CN107475129A

CN107475129A - 一株高产内切β‑1,4‑葡聚糖酶的绿色木霉及其应用

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Publication number: CN107475129A
Application number: CN201710839713.0A
Authority: CN
Inventors: 郭庆文; 王兴吉; 佟新伟; 郭庆亮; 贾仁洁
Original assignee: Shandong Lonct Enzymes Co ltd
Current assignee: Shandong Lonct Enzymes Co ltd
Priority date: 2017-09-18
Filing date: 2017-09-18
Publication date: 2017-12-15
Anticipated expiration: 2037-09-18
Also published as: CN107475129B

Abstract

本发明属于生物工程技术领域，特别涉及一株高产内切β‑1,4‑葡聚糖酶的绿色木霉突变菌株及其液体发酵产酶方法。所述绿色木霉菌株具体为绿色木霉(Trichoderma viride)GG‑242，保藏编号为CGMCC No.14135。以该菌株作为生产菌株发酵生产β‑1,4‑葡聚糖酶的发酵液酶活达到3400mL‑3800U/mL；该突变菌株发酵得到的内切β‑1,4‑葡聚糖酶最适pH范围4.5‑5.5，最适作用温度范围是45℃‑55℃，60℃保温4d后剩余酶活为74.6％，具体良好的耐酸性和耐热性，可广泛应用于纺织领域，对针织面料、梭织面料和牛仔面料的处理效果显著，还能缩短工时，降低生产成本。

Description

一株高产内切β-1,4-葡聚糖酶的绿色木霉及其应用

技术领域：

本发明属于生物工程技术领域，特别涉及一株高产内切β-1,4-葡聚糖酶(EG，EC3.2.1.39)的绿色木霉突变菌株及其液体发酵产酶方法。

背景技术：

纤维素是由β-1,4-糖苷键连接而成的D-吡喃式葡萄糖聚合物，是地球上最丰富且可再生的资源。据估计，地球上每年光合作用产生1.5×10¹¹亿吨纤维素。多数情况下，要高值化利用纤维素首先必须通过纤维素酶对其进行有效降解。纤维素酶是一类能够将纤维素降解为葡萄糖的多组分酶系的总称，纤维素酶可被分为三个亚类的酶：1,4-β-D-葡聚糖水解酶(“内切葡聚糖酶”或“EG”)；1,4-β-D-葡聚糖纤维二糖水解酶(“外切葡聚糖酶”、“纤维二糖水解酶”或“CBH”)；和β-葡糖苷酶(“β-D-葡糖苷-葡糖苷水解酶”、“纤维二糖酶”或“BG”)。这些酶共同作用以催化含纤维素的底物的水解。内切葡聚糖酶随机地攻击内部部分并主要攻击纤维素的无定形区域，主要产生较短的纤维素链。外切葡聚糖酶通过结合葡聚糖末端并从纤维素聚合物的末端主要释放纤维二糖(水溶性β-1,4-连接的葡萄糖二聚体)而逐渐缩短葡聚糖分子。β-葡糖苷酶将纤维二糖分裂为两个单位的葡萄糖。

产生纤维素酶的微生物存在若干类型，包括真菌、放线菌和细菌。来自丝状真菌木霉(Trichoderma sp.)、青霉(Penicillium sp.)、毁丝霉(Myceliophthora sp.)和金孢(Chrysosporium sp.)等菌株的纤维素酶在水解纤维素中是尤其多产的，并且来源于这些菌株的纤维素酶先前已用来水解纤维素。

如专利号为ZL2013107166785的中国发明专利《纤维素酶及其制备》公布了一种纤维素酶及其制备方法，该酶由一株保藏编号为CCTCC M2013540的里氏木霉(Trichodermareesei)菌株发酵生产，所述菌株产纤维素酶的最适pH3.0-6.0，最适温度为23～35℃。所述菌株的种子液接种于发酵培养基中，25℃培养104小时，发酵液纤维素酶的外切β-葡聚糖酶、内切β-葡聚糖酶、β-葡萄糖苷酶和滤纸酶活力分别达到680U/mL、1389U/mL、486U/mL和792U/mL。

如申请号为201310571925.7的中国发明专利申请《一株高产纤维素酶的黑曲霉》公开了一株高产纤维素酶的黑曲霉，保藏编号为CGMCC No.7927。所述黑曲霉菌发酵96小时后纤维素酶的外切β-葡聚糖酶、内切β-葡聚糖酶、β-葡萄糖苷酶和滤纸酶活力分别达到620U/mL、1289U/mL、456U/mL和732U/mL。

然而，这些酶的生产成本和在某些工业条件下的水解效率低下，因此目前现有技术中EG难以满足工业生产的需求。

发明内容：

为了解决上述技术问题，本发明选育出一株高产内切β-1,4-葡聚糖酶的绿色木霉菌株，其发酵产品具有良好的耐酸性和耐热性，生产成本低廉，对大规模推进各行业的机械化具有重大意义。

所述的高产内切β-1,4-葡聚糖酶的绿色木霉菌株具体为绿色木霉(Trichodermaviride)GG-242，该菌株已于2017年7月13日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮编100101，保藏编号为CGMCC No.14135。

所述菌株是由一株绿色木霉经室温常压等离子体诱变选育获得，所得木霉GG-242菌株形态特征如下：菌落初呈白色绒状，后期出现轮状的菌丝密实产孢区，颜色为绿色至深绿色；分生孢子梗呈环状排列，缢缩，中部较宽，从中部以上变窄形成长颈。

原始菌株在发酵过程中孢子量多，菌丝结球，发酵液较为粘稠不利于传质，经诱变后的木霉GG-242孢子产量减少，菌丝不宜结球，种子罐培养周期由56h缩短至48h。发酵方法经过优化后，木霉突变菌株发酵液平均酶活达到3400U/mL-3800U/mL。

本发明还提供一种液体发酵制备内切β-1,4-葡聚糖酶的方法，具体如下：

发酵罐培养：将种子液按照接种量5-10％的比例接入发酵罐，培养条件为初始pH4.5-5.5、34-36℃、转速200-800rpm、风量0-24h 0.25-0.3vvm、24-48h 0.5-0.8vvm、48h-放罐0.9-1.0vvm，发酵期间pH低于4.5时，通过补料控制pH4.5-5.5，至酶活增长缓慢，菌体自溶严重时结束发酵，发酵周期为140-150h；

作为对上述实施方案的改进，种子液培养方法如下：将摇瓶培养的种子液按照接种量1.5％的比例接入种子罐培养基，在初始pH4.5-5.5、34-36℃、转速200-800rpm条件下培养48-50h；

作为对上述实施方案的改进，摇瓶培养方法如下：将斜面培养得到的菌株取一接种环菌苔接入摇瓶种子培养基中，在初始pH4.5-5.5、34-36℃、摇床转速200-250rpm条件下培养72-80h；

作为对上述实施方案的改进，斜面培养方法如下：将所述木霉突变株取一接种环菌苔接种于CMA平板，34-36℃下恒温培养72h；

作为对上述实施方案的改进，发酵罐发酵结束后，所述内切β-1,4-葡聚糖酶的提取与精制方法如下：

向发酵液中加入3-5％珍珠岩助滤剂，进行板框压滤；将压滤液中加入1-2％硅藻土助滤剂进行精滤；用20000分子量的超滤膜对精滤液进行超滤浓缩；在浓缩液中加入稳定剂(2％氯化钠)、防腐剂(3‰苯甲酸钠，1.5‰山梨酸钾)，然后用无菌膜进行过滤除菌，即得到内切β-1,4-葡聚糖酶成品酶制剂。

所得内切β-1,4-葡聚糖酶最适pH范围4.5-5.5，最适作用温度范围是45℃-55℃，60℃保温4d后剩余酶活为74.6％，具体良好的耐酸性和耐热性。

有益效果：

1、本发明通过对绿色木霉原始菌株进行常温常压等离子体诱变选育了一株高产内切β-1,4-葡聚糖酶的突变菌株GG-242，以该菌株作为生产菌株发酵生产β-1,4-葡聚糖酶的发酵液酶活达到3400mL-3800U/mL。

2、该突变菌株发酵得到的内切β-1,4-葡聚糖酶最适pH范围4.5-5.5，最适作用温度范围是45℃-55℃，60℃保温4d后剩余酶活为74.6％，具体良好的耐酸性和耐热性，可广泛应用于纺织领域，对针织面料、梭织面料和牛仔面料的处理效果显著，还能缩短工时，降低生产成本。

附图说明：

图1不同pH下的相对酶活；

图2不同温度下的相对酶活；

图3 60℃下保温4d后的相对酶活。

具体实施方式：

以下通过具体实施例对本发明做更详细的说明，具体实施案例仅为举例说明，不作为对本发明实施范围的限定。

本发明所用培养基如下：

(1)CMA斜面培养基质量体积比组成为：葡萄糖1.5％，麦芽浸出物2.0％，蛋白胨0.15％，琼脂1.5％，加入ddH₂O至终体积1000mL，高压蒸气121-123℃灭菌35min；

(2)种子摇瓶培养基质量体积比组成为：葡萄糖2.0％，麦芽浸出物2.0％，蛋白胨0.1％，微晶纤维素0.75％，加入ddH₂O至终体积1000mL，调节pH至4.5，121℃灭菌20min，备用；

(3)种子罐培养基质量体积比组成为：葡萄糖2％，酵母粉1.5％，KH₂PO₄0.15％，CaCl₂ 0.005％，1mL微量元素，调节pH至4.5，121-123℃灭菌30-35min；

(4)发酵罐培养基质量体积比组成为：玉米淀粉4％，玉米粉4％，豆饼粉4％，硫酸铵1％，微晶纤维素1.5％，KH₂PO₄ 0.3％，玉米浆0.6％，CaCl₂ 0.5％，1.5mL微量元素，调节pH至4.5，121-123℃灭菌30-35min；

(5)补料瓶培养基质量体积比为：玉米淀粉10％，微晶纤维素1.5％，硫酸铵1％，KH₂PO₄ 0.1％，玉米浆0.6％，CaCl₂ 0.5％，调节pH至4.5，121-123℃灭菌30-35min；

(6)微量元素：1g FeSO₄·7H₂O，8.8g ZnSO₄·7H₂O，0.4gCuSO₄·5H₂O，0.15gMnSO₄·4H₂O，0.1gNa₂B₄O₇·10H₂O,50mg(NH₄)₆Mo₇O₂₄·4H₂O，0.2mL浓HCl，完全溶解后用ddH₂O定容至1L，用0.22μm的微孔滤膜过滤除菌。

实施例1 菌株的诱变选育

取一株出发菌株的新鲜斜面，用无菌水洗脱菌体，在有玻璃珠的试管振荡使菌体分散，离心收集菌体，以5％甘油重悬菌体，以血球计数板计数直至菌浓为10⁷-10⁸个/mL，以此作为出发菌悬液。

开启常温常压等离子系统，以酒精棉擦拭操作室内外，并开启紫外灯灭菌30min。灭菌结束后取10μL菌悬液点于载片的粗糙面，并在无菌条件下将载片以镊子转移至操作室台面上。开启氦气阀门，设定气流量和诱变时间进行诱变。诱变时间分别设定为90s、120s、150s、180s、210s。每次诱变结束后均将载片置于含990μL无菌生理盐水的EP管中，漩涡震荡1min。稀释涂布后置于34℃培养箱内培养。

初筛培养基(质量体积比)：(NH₄)₂SO₄ 0.2％，MgSO₄ 0.05％，K₂HPO₄ 0.1％，NaCl0.05％，羧甲基纤维素钠1％，刚果红0.04％，琼脂粉1.6％，水1000ml，pH自然。

初筛方法：将对照菌株和诱变菌株稀释至适当倍数，取0.1ml涂布于初筛培养基平板上，34℃培养5天，测量各菌株的水解圈直径和菌落直径(H/C)，同时将单菌接入滤纸条培养基，34℃静置培养，定期目测滤纸条溃烂情况，选择水解圈直径与菌落直径比值比对照菌株大及滤纸溃烂显著的菌株进行摇瓶复筛。

滤纸条培养基：马铃薯20％，蔗糖2％，水1000ml，pH自然。

诱变菌株的复筛：将初筛筛选到的诱变菌株和对照菌株转接到斜面培养基上，34℃培养7-10天，用培养好的斜面制备孢子悬液，将孢子悬液的浓度调节为10⁶个/ml，然后分别取5ml接种到摇瓶发酵产酶培养基中，34℃，240rpm培养6天，测定酶活力。

斜面培养基：马铃薯20％，蔗糖2％，水1000ml，pH自然。

摇瓶发酵产酶培养基：葡萄糖2.0％，麦芽浸出物2.0％，蛋白胨0.1％，微晶纤维素0.75％，加入ddH₂O至终体积1000mL，调节pH至4.5，121℃灭菌20min。

通过复筛选出5株具有较高酶活的突变株列表1如下：

表1.具有较高酶活的5株菌株酶活检测结果

菌株	原始菌株	GG-102	GG-145	GG-214	GG-242	GG-292
							酶活(U/mL)	1546	1754	1687	1648	1850	1794

经再次的摇瓶发酵后选育出GG-242为稳定的最高酶活菌株。

实施例2 液体发酵产内切β-1,4-葡聚糖酶及其提取精制

斜面培养：将所述绿色木霉突变株GG-242取一接种环菌苔接种于CMA斜面，34℃下恒温培养72h；

摇瓶培养：将斜面培养得到的菌株取一接种环菌苔接入种子摇瓶培养基中，在初始pH5.0、34℃、摇床转速200rpm条件下培养72h。

种子罐培养：将摇瓶发酵后的种子液按照接种量5％的比例接入种子罐培养基，在初始pH5.0、34℃、转速400rpm条件下培养48h。

发酵罐培养：将种子罐中的种子液按照接种量5％的比例接入发酵罐培养基，培养条件为初始pH 5.0、34℃、风量0-24h 0.25vvm、24-48h 0.5vvm、48-放罐1.0vvm、转速400rpm，发酵期间pH低于4.5时补氨控制pH4.5-5.5，至酶活增长缓慢，菌体自溶严重时结束发酵，发酵周期为140h。下表是30L发酵罐6批次的发酵产酶情况，平均产酶水平为3623.3U/mL。

表2.菌株GG-242在30L发酵罐6批次的发酵产酶

发酵批次	发酵周期(h)	发酵液酶活(U/mL)
			EG-1	140	3647
EG-2	140	3482
			EG-3	140	3841
EG-4	140	3541
			EG-5	140	3445
EG-6	140	3784

内切β-1,4-葡聚糖酶的提取与精制：

向上述发酵液中加入3％(v/w)珍珠岩助滤剂，进行板框压滤；将压滤液中加入1％(v/w)硅藻土助滤剂进行精滤；用20000分子量的超滤膜对精滤液进行超滤浓缩；在浓缩液中加入稳定剂(2％氯化钠)、防腐剂(3‰苯甲酸钠，1.5‰山梨酸钾)，然后用无菌膜进行过滤除菌，即得到内切β-1,4-葡聚糖酶成品酶制剂。

实施例3 内切β-1,4-葡聚糖酶的酶活测定方法

(1)酶活测定的方法：CMC法

(2)测定的原理：纤维素酶能将羧甲基纤维素降解成寡糖和单糖。具有还原性末端的寡糖和单糖在沸水浴条件下可以与3,5-二硝基水杨酸(DNS)试剂发生显色反应。反应液颜色的深度与酶解产生的还原糖量成正比，而还原糖的生成量又与反应液中纤维素酶的活力成正比。因此，通过分光比色测定反应液颜色的强度，可以计算反应液中纤维素酶的活力。

(3)测定过程：取三支试管各加入0.5mlCMC底物，与待测酶液一起50℃水浴预热5min。在第一、二试管中各加入0.5ml待测液，并计时，50℃水浴中反应15min。反应完后在三支试管中各加入1.5ml的DNS试剂，并在第三支试管中补加0.5ml的待测酶液。取出并摇匀三支试管后，在沸水浴中反应5min。迅速冷却至室温，用水定容至5.0ml。以第三支试管液为对照在540nm波长条件下测得第一、二试管液的吸光度。根据预先绘制的标准曲线计算出酶活力值。

(4)酶活力计算：

酶活力(IU/ml或IU/g)＝(葡萄糖等量值/180/15/0.5)×n

式中：180—葡萄糖从微克换算成微摩尔

15—待测液与底物的反应时间

0.5—加入反应的待测酶液量

n—酶样的稀释倍数

实施例4 酶的最适作用pH范围

以实施例2所得发酵液浓缩后获得的酶活力为12401U/mL的EG为样品，在50℃条件下，分别在不同pH值(3.0、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、7.0、8.0)下，按照实施例3测定酶活力，测定的相对酶活力变化曲线如图1所示，酶的最适作用pH范围为pH4.5-5.5，最适作用pH为pH5.0。

上述不同pH使用的缓冲液分别为：50mmol/L乙酸-乙酸钠缓冲液pH3.0～5.5，50mmol/L磷酸氢二钾-磷酸二氢钾缓冲液pH6.0～8.0。

实施例5 酶的最适作用温度范围

以实施例2所得发酵液浓缩后获得的酶活力为12401U/mL的EG为样品，在pH值为5.0条件下，分别在不同温度(30、40、45、50、55、60、70℃)下，按照实施例3测定酶活力，测定的相对酶活力变化曲线如图2所示，酶的最适作用温度范围为45℃-55℃，最适温度50℃。

实施例6 酶的热稳定性

以实施例2所得发酵液浓缩后获得的酶活力为12401U/mL的EG为样品，在pH值为5.0条件下，60℃下保温4d，按照实施例3测定剩余酶活力，如图3所示，60℃保温4d后剩余酶活为74.6％，具有良好的耐热保存活性。

Claims

1.一株高产内切β-1,4-葡聚糖酶的绿色木霉菌株，其特征在于，所述绿色木霉菌株具体为绿色木霉(Trichoderma viride)GG-242，保藏编号为CGMCC No.14135。

2.权利要求1所述绿色木霉所产的β-1,4-葡聚糖酶。

3.权利要求2所述β-1,4-葡聚糖酶的生产方法，其特征在于，发酵培养具体如下：将种子液按照接种量5-10％的比例接入发酵罐，培养条件为初始pH 4.5-5.5、34-36℃、风量0-24h 0.25-0.3vvm、24-48h 0.5-0.8vvm、48h-放罐0.9-1.0vvm、转速200-800rpm，发酵期间pH低于4.5时，通过补料控制pH4.5-5.5，至酶活增长缓慢，菌体自溶严重时结束发酵，发酵周期为140-150h。

4.如权利要求3所述的β-1,4-葡聚糖酶的生产方法，其特征在于，

种子液培养方法如下：将摇瓶培养的种子液按照接种量1.5％的比例接入种子罐培养基，在初始pH4.5-5.5、34-36℃、转速200-800rpm条件下培养48-50h；

摇瓶培养方法如下：将斜面培养得到的菌株取一接种环菌苔接入摇瓶种子培养基中，在初始pH4.5-5.5、34-36℃、摇床转速200-250rpm条件下培养72-80h；

斜面培养方法如下：将所述木霉突变株取一接种环菌苔接种于CMA平板，34-36℃下恒温培养72h。

5.如权利要求3所述的β-1,4-葡聚糖酶的生产方法，其特征在于，发酵完成后，内切β-1,4-葡聚糖酶的提取与精制方法如下：

向发酵液中加入3-5％珍珠岩助滤剂，进行板框压滤；将压滤液中加入1-2％硅藻土助滤剂进行精滤；用20000分子量的超滤膜对精滤液进行超滤浓缩；在浓缩液中加入稳定剂、防腐剂，然后用无菌膜进行过滤除菌，即得到内切β-1,4-葡聚糖酶成品酶制剂。

6.如权利要求5所述的β-1,4-葡聚糖酶的生产方法，其特征在于，所述稳定剂为2％氯化钠、所述防腐剂为3‰苯甲酸钠和1.5‰山梨酸钾。

7.权利要求1所述高产内切β-1,4-葡聚糖酶的绿色木霉菌株的应用。

8.权利要求2所述内切β-1,4-葡聚糖酶的应用。