CN109182206B - 一株高产复合酶的枯草芽孢杆菌及其应用 - Google Patents

一株高产复合酶的枯草芽孢杆菌及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN109182206B
CN109182206B CN201811176123.5A CN201811176123A CN109182206B CN 109182206 B CN109182206 B CN 109182206B CN 201811176123 A CN201811176123 A CN 201811176123A CN 109182206 B CN109182206 B CN 109182206B
Authority
CN
China
Prior art keywords
bacillus subtilis
cellulase
protease
amylase
solution
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201811176123.5A
Other languages
English (en)
Other versions
CN109182206A (zh
Inventor
刘占英
崔金娜
刘艳新
张永锋
李永丽
胡建华
刘建国
石雅丽
朱明达
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Inner Mongolia University of Technology
Original Assignee
Inner Mongolia University of Technology
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Inner Mongolia University of Technology filed Critical Inner Mongolia University of Technology
Priority to CN201811176123.5A priority Critical patent/CN109182206B/zh
Publication of CN109182206A publication Critical patent/CN109182206A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN109182206B publication Critical patent/CN109182206B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/07—Bacillus
    • C12R2001/125—Bacillus subtilis ; Hay bacillus; Grass bacillus
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C12N1/205—Bacterial isolates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12N9/2405—Glucanases
    • C12N9/2408—Glucanases acting on alpha -1,4-glucosidic bonds
    • C12N9/2411—Amylases
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12N9/2405—Glucanases
    • C12N9/2434—Glucanases acting on beta-1,4-glucosidic bonds
    • C12N9/2437—Cellulases (3.2.1.4; 3.2.1.74; 3.2.1.91; 3.2.1.150)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/52—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from bacteria or Archaea
    • C12N9/54—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from bacteria or Archaea bacteria being Bacillus
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/01004—Cellulase (3.2.1.4), i.e. endo-1,4-beta-glucanase

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)

Abstract

本发明公开了一株高产复合酶的枯草芽孢杆菌及其应用。本发明提供的枯草芽孢杆菌KC180，保藏编号为CCTCC NO：M 2018492。本发明还保护枯草芽孢杆菌KC180在生产淀粉酶、蛋白酶和纤维素酶中的应用。本发明提供的枯草芽孢杆菌KC180，可用于生产多种酶(淀粉酶、蛋白酶和纤维素酶)，且在较高温度(50℃)下具有最高产量，对于多种酶制剂以及复合酶制剂的制备具有重大的应用推广价值。

Description

一株高产复合酶的枯草芽孢杆菌及其应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一株高产复合酶的枯草芽孢杆菌及其应用。
背景技术
淀粉酶是水解淀粉和糖原的酶类总称，用作果汁加工中的淀粉分解和提高过滤速度以及蔬菜加工、糖浆制造、葡萄糖等加工制造。蛋白酶是水解蛋白质肽链的一类酶的总称，是最重要的一种工业酶制剂，能催化蛋白质和多肽水解，在干酪生产、肉类嫩化和植物蛋白改性中都大量的使用蛋白酶。纤维素酶(β-1,4-葡聚糖-4-葡聚糖水解酶)是降解纤维素生成葡萄糖的一组酶的总称，在食品行业和环境行业均有广泛应用。
重离子是一种比质子重的带电粒子，可以直接引起电离，通常包含带电的氦、碳及氖离子等。重离子产生诱变的主要特征是能量沉积、动量传递和遗传物质的质子转移和重排。与传统的诱变源相比，重离子束具有以下特点：(1)传能线密度大，能在生物介质中产生高密度的电离、激发、能量和质量沉积，造成生物介质的损伤，因而突变率高；(2)能量沉积过程中，在其射程末端存在一个尖锐的能量损失峰，即Bragg 峰，使得生物样品的局部受损，这种局部受损的位置可随离子能量的高低而变化，是选择可控的，因此可以通过调控离子能量进行定点和定位诱变，故而突变谱广；(3) 损伤后修复效应小，可产生大量的突变且突变体稳定；(4)相对生物学效应高。与X 射线、γ射线相比，重离子束具有更高的生物学效应，重离子诱变突变率高、突变谱广，不易回复突变。
发明内容
本发明的目的是提供一株高产复合酶的枯草芽孢杆菌及其应用。
本发明提供的枯草芽孢杆菌KC180，全称为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)KC180，已于2018年7月25日保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC，地址为：中国，武汉，武汉大学)，保藏编号为CCTCC NO：M 2018492。
本发明还保护枯草芽孢杆菌KC180在生产淀粉酶中的应用。
本发明还保护枯草芽孢杆菌KC180在生产蛋白酶中的应用。
本发明还保护枯草芽孢杆菌KC180在生产纤维素酶中的应用。
本发明还保护枯草芽孢杆菌KC180在生产内切葡萄糖苷酶中的应用。
本发明还保护枯草芽孢杆菌KC180在生产淀粉酶、蛋白酶和纤维素酶中的应用。
本发明还保护一种试剂盒，含有枯草芽孢杆菌KC180；
所述试剂盒的功能为如下(a)、(b)、(c)、(d)或(e)：
(a)生产淀粉酶；
(b)生产蛋白酶；
(c)生产纤维素酶；
(d)生产内切葡萄糖苷酶；
(e)生产淀粉酶、蛋白酶和纤维素酶。
本发明还保护枯草芽孢杆菌KC180的发酵上清。
所述发酵上清的制备方法：将枯草芽孢杆菌KC180接种至发酵培养基，30℃-55℃(具体可为45℃-55℃，更具体可为50℃)培养。所述培养的时间可为36小时。枯草芽孢杆菌KC180在发酵培养基中的初始浓度具体可为5×105cfu/mL。
发酵培养基(pH5.5)：无水葡萄糖5g、胰蛋白胨10g、酵母提取粉5g、磷酸二氢钾1g、氯化钠5g、硫酸镁0.5g、硫酸锰5mg、可溶性淀粉5g，用水定容至1000mL。
发酵培养基(pH5.5)：无水葡萄糖5g、胰蛋白胨10g、酵母提取粉5g、磷酸二氢钾1g、氯化钠5g、硫酸镁0.5g、硫酸锰5mg，用水定容至1000mL。
发酵培养基(pH5.5)：无水葡萄糖5g、胰蛋白胨10g、酵母提取粉5g、磷酸二氢钾1g、氯化钠5g、硫酸镁0.5g、硫酸锰5mg、羧甲基纤维素钠5g，用水定容至1000mL。
本发明还保护所述发酵上清的应用，为如下(Ⅰ)、(Ⅱ)、(Ⅲ)、(Ⅳ)或(Ⅴ)：
(Ⅰ)作为淀粉酶；
(Ⅱ)作为蛋白酶；
(Ⅲ)作为纤维素酶；
(Ⅳ)作为内切葡萄糖苷酶；
(Ⅴ)作为复合酶；所述复合酶为淀粉酶、蛋白酶和纤维素酶。
本发明还保护一种试剂盒，含有所述发酵上清；
所述试剂盒的功能为如下(Ⅰ)、(Ⅱ)、(Ⅲ)、(Ⅳ)或(Ⅴ)：
(Ⅰ)作为淀粉酶；
(Ⅱ)作为蛋白酶；
(Ⅲ)作为纤维素酶；
(Ⅳ)作为内切葡萄糖苷酶；
(Ⅴ)作为复合酶；所述复合酶为淀粉酶、蛋白酶和纤维素酶。
本发明提供的枯草芽孢杆菌KC180，可用于生产多种酶(淀粉酶、蛋白酶和纤维素酶)，且在较高温度(50℃)下具有最高产量，对于多种酶制剂以及复合酶制剂的制备具有重大的应用推广价值。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。枯草芽孢杆菌20076，即CICC中编号为20076的菌株。
实施例1、高产复合酶的枯草芽孢杆菌的获得
一、通过重离子诱变获得突变菌株
1、取指数生长期的枯草芽孢杆菌20076，制成浓度为106个/mL的菌悬液。
2、将5mL步骤1制备菌悬液置于辐照皿中，使用重离子加速器提供的12C6+离子束进行辐照。分别设置如下辐照剂量：0Gy、60Gy、80Gy、100Gy、120Gy、140Gy或180Gy。
3、取完成辐照后的菌液，进行涂平板，获得若干纯培养的菌株。
二、对突变菌株中筛选高产复合酶的菌株
1、筛选高产淀粉酶菌株
(1)初筛
将待测菌株点种法点种在淀粉筛选培养基上，37℃培养48h。待在淀粉筛选培养基上长出菌落后将菌落刮离，然后通过滴加卢戈氏碘液观测透明圈。测量平板上透明圈直径(H)与菌落直径(C)，挑选H/C比较大的菌株即为淀粉酶初筛菌株。
淀粉筛选培养基：蛋白胨5g、酵母粉5g、氯化钠5g、硫酸镁0.2g、硫酸锰0.005g、淀粉5g、琼脂15g，用水定容至1000mL。
(2)复筛
通过液体发酵试验进行复筛。
2、筛选高产蛋白酶菌株
(1)初筛
将待测菌株点种法点种在酪素筛选培养基上，37℃培养48h。待在酪素选择培养基上长出菌落后将菌落刮离，然后通过观测透明圈。测量平板上透明圈直径(H)与菌落直径(C)，挑选H/C比较大的菌株即为蛋白酶初筛菌株。
酪素筛选培养基：蛋白胨5g、酵母粉5g、氯化钠5g、硫酸镁0.2g、硫酸锰0.005g、酪素4g、琼脂15g，用水定容至1000mL。
(2)复筛
通过液体发酵试验进行复筛。
3、筛选高产纤维素酶菌株
(1)初筛
将待测菌株点种法点种在羧甲基纤维素钠刚果红筛选培养基上，37℃培养48h。然后通过观测透明圈，测量平板上透明圈直径(H)与菌落直径(C)，挑选H/C比较大的菌株即为纤维素酶初筛菌株。
羧甲基纤维素钠刚果红筛选培养基：酵母粉5g、氯化钠5g、硫酸镁0.2g、硫酸锰0.005g、羧甲基纤维素钠5g、刚果红0.2g、琼脂15g，用水定容至1000mL。
(2)复筛
通过液体发酵试验进行复筛。
在上述步骤1、步骤2和步骤3的基础上，获得一株同时高产淀粉酶、蛋白酶和纤维素酶的菌株，将其命名为枯草芽孢杆菌KC180。
三、菌株的保藏
枯草芽孢杆菌KC180，全称为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)KC180，已于2018年7月25日保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC，地址为：中国，武汉，武汉大学)，保藏编号为CCTCC NO：M 2018492。
实施例2、菌株生产淀粉酶、蛋白酶和纤维素酶的能力
供试菌株为：枯草芽孢杆菌20076或枯草芽孢杆菌KC180。
一、菌株生产淀粉酶的能力
1、将供试菌株接种至发酵培养基(菌株在发酵培养基中的初始浓度为5×105cfu/mL)，180rpm振荡培养36小时。发酵温度分别设置为：30℃、35℃、40℃、45℃、 50℃或55℃。
发酵培养基(pH5.5)：无水葡萄糖5g、胰蛋白胨10g、酵母提取粉5g、磷酸二氢钾1g、氯化钠5g、硫酸镁0.5g、硫酸锰5mg、可溶性淀粉5g，用水定容至1000mL。
2、完成步骤1后，4℃、8000rpm离心15min，收集上清液，即为粗酶液。
3、麦芽糖标准曲线的绘制
采用蒸馏水为溶剂，配置0.1mg/mL-0.7mg/mL的麦芽糖标准溶液。取2mL麦芽糖标准溶液、2mL DNS试剂加到试管中摇匀，沸水浴5min，然后立即冰浴终止反应，加 16mL蒸馏水摇匀，用紫外可见分光光度计于波长为540nm处测吸光度。以吸光度为横坐标，麦芽糖浓度为纵坐标，绘制麦芽糖标准曲线。
4、采用蒸馏水为溶剂，将步骤2得到的粗酶液进行适度稀释，得到待测溶液。
5、取6支试管，每3支一组，一组作为试验组，另一组作对照组。每支对照组试管中加入1mL底物溶液、2mL DNS试剂和1mL待测溶液摇匀，沸水浴5min，然后立即冰浴终止反应，加16mL蒸馏水摇匀，用紫外可见分光光度计于波长为540nm处测吸光度。每支试验组试管中加入1mL底物溶液和1mL待测溶液摇匀，置于50℃水浴锅中反应1h，然后加入2mL DNS试剂并摇匀，沸水浴5min，然后立即冰浴终止反应，加16mL 蒸馏水摇匀，用紫外可见分光光度计于波长为540nm处测吸光度。
底物溶液(pH6.5)：将0.5g可溶性淀粉(天津市红岩化学试剂厂，其产品目录号9005-84-9)溶于pH6.5磷酸缓冲液并定容至100mL。
试验组吸光度-对照组吸光度＝吸光度差值。
根据吸光度差值，对照麦芽糖标准曲线，得到麦芽糖的产量。
根据麦芽糖产量和稀释倍数，计算得到粗酶液的酶活，即每毫升粗酶液每分钟催化可溶性淀粉生成麦芽糖的产量，酶活单位为μg/mL/min。
酶活结果见表1。
表1
枯草芽孢杆菌20076 枯草芽孢杆菌KC180
发酵温度为30℃ 20.111 41.632
发酵温度为35℃ 31.272 69.410
发酵温度为40℃ 25.116 70.561
发酵温度为45℃ 24.365 70.311
发酵温度为50℃ 10.701 76.567
发酵温度为55℃ 10.251 19.560
与枯草芽孢杆菌20076相比，枯草芽孢杆菌KC180的淀粉酶活显著提高，最适温度也由35℃变为50℃。
二、菌株生产蛋白酶的能力
1、将供试菌株接种至发酵培养基(菌株在发酵培养基中的初始浓度为5×105cfu/mL)，37℃、180rpm振荡培养36小时。
发酵培养基(pH5.5)：无水葡萄糖5g、胰蛋白胨10g、酵母提取粉5g、磷酸二氢钾1g、氯化钠5g、硫酸镁0.5g、硫酸锰5mg，用水定容至1000mL。
2、完成步骤1后，4℃、8000rpm离心15min，收集上清液，即为粗酶液。
3、L-酪氨酸标准曲线的绘制
采用0.1mol/L HCl溶液为溶剂，配置0μg/mL、10μg/mL、20μg/mL、30μg/mL、 40μg/mL、50μg/mL、60μg/mL或70μg/mL的酪氨酸标准品溶液。取1mL酪氨酸标准品溶液加入到试管中，然后加入5mL 0.4mol/L的Na2CO3水溶液和1mL Folin-Phenol 试剂，混匀，在40℃的恒温水浴锅孵育20min。用紫外可见分光光度计在680nm的波长下测吸光度(蒸馏水调零)。以吸光度为y轴标，L-酪氨酸浓度为x轴绘制L-酪氨酸标准曲线。
4、采用蒸馏水为溶剂，将步骤3得到的粗酶液进行适度稀释，得到待测溶液。
5、酶活检测
试验组(三个重复处理)：试管中加入1mL待测溶液，置于40℃水浴锅中孵育2min，然后依次加入1mL底物溶液和2mL 0.4mol/L三氯乙酸水溶液，摇匀，将试管静置10min，然后用慢速滤纸过滤并收集滤液；将1mL滤液加至新的试管中，依次加入5mL 0.4mol/L 碳酸钠水溶液和1mL Folin-Phenol试剂，摇匀，在40℃的恒温水浴锅孵育20min。用紫外可见分光光度计在680nm的波长下测吸光度(蒸馏水调零)。
对照组(三个重复处理)：试管中加入1mL待测溶液，置于40℃水浴锅中孵育2min，然后依次加入2mL 0.4mol/L三氯乙酸水溶液和1mL底物溶液，摇匀，将试管静置10min，然后用慢速滤纸过滤并收集滤液；将1mL滤液加至新的试管中，依次加入5mL 0.4mol/L 碳酸钠水溶液和1mL Folin-Phenol试剂，摇匀，在40℃的恒温水浴锅孵育20min。用紫外可见分光光度计在680nm的波长下测吸光度(蒸馏水调零)。
底物溶液：将1g酪蛋白(广东环凯微生物科技有限公司，产品目录号9000-71-9)溶于pH7.5磷酸缓冲液并定容至100mL。
试验组吸光度-对照组吸光度＝吸光度差值。
根据吸光度差值，对照L-酪氨酸标准曲线，得到酪氨酸的产量。
根据酪氨酸产量和稀释倍数，计算得到粗酶液的酶活,即每毫升粗酶液每分钟催化酪蛋白生成酪氨酸的产量，酶活单位为μg/mL/min。
枯草芽孢杆菌20076的粗酶液的酶活为157.33μg/mL/min。
枯草芽孢杆菌KC180的粗酶液的酶活为181.15μg/mL/min。
三、菌株生产纤维素酶(内切葡萄糖苷酶)的能力
1、将供试菌株接种至发酵培养基(菌株在发酵培养基中的初始浓度为5×105cfu/mL)，180rpm振荡培养36小时。发酵温度分别设置为：30℃、35℃、40℃、45℃或55℃。
发酵培养基(pH5.5)：无水葡萄糖5g、胰蛋白胨10g、酵母提取粉5g、磷酸二氢钾1g、氯化钠5g、硫酸镁0.5g、硫酸锰5mg、羧甲基纤维素钠5g，用水定容至1000mL。
2、完成步骤1后，4℃、8000rpm离心15min，收集上清液，即为粗酶液。
3、葡萄糖标准曲线的绘制
采用蒸馏水为溶剂，配置0.1mg/mL-0.7mg/mL的葡萄糖标准溶液。取3mL葡萄糖标准溶液、1mL DNS试剂加到试管中摇匀，沸水浴5min，然后立即冰浴终止反应，加 16mL蒸馏水摇匀，用紫外可见分光光度计于波长为540nm处测吸光度。以吸光度为横坐标，葡萄糖浓度为纵坐标，绘制葡萄糖标准曲线。
4、采用蒸馏水为溶剂，将步骤2得到的粗酶液进行适度稀释，得到待测溶液。
5、取6支试管，每3支一组，一组作为试验组，另一组作对照组。每支对照组试管中加入2mL底物溶液、1mL DNS试剂和1mL待测溶液摇匀，沸水浴5min，然后立即冰浴终止反应，加16mL蒸馏水摇匀，用紫外可见分光光度计于波长为540nm处测吸光度。每支试验组试管中加入2mL底物溶液和1mL待测溶液摇匀，置于50℃水浴锅中反应1h，然后加入1mL DNS试剂并摇匀，沸水浴5min，然后立即冰浴终止反应，加16mL 蒸馏水摇匀，用紫外可见分光光度计于波长为540nm处测吸光度。
底物溶液：将0.5g羧甲基纤维素钠(生工生物工程(上海)股份有限公司产品目录号9004-32-4)溶于pH7.5的磷酸缓冲液并定容至100mL。
试验组吸光度-对照组吸光度＝吸光度差值。
根据吸光度差值，对照葡萄糖标准曲线，得到葡萄糖的产量。
根据葡萄糖产量和稀释倍数，计算得到粗酶液的酶活，即每毫升粗酶液每分钟催化羧甲基纤维素钠生成葡萄糖的产量，酶活单位为μg/mL/min。
酶活结果见表2。
表2
枯草芽孢杆菌20076 枯草芽孢杆菌KC180
发酵温度为30℃ 2.283 2.284
发酵温度为35℃ 2.947 2.998
发酵温度为37℃ 3.596 3.640
发酵温度为40℃ 3.457 3.840
发酵温度为45℃ 1.666 3.902
发酵温度为50℃ 0 4.825
发酵温度为55℃ 0 4.019
与枯草芽孢杆菌20076相比，枯草芽孢杆菌KC180的内切葡聚糖苷酶酶活显著提高，最适温度也由37℃变为50℃。

Claims (10)

1.枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)KC180，其保藏编号为CCTCC NO：M 2018492。
2.权利要求1所述枯草芽孢杆菌在生产淀粉酶中的应用。
3.权利要求1所述枯草芽孢杆菌在生产蛋白酶中的应用。
4.权利要求1所述枯草芽孢杆菌在生产纤维素酶中的应用。
5.权利要求1所述枯草芽孢杆菌在生产内切葡萄糖苷酶中的应用。
6.权利要求1所述枯草芽孢杆菌在生产淀粉酶、蛋白酶和纤维素酶中的应用。
7.一种试剂盒，含有权利要求1所述枯草芽孢杆菌；
所述试剂盒的功能为如下(a)、(b)、(c)、(d)或(e)：
(a)生产淀粉酶；
(b)生产蛋白酶；
(c)生产纤维素酶；
(d)生产内切葡萄糖苷酶；
(e)生产淀粉酶、蛋白酶和纤维素酶。
8.权利要求1所述枯草芽孢杆菌的发酵上清。
9.权利要求8所述发酵上清的应用，为如下(Ⅰ)、(Ⅱ)、(Ⅲ)、(Ⅳ)或(Ⅴ)：(Ⅰ)作为淀粉酶；
(Ⅱ)作为蛋白酶；
(Ⅲ)作为纤维素酶；
(Ⅳ)作为内切葡萄糖苷酶；
(Ⅴ)作为复合酶；所述复合酶为淀粉酶、蛋白酶和纤维素酶。
10.一种试剂盒，含有权利要求8所述发酵上清；
所述试剂盒的功能为如下(Ⅰ)、(Ⅱ)、(Ⅲ)、(Ⅳ)或(Ⅴ)：
(Ⅰ)作为淀粉酶；
(Ⅱ)作为蛋白酶；
(Ⅲ)作为纤维素酶；
(Ⅳ)作为内切葡萄糖苷酶；
(Ⅴ)作为复合酶；所述复合酶为淀粉酶、蛋白酶和纤维素酶。
CN201811176123.5A 2018-10-10 2018-10-10 一株高产复合酶的枯草芽孢杆菌及其应用 Active CN109182206B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201811176123.5A CN109182206B (zh) 2018-10-10 2018-10-10 一株高产复合酶的枯草芽孢杆菌及其应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201811176123.5A CN109182206B (zh) 2018-10-10 2018-10-10 一株高产复合酶的枯草芽孢杆菌及其应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN109182206A CN109182206A (zh) 2019-01-11
CN109182206B true CN109182206B (zh) 2021-08-27

Family

ID=64947283

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201811176123.5A Active CN109182206B (zh) 2018-10-10 2018-10-10 一株高产复合酶的枯草芽孢杆菌及其应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN109182206B (zh)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114591857B (zh) * 2022-03-10 2023-05-09 内蒙古工业大学 一株高纤维降解率的枯草芽孢杆菌及其应用

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107012104A (zh) * 2016-01-27 2017-08-04 北京大北农科技集团股份有限公司 枯草芽孢杆菌及微生态制剂、饲料添加剂、预混料及饲料
CN107022467A (zh) * 2017-06-16 2017-08-08 山西梁汾醋业有限公司 一种高游离态氨基酸食醋的酿造方法

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107012104A (zh) * 2016-01-27 2017-08-04 北京大北农科技集团股份有限公司 枯草芽孢杆菌及微生态制剂、饲料添加剂、预混料及饲料
CN107022467A (zh) * 2017-06-16 2017-08-08 山西梁汾醋业有限公司 一种高游离态氨基酸食醋的酿造方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
产复合酶枯草芽孢杆菌QLB6的激光诱变育种;宋鹏;《食品科学》;20111231;第32卷(第9期);第222-224页 *
红树林根际土壤中产三种酶枯草芽孢杆菌的分离鉴定;马军;《琼州学院学报》;20151030;第22卷(第5期);第61-66页 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN109182206A (zh) 2019-01-11

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Ramesh et al. Critical importance of moisture content of the medium in alpha-amylase production by Bacillus licheniformis M27 in a solid-state fermentation system
Soeka et al. Characterization of cellulase enzyme produced by two selected strains of Streptomyces macrosporeus isolated from soil in Indonesia
Gazali et al. Thermostable 𝜶-Amylase Activity from Thermophilic Bacteria Isolated from Bora Hot Spring, Central Sulawesi
CN114410489B (zh) 一株异常威克汉姆酵母cap5菌株及其应用
CN114107139B (zh) 一株烟管菌f21及其在生产纤维素酶中的应用
CN109182206B (zh) 一株高产复合酶的枯草芽孢杆菌及其应用
CN113293105B (zh) 一株米曲霉za173及其应用
Panda et al. Pectinolytic and cellulolytic activity of soil fungal isolates from similipal bioreserve forest
Haggett et al. Mutants of Cellulomonas which produce increased levels of β-glucosidase
CN104342372A (zh) 一种利用益生菌发酵生产酵母水解物的方法
Pathak et al. Study of effect of temperature on amylase production by soil mycotic flora of Jabalpur region
CN107488601B (zh) 一株高产耐糖耐酸β-葡萄糖苷酶的菌株及其应用
Ekka et al. Screening, isolation and characterization of amylase producing bacteria and optimization for production of amylase
CN114644984A (zh) 一种从土壤中分离产淀粉酶的微生物的方法
Debnath et al. Screening and characterization of extracellular cellulase enzyme produced by wild edible mushroom Pleurotus giganteus
CN114480205A (zh) 一株解淀粉芽孢杆菌及其在固态发酵食醋酿造中的应用
CN108841799B (zh) 一种虫壳属菌发酵产生过氧化氢酶的培养基及方法
Hamza et al. Improvement efficacy of Bacillus subtilis cellulose hydrolyzing by using cold plasma technique
Anatoliiovych Pavlenko et al. Cellulase and Polygalacturonase Activity by Trichoderma viride
Bakri et al. Enzymatic activity of the endophytic Fusarium species strains isolated from wheat
CN116286557B (zh) 一株产纤维素酶的耐盐贝莱斯芽孢杆菌及其培养方法
CN113462587B (zh) 一种高产淀粉酶的扣囊复膜酵母菌株及其制备方法和应用
CN115125235B (zh) 一株高产溶葡萄球菌酶的大肠杆菌突变体
CN114958623B (zh) 一株高产纤维素酶的盖姆斯木霉及其应用
CN117736880A (zh) 一株总状横梗霉及其固态发酵产果胶酶的方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant