CN107488601B - 一株高产耐糖耐酸β-葡萄糖苷酶的菌株及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种耐高糖浓度的β‑葡萄糖苷酶的高产黑曲霉突变菌株及其应用。所述米曲霉菌种保藏编号为CGMCC No.14139，通过Co⁶⁰诱变获得，所产耐高糖浓度的β‑葡萄糖苷酶平均摇瓶发酵活力在523U/mL以上；该β‑葡萄糖苷酶最适反应pH范围为4.4‑5.4，在pH3.5‑7.5范围内较稳定；热稳定性良好，最适反应温度范围45‑65℃，在75℃保温1h仍具有75％活力；且具有较好的葡萄糖耐受性。在纤维素降解、风味剂等应用中效果良好，可广泛用于食品、医药、化工等行业。

Description

一株高产耐糖耐酸β-葡萄糖苷酶的菌株及其应用

技术领域：

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一株高产耐糖耐酸β-葡萄糖苷酶的黑曲霉突变菌株及其应用。

背景技术：

β-葡萄糖苷酶，又称β-D-葡萄糖苷葡萄糖水解酶，别名龙胆二糖酶、纤维二糖酶和苦杏仁苷酶。β-葡萄糖苷酶存在于自然界许多植物、昆虫、酵母、曲霉、木霉及细菌体内。它属于纤维素酶类，是纤维素分解酶系中的重要组成成分，一般认为纤维素类物质经酶促作用成葡萄糖至少需要3种酶：内切1,4-葡聚糖酶、外切纤维二糖水解酶和β-葡萄糖苷酶。内切葡聚糖酶和外切纤维二糖水解酶把纤维素降解成纤维二糖，它再被β-葡萄糖苷酶分解成葡萄糖。在这个过程中β-葡萄糖苷酶起作关键作用，而在纤维素酶组分中β-葡萄糖苷酶含量少、活力低，成为纤维素酶解的瓶颈。此外，黑曲霉来源的β-葡萄糖苷酶对葡萄糖的耐受系数低，因而随着体系中葡萄糖浓度的升高，其降解纤维二糖的活力将受到极大的抑制，从而影响纤维素的连续酶解速率及效果。

β-葡萄糖苷酶在食物中可以与阿拉伯糖苷酶等风味酶协同作用于风味前体物—β-糖苷，促进挥发性糖苷配基的释放，起到增香作用。目前β-葡萄糖苷酶作为风味剂广泛应用于茶叶、果汁和果酒中增香，β-葡萄糖苷酶还经常作为青梅、柑橘、橄榄中的去苦剂，除去苦味。β-葡萄糖苷酶应用于生产低聚龙胆糖，低聚龙胆糖比麦芽糖浆具有更高的吸水性和较低的粘度，可预防食品中的淀粉老化和保持食品中的水分，具有增味作用和显著的保健功能。β-葡萄糖苷酶还能使大豆异黄酮苷等生物苷类物质脱去糖基，变成分子量较小的高生物活性苷元，进而提高生物利用率。β-葡萄糖苷酶与纤维素内切酶、纤维素外切酶基因转入酵母菌中进行同步糖化发酵制造生物酒精，可以使还原出来的糖被酵母利用生成乙醇，解除了产物对酶的抑制作用。β-葡萄糖苷酶的酶活高低是以茜草科植物栀子为原料生产天然色素栀子蓝的技术关键。植物中β-葡萄糖苷酶能分解植物中丰富的葡萄糖苷，释放有毒的苷配基部分，是植物体中防御食植动物和害虫的主要化学物质。医学中β-葡萄糖苷酶的应用在某些癌症的诊断、治疗中也发挥着重要作用，并获得了许多成功。日用化工业中，利用β-葡萄糖苷酶的转糖苷作用，可以生产非离子表面活性剂烷基糖苷。另外，根据β-葡萄糖苷酶的半乳糖酶活力还可将其应用于乳品工业来分解乳糖，与其它酶协同作用生产葡萄糖与单细胞蛋白。

目前，在国外β-葡萄糖苷酶已经有大规模工业化生产，发酵酶活力一般在1000U/mL左右，几乎垄断了整个市场。黑曲霉所产高活性的β-葡萄糖苷酶因其安全性在食品、医药等领域中有很好的发展前景。β-葡萄糖苷酶应用广泛，但由于国内一直未形成产业化，价格高昂，限制了大规模应用，因此低成本高耐受性的β-葡萄糖苷酶一旦上市，将会有巨大的市场潜力。

发明内容：

为了解决上述技术问题，本发明将提供一株高产耐糖耐酸β-葡萄糖苷酶黑曲霉突变菌株。

所述黑曲霉具体为黑曲霉(Aspergillus niger)AN-4，该菌株已于2017年7月13日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101，保藏编号为CGMCC No.14139。

所述黑曲霉AN-4是通过Co⁶⁰辐射诱变的方式获得的高产β-葡萄糖苷酶的菌株，液体摇瓶发酵产β-葡萄糖苷酶活力达到523U/mL。

所述黑曲霉AN-4液体摇瓶发酵产β-葡萄糖苷酶的方法具体如下：

将菌种活化后，按3％接种量转接至发酵培养基，30℃，200r/min培养2-4d，发酵液离心收集上清液，即得到β-葡萄糖苷酶粗酶液；

发酵培养基组成如下(质量体积比)：葡萄糖0.4-0.7％，纤维糖粉2-3％，玉米浆1-2％，(NH₄)₂SO₄ 0.1-0.3％，KH₂PO₄ 0.2-0.35％，Na₂HPO₄ 0.1-0.3％，MgSO₄·7H₂O 0.01-0.05％，pH4.6。

所述黑曲霉AN-4所产β-葡萄糖苷酶具有一定葡萄糖耐受性，酶活测定体系中加0-18％质量浓度葡萄糖，在葡萄糖浓度低于13％范围内可增强酶活，最高增强0-10％，在14％的葡萄糖浓度下，酶活仍存留95％左右。

所述黑曲霉AN-4所产β-葡萄糖苷酶对酸具有一定耐受性，最适反应pH范围为4.4-5.4，在pH3.5-7.5范围内较稳定，热稳定性良好，最适反应温度范围45-65℃，在75℃保温1h仍具有75％活力。

有益效果：

本发明通过对原始菌株进行Co⁶⁰诱变筛选获得高产β-葡萄糖苷酶菌株AN-4，其摇瓶发酵产β-葡萄糖苷酶活力得到显著提高，达到523U/mL；所产酶酶对酸具有良好的耐受性，最适反应pH范围为4.4-5.4；热稳定性良好，在75℃保温1h仍具有75％活力；且该酶葡萄糖耐受性良好，在14％的葡萄糖浓度下，酶活仍存留95％左右。该菌株可以广泛用于β-葡萄糖苷酶的生产，有利于降低成本，实现β-葡萄糖苷酶的大规模生产和使用。

附图说明：

图1不同葡萄糖浓度下相对酶活变化曲线；

图2不同反应温度下相对酶活变化曲线；

图3不同反应pH下相对酶活变化曲线；

图4酶的热稳定性相对酶活曲线；

图5酶的pH稳定性相对酶活曲线。

具体实施方式：

通过具体实施例对本发明作出更详尽的说明，仅作为举例说明，而不作为对本发明实施范围的限定。对于本领域技术人员，在本发明原理基础上还可做出的改进，这些改进也应视为本发明保护的范围。

实施例1Co⁶⁰诱变与菌株筛选

孢子悬液的制备：取无菌生理盐水洗下原始菌株新鲜斜面上的孢子，将其转移入盛有玻璃珠的三角瓶，在摇床上振荡打散60min，制成菌悬液，并进行梯度稀释，于血球计数板计数并调整孢子浓度为10⁶个/mL左右。

Co⁶⁰射线诱变：将装有适量孢子悬液的试管置于一定剂量率的辐射平面上，用Co⁶⁰射线进行辐射诱变，照射剂量分别为0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0kGy，处理后进行梯度稀释，涂布于PDA培养基平板上，30℃培养。

诱变剂量确定：将诱变处理和未诱变处理的菌悬液做10倍系列稀释，吸取1mL稀释液涂布在平板培养基上，每个稀释梯度做三次平行实验。30℃下倒置培养3-5d，选取菌落总数在30-300之间的培养皿进行菌落总数计数，计算致死率。

致死率＝(对照平板上的菌落数-处理后平板上的菌落数)/对照平板上的菌数×100％。计算得到诱变菌株致死率如表1，通常，致死率在70％～80％时，正向突变的突变株较多。因此在初筛时挑选2.0kGy照射下的菌落。

表1Co⁶⁰射线照射致死率

诱变剂量/kGy	0	0.5	1.0	1.5	2.0	2.5	3.0	3.5	4.0
										致死率/％	0	15.8	21.2	54.3	79.1	85.6	99.2	99.8	100

初筛：Co⁶⁰射线辐照诱变处理的菌悬液涂布于初筛培养基平板(加0.1％p-NPG)上，30℃下倒置培养3-5d，p-NPG被酶解后会产生对硝基苯酚(p-NP)，喷洒1mol/L的Na₂CO₃后显淡黄色，挑选得到5株黄色较深的菌落，分别命名为AN-1，AN-2，AN-3，AN-4，AN-5。

复筛：挑取活化后的出发菌株AN和AN-1，AN-2，AN-3，AN-4，AN-5接入30mL摇瓶复筛培养基中，30℃，200r/min培养48h，3％接种量转接至30mL摇瓶发酵培养基，30℃，200r/min培养2-4d，设置三个平行样。发酵液离心收集上清液，即得到β-葡萄糖苷酶粗酶液，测定粗酶液β-葡萄糖苷酶酶活力，具体结果如表2，其中AN-4发酵酶活力最高，为523U/mL。

表2出发菌株和诱变菌株摇瓶发酵酶活力

菌株	酶活力(U/mL)
		AN	51.5
AN-1	328
		AN-2	249
AN-3	285
		AN-4	523
AN-5	306

初筛培养基：葡萄糖0.3％，纤维糖粉0.5％，蛋白胨0.08％，KH₂PO₄ 0.2％，MgSO₄·7H₂O0.02％，FeSO₄·7H₂O 0.001％，脱氧胆酸钠0.1％，琼脂0.15％，冷却后加入0.1％p-NPG，pH自然。

摇瓶复筛培养基：葡萄糖0.5％，纤维糖粉2％，玉米浆1％，Na₂HPO₄ 0.2％，pH自然。

摇瓶发酵培养基：葡萄糖0.4-0.7％，纤维糖粉2-3％，玉米浆1-2％，(NH₄)₂SO₄0.1-0.3％，KH₂PO₄ 0.2-0.35％，Na₂HPO₄ 0.1-0.3％，MgSO₄·7H₂O 0.01-0.05％，pH4.6。

菌株AN-4低产孢子，高产β-葡萄糖苷酶，摇瓶平均发酵活力在523U/mL以上。

实施例2β-葡萄糖苷酶酶活测定

酶活定义：每分钟释放出1μmol p-NP所需的酶量为一个酶活力单位U。

测定方法：发酵液3000r/min离心10min，得上清液为粗酶液，准确吸取0.1mL粗酶液，加入0.9mL pH4.8的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液，50℃恒温水浴锅预热5min，加入1mL预热的5mmol/L的p-NPG，秒表计时50℃反应10min，立即加入1mL 1mol/L的碳酸钠溶液终止反应。在420nm下测定吸光值。

实施例3β-葡萄糖苷酶的葡萄糖耐受性

以实施例1所得AN-4发酵液上清液为样品，在反应体系中分别添加0-18％的葡萄糖，根据实施例2所述方法的定β-葡萄糖苷酶活力，得到相对酶活变化曲线如图1，在葡萄糖浓度低于13％范围内对酶活有增强作用，可使酶活增强0-10％，在14％的葡萄糖浓度下，酶活依然保留95％左右，说明AN-1所产β-葡萄糖苷酶具有较高的葡萄糖耐受性。

实施例4β-葡萄糖苷酶的最适作用温度范围

以实施例1所得AN-4发酵液上清液为样品，以测得的β-葡萄糖苷酶最高酶活为基准，在pH4.8的缓冲液中，反应温度范围设定为30-90℃，梯度为5℃，共计13个温度点，测定的相对酶活变化结果如图2所示，该β-葡萄糖苷酶最适反应温度范围为45-65℃，最适反应温度50℃。

实施例5β-葡萄糖苷酶的最适作用pH范围

以实施例1所得AN-4发酵液上清液为样品，以测得的β-葡萄糖苷酶最高酶活为基准，在50℃条件下，分别在pH 3.0-8.0的缓冲液中反应，测定不同pH条件下的酶活力。由图3可知，该β-葡萄糖苷酶的最适反应pH范围为4.4-5.4，最适反应pH4.6。

实施例6β-葡萄糖苷酶的热稳定性

以实施例1所得AN-4发酵液上清液为样品，以不作处理的β-葡萄糖苷酶酶活为基准，在pH4.8缓冲液条件下，样品分别在40℃-90℃下保温处理1h，梯度为5℃，测剩余酶活，从图4中可以看出，75℃时，该酶相对活性剩余75％左右，说明该β-葡萄糖苷酶在75℃仍具有良好的稳定性。

实施例7β-葡萄糖苷酶的pH稳定性

以实施例1所得AN-4发酵液上清液为样品，在50℃条件下，分别在pH 2.0-9.0的缓冲液中处理1h，测定酶活力。由图5相对酶活变化曲线可知，该β-葡萄糖苷酶的在pH为3.5-7.5条件下较稳定。

Claims (3)

1.一种黑曲霉突变菌株，其特征在于，所述黑曲霉具体为为黑曲霉(Aspergillusniger)AN-4，保藏编号CGMCC No.14139。

2.权利要求1所述黑曲霉在生产β-葡萄糖苷酶中的应用。

3.权利要求2所述黑曲霉的应用，其特征在于，所述黑曲霉AN-4用于液体摇瓶发酵产β-葡萄糖苷酶的方法具体如下：

将菌种活化后，按3％接种量转接至发酵培养基，30℃，200r/min培养2-4d，发酵液离心收集上清液，即得到β-葡萄糖苷酶粗酶液；

发酵培养基组成如下：葡萄糖0.4-0.7％，纤维糖粉2-3％，玉米浆1-2％，(NH₄)₂SO₄0.1-0.3％，KH₂PO₄ 0.2-0.35％，Na₂HPO₄ 0.1-0.3％，MgSO₄·7H₂O 0.01-0.05％，pH4.6。

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