CN107012104A - 枯草芽孢杆菌及微生态制剂、饲料添加剂、预混料及饲料 - Google Patents

枯草芽孢杆菌及微生态制剂、饲料添加剂、预混料及饲料 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一株具有多种产酶活性、酶活力较高的突变枯草芽孢杆菌菌株CGMCC No.9357及其应用。将来源于养虾池的菌株，作为出发菌株，对其进行紫外诱变，获得一株菌，其中性蛋白酶活力、中性木聚糖酶活力和中性纤维素酶活力较出发菌株分别提高到1.8倍、1.56倍和1.3倍，同时兼具淀粉酶活性。在海水和淡水中均有一定的酶活性，且具有一定的高温耐受性。

Description

枯草芽孢杆菌及微生态制剂、饲料添加剂、预混料及饲料
技术领域
本发明公开一株枯草芽孢杆菌菌株，及含有其的饲料添加剂及预混料，属于微生物技术领域。
背景技术
中国是水产养殖大国，高密度养殖带给养殖高收益的同时，仍存在亟待解决的问题：投饵、施肥、排泄物等引起水体严重污染，导致水产养殖的生态环境日趋恶化，水中生物耗氧量、亚硝酸盐、氨氮、硫化物等严重超标，病原微生物种类和数量上升，鱼虾病害不断增加，致使大面积死亡的事件时有发生。运用有效的微生态，促进水产动物的消化吸收功能，增强其免疫力，控制养殖水环境中氨氮、硫化氢等有害物含量，调控养殖池微生物生态结构。当前，预防病害是水产养殖业所面临的迫切课题。
发明内容
为了解决上述问题，本发明筛选出了具有高产多种酶性能的菌株，包括蛋白酶、淀粉酶、木聚糖酶、纤维素酶等；较高热耐受性和高海盐耐受性的枯草芽孢杆菌，应用在水产养殖中，提饲料转化率，对鱼虾等水产动物具有保健作用。
本发明所述的枯草芽孢杆菌筛选方法，包括以下步骤：
(1)样品收集：收集福建、湖南、湖北、江苏、京津冀、辽宁等地鱼塘虾池的水样和泥样共计100份。
(2)拟芽孢杆菌的筛选：取1g泥样样品(水样直接备用)，加入90mL无菌水/150mL三角瓶，震荡30min。取5mL泥样悬液或水样，加入无菌试管中，85℃，10min，LB，37℃过夜富集。梯度稀释成10-1，10-2，10-3，10-4，10-5，10-6，10-7，选择两到三个梯度涂布 LB平板，两个平行，将平板倒置，37℃培养24h。对生长快的菌落大的菌株进行编号，转接到斜面，作为目标菌备用。
(3)不同盐度的产酶初筛培养基(根据水产养殖条件选择，3°、15°或28°的海盐水)
蛋白酶初筛培养基：脱脂奶粉10g，蛋白胨10g，1L海盐水，pH7.2-7.8，琼脂粉15g，113-115℃，13-15min。(脱脂奶粉溶液一瓶，与盐水和琼脂一瓶，1:1分开灭菌)
淀粉酶初筛培养基：酵母膏5g，可溶性淀粉15g，1L海盐水，pH7.2-7.8，琼脂粉15-25g，121℃，20min。
纤维素酶初筛培养基：酵母膏5g，羟甲基纤维素5g，1L海盐水，pH7.2-7.8琼脂粉15-25g，121℃，20min。
木聚糖酶初筛培养基：木聚糖，1.0-10g；酵母膏5g，1L海盐水，pH7.2-7.8琼脂粉15-25g，121℃，20min。
脂肪酶初筛培养基：酵母膏5g，蛋白胨10g，三丁酸甘油酯10g，1L海盐水，pH7.2-7.8琼脂粉15g，121℃，20min。
(4)菌株筛选及鉴定方法
蛋白酶定性筛选：将目标菌点接到蛋白酶初筛培养基平板(以下产酶初筛培养基平板统称为***酶板)，30℃培养24h，观察菌落周围是否出现透明圈，目测同一平板菌株圈径比相对大小。
淀粉酶定性筛选：点接目标菌于淀粉酶板上，30℃培养24h。加革兰氏染色中的典液，显色，为防止光分解，5min内观察。观察菌落周围是否出现透明圈，目测同一平板菌株圈径比相对大小。
脂肪酶定性筛选：点接目标菌于脂肪酶板上，30℃培养24h～48h。观察菌落周围是否出现白色沉淀圈，目测同一平板菌株圈径比相对大小。
木聚糖、纤维素酶定性初筛：将目标菌分别点接到木聚糖酶酶板、纤维素酶酶板，30℃培养24h，倒入一定0.1-0.3％的刚果红溶液， 使其浸没菌落，静止(或蛋白振荡器上60rpm)50min，之后，倒出刚果红，再加入1M NaCl 20-30min换液，在加NaCl漂洗，两次共计1h。倒出NaCl，于光处观察，在菌落周围出现清晰的透明全，目测同一平板菌株圈径比相对大小。
酶活力的定量筛选：将圈径比较大的菌株收集的一起，试管液体活化，相同OD600接种三角瓶发酵，30℃震荡培养36h。12000rmp离心2-3min，取上清。测酶活力。参照检测方法分别为：GB/T28715-2012(蛋白酶)、GB 8275-2009(淀粉酶)、GB 23874-2009-T(木聚糖酶)、纤维素酶(GBT 23881-2009)。
(5)生长曲线：将出发菌株接种于LB培养基中，37℃培养，每两小时测定一次OD600，以横坐标为时间，纵坐标为吸光度，绘制生长曲线。
(6)诱变选育：将出发菌株培养至对数生长期，将菌液浓度调制108cfu/mL。取2个直径为6cm的无菌培养皿，每平皿加入3～5mL菌液。紫外预热20～30min，在搅拌状态下，选用15～20W的紫外灯，照射距离为30cm，照射时间为致死率在70％～85％的诱变时间即10s，诱变后，在红光下，梯度稀释，选择适当的稀释倍数，涂布与蛋白酶平板上，37℃避光培养1天。挑选圈径比较大的菌株200～500株，对其依次进行淀粉酶、脂肪酶、木聚糖酶等定性检测，获得圈径比较大菌株10～60株，4℃保藏。再对其进行酶活力的比较，获得1株较好的菌株。其蛋白酶酶活力和淀粉酶酶活力分别提高了2倍和1.5倍，同时兼具蛋白酶活性、淀粉酶活性、纤维素活性、木聚糖酶活性及β-甘露聚糖酶等活性。
(7)稳定性：将筛选获得的菌株在摇瓶中复苏，37℃，恒温培养箱培养1天，连续传代10次，测定其酶活力，即得。
本发明所述的枯草芽孢杆菌的特征为：
(1)该枯草芽孢杆菌5#(试验过程中的编号，以下简称5#菌) 的出发菌株B3-1，经过85℃，处理10min，筛选，具有高温耐受性。
(2)出发菌B3-1具有蛋白酶活性、淀粉酶活性、木聚糖酶活性、纤维素酶活性、β-甘露聚糖酶活性等多种酶活性。
(3)经过紫外诱变，5#菌的中性蛋白酶活力、中性木聚糖酶活力和中性纤维素酶活力较出发菌株分别提高到1.8倍、1.56倍和1.3倍。
(4)5#菌在淡水(3°)、海水(15°-28°)环境中，菌株及上清液均有酶活性，部分酶具有高温耐受性。
将本发明的枯草芽孢杆菌5#于2014年6月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为：CGMCC9357。
本发明还提供含有所述枯草芽孢杆菌的微生态制剂。
本发明还提供含有所述枯草芽孢杆菌的饲料添加剂，在所述饲料添加剂中，所述枯草芽孢杆菌的活菌数为1010-1011cfu/g。
本发明还提供含有所述饲料添加剂的预混料。
本发明还提供含有所述枯草芽孢杆菌的浓缩料、配合料。
本发明还提供所述枯草芽孢杆菌在水产保健中的应用。
本发明的积极效果在于：该枯草芽孢杆菌具有产多种酶性能，包括蛋白酶、淀粉酶、木聚糖酶、纤维素酶、β-甘露聚糖酶等；较高热耐受性和海盐耐受性，应用在水产养殖中，提饲料转化率，对鱼虾等水产动物具有保健作用。
附图说明
图 1：出发菌株B3-1的生长曲线。
图 2：5#菌中性蛋白酶相对活力。
图 3：5#菌中性木聚糖酶相对活力。
图 4：5#菌中性纤维素酶相对活力。
图 5:饲喂南美白对虾效果。A为对照组，B为试验组。
具体实施方法
为了便于理解本发明，特例举以下实施例。其作用是对本发明的阐述而不是对本发明任何形式的限制。
实施例1 芽孢杆菌的分离，即产酶性能的初筛
收集福建、湖南、湖北、江苏、京津冀、辽宁等地鱼塘虾池的水样和泥样共计100份。取1g泥样样品(水样直接备用)，加入90mL无菌水/150mL三角瓶，震荡30min。取5mL泥样悬液或水样，加入无菌试管中，85℃，处理10min。取1mL，加到LB液体中，37℃过夜富集。梯度稀释成10-1，10-2，10-3，10-4，10-5，10-6，10-7，选择两到三个梯度涂布LB平板，两个平行，将平板倒置，37℃培养24h。对生长快的菌落大的菌株进行编号，转接到斜面，作为目标菌备用。
对目标菌株的蛋白酶活性、淀粉酶活性、纤维素酶活性、木聚糖酶活性等活性，进行初筛。部分结果见表 1，获得具有产酶性能的菌株436株，同时具有多种酶的菌株16株，将其甘油保藏。其中，最好的一株，编号为B3-1，对其进行16s分子鉴定，结果为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。
表 1 产酶初筛部分结果
注：*代表酶活性的强弱，越多代表酶活性越强；/代表无活性。
实施例2 诱变选育
将B3-1作为出发菌株，进行诱变选育。测定B3-1的生长曲线，结果见图 1。培养到对数生长期，对其进行紫外诱变，计算致死率，结果见表 2。选择10s，作为诱变时间。诱变后，挑选菌落较大的菌株200～500株，对其依次进行淀粉酶、脂肪酶、木聚糖酶等定性检测，获得圈径比较大的菌株10～60株，4℃保藏，作为考察菌株。将考察菌株三角瓶发酵，对其上清液，进行产酶比较，选择较好的一株，保藏，即5#菌。
表 2 紫外诱变致死率
时间/s 致死率/％
10 78.00
15 90.71
30 99.89
60 99.96
90 99.97
120 100.00
240 100.00
实施例3 模拟养殖盐度下产酶性能试验
将5#菌株进行三角瓶发酵，培养基为TSB-YE，盐度为3°和15°两种，30℃～37℃发酵时间为30h～40h。离心收集上清，2倍梯度稀释为1倍、2倍和4倍。取微量点到两种盐度的5种酶板上，定性的检测5#菌的酶活性，以及其能在不同盐度发挥作用，将结果汇总为表 3。
表 3 5#菌模拟养殖盐度下酶活性
注：*代表酶活性的强弱，越多代表酶活性越强；/代表无活性。
由表 3可知，5#菌在模拟养殖环境盐度条件下，具有较高蛋白酶、淀粉酶、纤维素酶和木聚糖酶的性能。
实施例4 发酵罐不同培养基产酶跟踪试验
将活化好的5#菌种子液，接种到发酵培养基中，30L发酵罐发酵，两个平行。从发酵8h开始，每隔4h取一次，检测不同盐度产酶性能。结果见表 4。
表 4 5#菌发酵跟踪产酶试验
注：a代表编号中第一个数字代表发酵罐的编号，第二个数字代表该发酵罐不同发酵时间取样的第次。
由表 4可知，5#菌在在培养20h之后，酶活性达到较高水平，且重复之间产酶性能比较稳定。
实施例5 5#菌发酵上清酶学性质------热耐受性
将5#菌发酵上清液，取5mL，分装到8个离心管中，分别在20℃、25℃、35℃、45℃、55℃、65℃、80℃及100℃，处理30min。然后加入到盐度为3°和15°产酶板上。结果由表 5可知，
表 5 5#菌发酵上清酶热耐受性
注：*代表酶活性的强弱，越多代表酶活性越强；/代表无活性。
在55℃，上清液的淀粉酶、木聚糖酶和纤维素酶具有较好的热耐受性。蛋白酶，在45℃具有较好的耐受。
实施例6 酶活力定量试验
将5#菌株、出发菌株及市面上较好的微生态菌株，试管液体活化，三角瓶发酵，30℃震荡培养36h。12000rmp离心2-3min，取上清。测酶活力(本文以活力较好的代表性菌株为例)。参考检测方法分别为：GB/T28715-2012(蛋白酶)、GB 23874-2009-T(木聚糖酶)、纤维素酶(GBT 23881-2009)，并结合养殖环境条件，稍作修改，如pH7.2～7.8，25～30℃。结果由见图 2 ～ 4可知，5#菌的中性蛋白酶活力、中性木聚糖酶活力和中性纤维素酶活力分别提高到1.8倍、1.56倍和1.3倍。
实施例7 饲喂南美白对虾效果
采用实施例4发酵培养基，将5#菌在35吨发酵罐进行大生产，制成粉剂，按照1‰的比例添加到虾料中，添加到饲料中。在华南，两个4.5亩的南美白对虾精养池塘，一个塘里全程使用该饲料，另一个塘里全程使用不添加微生态的饲料作为对照，养殖周期为62天，使用饲料各3200斤，产量为3200斤，饵料系数为1.03，对照饵料系数为1.15而且，虾的肠道粗、有活力、卖相好，见图 5。

Claims (7)

1.一种枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)新菌株，其保藏号为CGMCC No.9357。
2.含有权利要求1所述菌株的微生态制剂。
3.含有权利要求1所述的菌株的饲料添加剂，其特征在于，所述饲料添加剂中所述枯草芽孢杆菌的活菌数为1010-1011cfu/g。
4.含有权利要求3所述饲料添加剂的预混料。
5.含有权利要求1所述菌株的浓缩料。
6.含有权利要求1所述菌株的配合料。
7.权利要求1所述的菌株在水产保健中的应用。
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