CN105132307A - 一种应用于观赏鱼的复合芽孢杆菌微生物净水剂及其应用 - Google Patents

一种应用于观赏鱼的复合芽孢杆菌微生物净水剂及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种应用于观赏鱼的复合芽孢杆菌微生物净水剂，由以下菌种组成：枯草芽孢杆菌CCTCC？NO:M2011443、地衣芽孢杆菌CCTCC？NO:M2012457、凝结芽孢杆菌CCTCC？NO:M2015273、短小芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、侧孢芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌；所述凝结芽孢杆菌为凝结芽孢杆菌(Bacillus？coagulans)ZS-007，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC？NO:M2015273。本发明可降解观赏鱼养殖水体中的底部残饵和排泄物，实现净化水体，节省换水人工并减少换水带来的环境污染问题；产品保质期1年，利于日常采购和使用。

Description

一种应用于观赏鱼的复合芽孢杆菌微生物净水剂及其应用
技术领域
本发明涉及微生物应用技术领域，尤其是涉及一种应用于观赏鱼的、含有凝结芽孢杆菌复合芽孢杆菌微生物净水剂及其应用。
背景技术
随着生活水平不断提高，观赏鱼已进入日常生活，给人们带来欢乐。家庭养鱼过程中，水体经常出现浑浊甚至发绿发黑等现象，严重时直接导致观赏鱼死亡。引起这种现象的原因在于未被食用的饵料和观赏鱼排泄物污染了水体。
目前，人们通常采用定期更换新鲜水或者使用含有光合细菌(PSB)的微生物净水剂产品来保持水体干净。
定期更换新鲜水固然能维持观赏鱼养殖水质，但替换出的脏水会被排入下水道或者进入环境，形成新的污染源。
PSB是一类光能厌氧性微生物，能以污水中的有机物为营养进行光合作用，从而净化水质。农林生介绍了一种以光合菌群为主的复合微生物净水剂在观赏鱼养殖中的有益效果(复合微生物净水剂对观赏鱼水族箱养殖水质的影响试验，广西农业科学，2008年第39卷第6期)。PSB有一个缺点，即保质期不长，出厂后短期内必须用完，否则微生物大量死亡。因此，在使用含有光合细菌(PSB)的微生物净水剂产品时，经常会发现产品前期有效，但过了两三个月以后效果减弱甚至没有效果。
发明内容
针对现有技术存在的上述问题，本申请人提供了一种应用于观赏鱼的、含有凝结芽孢杆菌的复合芽孢杆菌微生物净水剂及其应用。本发明可降解观赏鱼养殖水体中的底部残饵和排泄物，实现净化水体，节省换水人工并减少换水带来的环境污染问题；产品保质期1年，利于日常采购和使用。
本发明的技术方案如下：
本发明提供了一种应用于观赏鱼的复合芽孢杆菌微生物净水剂，由以下菌种组成：
所述凝结芽孢杆菌为凝结芽孢杆菌(Bacilluscoagulans)ZS-007，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO:M2015273。
本发明还提供了一种应用于观赏鱼的复合芽孢杆菌微生物净水剂的应用，将复合芽孢杆菌微生物净水剂直接投入水体，用量0.1-0.5g/m3水体，每8～12天使用一次。
1、凝结芽孢杆菌的筛选
从江苏无锡马山某奶牛养殖场附近的土壤样品称取2g，加入98ml无菌生理盐水，80℃热处理10min后，在37℃摇床上120rpm条件下振荡20min，吸取上清液1ml加入LB培养基中稀释涂布进行菌株分离。通过对菌株进行形态学观察、生理生化实验、16SrDNA分析等手段有效而准确的确定菌种的属种。
最终得到编号为ZS-007的菌种，鉴定为凝结芽孢杆菌(Bacilluscoagulans)。
ZS-007于2015年5月3日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCM2015273。保藏单位地址为中国.武汉.武汉大学。
2、凝结芽孢杆菌高密度发酵
(1)菌种活化
将凝结芽孢杆菌菌种接种至营养琼脂斜面培养基上，25-37℃下培养24-48hr；然后划线转接于营养琼脂茄子瓶斜面，25-37℃下培养24-48hr。
营养琼脂斜面培养基及营养琼脂茄子瓶的组成均为：蛋白胨10g/L，牛肉膏3g/L，氯化钠5g/L，琼脂15-20g/L，pH7.2-7.4。
(2)摇瓶培养
将活化好的菌种接种至摇瓶中，振荡培养18-30hr。
摇瓶培养基配方：蛋白胨10g/L，牛肉膏3g/L，氯化钠5g/L，pH7.2-7.4。250mL摇瓶装液量为20mL，500mL摇瓶装液量为50mL。
培养条件：摇瓶转速200r/min，温度25-37℃。
(3)种子罐扩培
扩培菌种以用于后期发酵。种子罐培养基组成：蛋白胨10g/L，牛肉膏3g/L，氯化钠5g/L，pH7.2-7.4。种子罐体积10-1000L，装液量50-80％。
培养条件：搅拌转速180-250r/min，通气量0.5-1.0vvm，温度25-37℃，培养时间18-30hr。
(4)发酵罐发酵
以0.1％-10％的接种量将种子液接入发酵罐，发酵培养基组成：葡萄糖25g/L，蛋白胨15g/L，酵母粉10g/L，磷酸二氢钾1g/L，硫酸镁0.5g/L，初始pH7.0。发酵罐体积1-50m3，装液量50-80％。
培养条件：搅拌转速100-200r/min，通气量0.5-0.8vvm，温度25-37℃，培养时间16-48hr。
取发酵液镜检时，当90％以上的菌体都形成芽孢时，即到发酵终点，得到最终发酵液。
采用平板涂布法测定最终发酵液活菌数和芽孢数，并计算芽孢率。其中，芽孢率为芽孢数与活菌数的比值。所用培养基为营养琼脂培养基：蛋白胨10g/L，牛肉膏3g/L，氯化钠5g/L，琼脂15-20g/L，pH7.2-7.4。测定最终发酵液活菌数时，梯度稀释后测定；测定芽孢数时，取最终发酵液于80℃热处理10min，梯度稀释后测定。最终发酵液中活菌数1.5×1010cfu/mL以上、芽孢数1.4×1010cfu/mL以上、芽孢率90.8％以上。
3、凝结芽孢杆菌干菌粉制备
最终发酵液离心后收集湿菌泥，采用喷雾干燥工艺得到干菌粉。操作条件为：进风温度210℃，出风温度100℃。干菌粉中活菌数8.0×1011cfu/g以上。
本发明的实现方式：将枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、侧孢芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌进行复配得到复合芽孢杆菌微生物净水剂产品。该复合芽孢杆菌微生物净水剂产品直投式使用，用量0.1-0.5g产品/m3水体，每8-12天使用一次。产品保质期1年。
本发明有益的技术效果在于：
本发明的作用原理：(1)多种芽孢杆菌发挥协同作用，多余饵料和观赏鱼排泄物用作微生物繁殖所需的营养物质而被大量消耗；(2)微生物代谢产生很多酶类，有效去除水体中的氨氮、亚硝酸盐等不利因素；(3)形成的微生物菌体聚合物可充当观赏鱼饵料，直接被吞食；(4)微生物以芽孢状态存在，抗逆性强，产品保质期长。
本发明直接投放于观赏鱼养殖水体进行水质改良，有效解决换水带来的环境污染问题；本发明实现了水质稳定，延长换水周期甚至可不换水；同时，产品保质周期长达1年，便于日常采购和使用。
具体实施方式
实施例1
1、凝结芽孢杆菌的筛选
从江苏无锡马山某奶牛养殖场附近的土壤样品称取2g，加入98ml无菌生理盐水，80℃热处理10min后，在37℃摇床上120rpm条件下振荡20min，吸取上清液1ml加入LB培养基中稀释涂布进行菌株分离。通过对菌株进行形态学观察、生理生化实验、16SrDNA分析等手段有效而准确的确定菌种的属种。
最终得到编号为ZS-007的菌种，鉴定为凝结芽孢杆菌(Bacilluscoagulans)。
ZS-007于2015年5月3日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCM2015273。
2、30m3发酵罐制备
菌种活化：将得到的菌种接种至营养琼脂斜面培养基上，30℃下培养24hr后划线转接于营养琼脂茄子瓶斜面，30℃下培养24hr。营养琼脂斜面培养基及营养琼脂茄子瓶的组成均为：蛋白胨10g/L，牛肉膏3g/L，氯化钠5g/L，琼脂15-20g/L，pH7.2-7.4。
摇瓶培养：将活化好的菌种接种至摇瓶中，振荡培养20hr。摇瓶培养基配方：蛋白胨10g/L，牛肉膏3g/L，氯化钠5g/L，pH7.2-7.4，摇瓶装液量50mL/500mL三角瓶。培养条件：摇瓶转速200r/min，温度30℃。
种子罐扩培：收集20瓶500mL摇瓶种子液用于种子罐接种。种子罐培养基组成：蛋白胨10g/L，牛肉膏3g/L，氯化钠5g/L，pH7.2-7.4。种子罐体积500L，装液量75％。培养条件：搅拌转速200r/min，通气量0.8vvm，温度30℃，培养时间20hr。
发酵罐发酵：30m3发酵罐装液量70％。培养基组成：葡萄糖25g/L，蛋白胨15g/L，酵母粉10g/L，磷酸二氢钾1g/L，硫酸镁0.5g/L，初始pH7.0。将培养好的种子接入发酵罐进行发酵。培养条件：搅拌转速100r/min，通气量0.6vvm，温度35℃，培养时间40-45hr。
发酵液中，活菌数1.99×1010cfu/g，芽孢数1.92×1010cfu/g，芽孢率96.5％。
3、干菌粉制备
离心收集湿菌泥，采用喷雾干燥工艺得到干菌粉。操作条件为：进风温度210℃，出风温度100℃。干菌粉中活菌数8.32×1011cfu/g。
实施例2
本复合芽孢杆菌微生物净水剂中各微生物含量如表1：
表1
名称 含量
枯草芽孢杆菌CCTCC NO:M2011443 1.0×107cfu/g
地衣芽孢杆菌CCTCC NO:M2012457 1.0×107cfu/g
凝结芽孢杆菌CCTCC NO:M2015273 0.5×107cfu/g
短小芽孢杆菌 0.1×107cfu/g
巨大芽孢杆菌 0.4×107cfu/g
解淀粉芽孢杆菌 0.5×107cfu/g
侧孢芽孢杆菌 1.0×107cfu/g
蜡样芽孢杆菌 0.5×107cfu/g
合计 5.0×107cfu/g
其中，枯草芽孢杆菌CCTCCNO:2011443、地衣芽孢杆菌CCTCCNO:2012457购买于中国典型培养物保藏中心；凝结芽孢杆菌CCTCCNO:M2015273为实施例1所制备。短小芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、侧孢芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌为市售产品。
应用时，产品直接投放于观赏鱼缸内，用量0.2g/m3水体，每10天使用一次。同时进行对照试验，在另外一个同规格、观赏鱼数量和大小一致的鱼缸中，使用不含有凝结芽孢杆菌CCTCCNO:M2015273的产品。两个缸均正常喂食。
不含有凝结芽孢杆菌CCTCCNO:M2015273的芽孢杆菌微生物净水剂，鱼缸在前1个月内可不换水，水质较为干净；从第二个月开始，鱼缸底部有排泄物沉淀出现，水质逐渐变浑浊。不到第三个月，鱼出现浮头现象，不得不换水。
含有凝结芽孢杆菌CCTCCNO:M2015273的芽孢杆菌微生物净水剂，鱼缸4个月内未换水，水质干净，底部未见饵料、排泄物沉淀，鱼未出现死亡现象。期间，主要水质指标变化情况如表2所示，污染因子指标下降，水质稳定。
表2
0(产品投放前) 1个月 2个月 3个月 4个月
COD(mg/L) 10.5 8.9 9.2 9.0 8.7
氨氮(mg/L) 1.53 1.41 1.37 1.29 1.27
亚硝酸盐(mg/L) 0.28 0.21 0.19 0.18 0.16
实施例3
按实施例1中的复合芽孢杆菌微生物净水剂室温下放置1年后再使用，产品直接投放于观赏鱼缸内，用量0.2g/m3水体，每10天使用一次。
正常喂食，鱼缸4个月内未换水，水质干净，底部未见饵料、排泄物沉淀，鱼未出现死亡现象。
实施例4
复合芽孢杆菌微生物净水剂中各微生物含量如表3：
表3
名称 含量
枯草芽孢杆菌CCTCC NO:M2011443 5.0×107cfu/g
地衣芽孢杆菌CCTCC NO:M2012457 4.0×107cfu/g
凝结芽孢杆菌CCTCC NO:M2015273 1.0×107cfu/g
短小芽孢杆菌 5.0×107cfu/g
巨大芽孢杆菌 2.0×107cfu/g
解淀粉芽孢杆菌 2.0×107cfu/g
侧孢芽孢杆菌 4.0×107cfu/g
蜡样芽孢杆菌 2.0×107cfu/g
合计 2.5×108cfu/g
应用时，产品直接投放于观赏鱼缸内，用量0.1g/m3水体，每10天使用一次。正常喂食，鱼缸一年内未换水，水质常年保持清亮，底部干净，鱼未出现死亡现象。
实施例5
复合芽孢杆菌微生物净水剂中各微生物含量如表4：
表4
名称 含量
枯草芽孢杆菌CCTCC NO:M2011443 2.0×109cfu/g
地衣芽孢杆菌CCTCC NO:M2012457 1.0×109cfu/g
凝结芽孢杆菌CCTCC NO:M2015273 1.0×109cfu/g
短小芽孢杆菌 0.5×109cfu/g
巨大芽孢杆菌 1.0×109cfu/g
解淀粉芽孢杆菌 1.0×109cfu/g
侧孢芽孢杆菌 1.0×109cfu/g
蜡样芽孢杆菌 1.0×109cfu/g
合计 8.5×109cfu/g
应用时，产品直接投放于观赏鱼缸内，用量0.1g/m3水体，每10天使用一次。正常喂食，鱼缸一年内未换水，水质常年保持清亮，底部干净，鱼未出现死亡现象。
对于本领域技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，这些改进或变换都属于本发明所附权利要求的保护范围。

Claims (2)

1.一种应用于观赏鱼的复合芽孢杆菌微生物净水剂，其特征在于由以下菌种组成：
所述凝结芽孢杆菌为凝结芽孢杆菌(Bacilluscoagulans)ZS-007，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO:M2015273。
2.一种权利要求1所述的应用于观赏鱼的复合芽孢杆菌微生物净水剂的应用，其特征在于将复合芽孢杆菌微生物净水剂直接投入水体，用量0.1-0.5g/m3水体，每8～12天使用一次。
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