取100 μL进行涂布培养，平板菌落计数，计算致死率，并绘制出ARTP诱变致死曲线。以不经ARTP处理的菌株平板为对照，以照射时间为X轴，致死率为Y 轴，绘制UV突变株的ARTP诱变致死曲线，如图2所示。
根据UV突变株的ARTP诱变致死曲线，制备孢子悬液并重悬后，按照上述步骤对其进行ARTP诱变及培养，选取ARTP诱变时间为400s，选取正突变的菌株进行发酵复筛实验，发酵培养完成后离心收集上清液，采用DNS比色法测定酶活。
(4)突变菌株的筛选
突变菌株的初筛
采用刚果红培养基对突变菌株进行初步筛选。野生菌株孢子悬液经UV、 ARTP诱变后，进行梯度稀释涂布刚果红培养基上，挑选并测量透明圈直径与菌落直径比值大的突变株，选取两者比值相对较大的突变菌株作为后续的实验菌株。
突变菌株的复筛
将初筛得到的菌株接入PDA斜面进行纯化培养，之后制成浓度为107个/mL 孢子悬液，以2％接种量接入产酶培养基，置于30℃、200r/min恒温振荡器中培养5d，经离心得到粗酶液，测定其CMC酶活，选择酶活性较高者作为后续实验菌株。
经过测定，突变菌株酶活力比没有经过诱变前高2.38倍，经过ARTP诱变后的菌株活性比仅经过UV辐照的高出1.4倍。
(5)突变菌株的遗传稳定性实验
将复筛得到酶活较高的突变菌株接入产酶培养基中，在恒温振荡培养箱 30℃、200r/min、发酵周期5d的条件下连续传代培养5代，并测定其在传代培养过程中各代的CMC酶活，从而确定所得菌株产酶能力及遗传稳定性，如图3所示。结果表明，经过连续传代培养5代，发现其具有良好的遗传稳定性，说明经UV、ARTP诱变能够提高菌株产纤维素酶能力，得到的突变菌株有较强产酶能力和良好的遗传稳定性。
Claims (4)
1.一种产纤维素酶木霉菌株的复合诱变育种方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将所述的木霉菌株制备成孢子悬液后涂布于刚果红培养基上，在紫外线下辐照；
(2)选取步骤(1)获得的正突变菌株进行发酵，从中选取出酶活最高者；
(3)将步骤(2)获得的菌株经斜面培养后制成孢子悬液，用等离子体诱变育种进行诱变；
(4)将经过步骤(3)获得的正突变菌株以酶活为依据，筛选出高产纤维素酶的菌株。
2.根据权利要求1所述的复合诱变育种方法，其特征在于，所述紫外线辐照的条件是紫外线功率为15W，辐照距离为25cm，辐照时间4min。
3.根据权利要求1所述的复合诱变育种方法，其特征在于，所述离子体诱变时间为400s。
4.根据权利要求1所述的复合诱变育种方法，其特征在于，所述的木霉菌株制备成孢子悬液按以下方法制备：
转接出木霉菌株，30℃PDA斜面培养菌株5-7d产孢子，用1％Tween80洗下墨绿色孢子，在振荡器上以1200r/min振荡5min，经脱脂棉过滤制成孢子悬液，采用血球计数板将孢子浓度控制在107个/mL。
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