CN104450572A - 一株产中温α-淀粉酶的枯草芽孢杆菌 - Google Patents

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Abstract

本发明公布了一株产中温α-淀粉酶的枯草芽孢杆菌。所述菌株通过-氯化锂-硫酸二乙酯复合诱变获得，具体为枯草芽孢杆菌304 Bacillus subtilis304，保藏号为CCTCC NO:M 2013600。该菌株所产中温α-淀粉酶最适作用温度为65℃，该酶在65℃条件下保存24h仍具有80％酶活，70℃条件下保存12h仍具有50％以上酶活；该酶最适反应pH值为5.0，在pH4-6下保存18h后仍有80％以上的酶活；该酶酶活力为7000-8500U/ml，特别适合反应温度高、液化工艺与糖化工艺并存的工业化需求。

Description

一株产中温α-淀粉酶的枯草芽孢杆菌
技术领域
本发明属于微生物技术领域，具体涉及一株产中温α-淀粉酶的枯草芽孢杆菌。
背景技术
α-淀粉酶全称为α-1，4-葡聚糖水解酶(EC3.2.1.1)，作用于淀粉时，可从分子内部切开α-1，4-糖苷键而生成糊精和还原糖，由于产物的末端葡萄糖残基C1碳原子为α-构型，故得名为α-淀粉酶。根据其使用的温度范围又分为高温α-淀粉酶、中温α-淀粉酶以及α-淀粉酶。在不同的工业中，需要对不同酶学性质的α-淀粉酶进行选择使用。
中温α-淀粉酶是一类使用温度在60-90℃，且在60℃以下、pH6.0-7.0时较为稳定的淀粉酶。广泛应用于酒精、啤酒、味精、淀粉糖、发酵工业的液化以及纺织、印染退浆、饲料行业、制浆造纸等。但由于此类酶稳定性差，且pH低于5.0以下时便会失活严重，从而限制了它的应用，并且给工业生产过程带来一定的麻烦。比如在淀粉质原料的糖化液化过程中，由于淀粉浆的pH一般在4.5左右，而广泛应用的α-淀粉酶的适用pH在6.0-7.0，因此在此阶段需要调节淀粉浆的pH以适应淀粉液化过程在α-淀粉酶的作用条件，而在此后的糖化过程中，糖化酶的作用pH一般在4.2-5.0，为了适用糖化酶的作用条件，需要在此调节体系的pH，由于pH的反复调整，不仅增加了工艺过程，消耗试剂，而且引入了外源离子，增加了分类的负担。
若能改变此类淀粉酶的作用pH范围，将能够极大的简化工艺过程，减少消耗与能耗，降低生产成本，因此，开发出一种性能优良的中温α-淀粉酶将具有极大的工业价值。
发明内容
本发明的目的是提供一株生产中温α-淀粉酶的枯草芽孢杆菌。
本发明提供的产中温α-淀粉酶的菌株具体为枯草芽孢杆菌304Bacillus subtilis304。该菌株已于2013年11月24日保藏于中中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC，地址为：中国.武汉.武汉大学)，保藏号为CCTCC NO:M 2013600。
所述枯草芽孢杆菌304由一株分离自酸性土壤的产中温α-淀粉酶的枯草芽孢杆菌出发菌株经紫外线-氯化锂-硫酸二乙酯复合诱变筛选获得，菌株特点如下：
所述菌株在固体平板上菌落颜色为乳白色，表面干燥褶皱，色暗不透明，边缘整齐，镜检为长杆状，革兰氏染色呈阳性，周生鞭毛，芽孢呈椭圆形。
理化特性：
菌株最适生长温度为30-37℃，pH为5.5-6.5.
采用发酵法生产酸性中温α-淀粉酶，其发酵罐培养阶段包括如下步骤：
将种子液以6-10％接种量接入发酵罐，培养温度30-37℃，搅拌速度200-250r/min，通风量(V/V)1:1-3,培养时间60-85h。
由菌株304通过上述方法发酵获得了一种酸性中温α-淀粉酶，其酶学性质如下：
(1)该酶温度适应范围较宽，温度在55-75℃之间活性较高，最适作用温度为65℃；
热稳定性：该酶在65℃条件下保存24h仍具有80％酶活，70℃条件下保存12h仍具有50％以上酶活。
(2)该酶最适反应pH值为5.0。在pH值4.0-6.0之间均有较高酶活力；
酸稳定性：在pH4-6下保存18h后仍有80％以上的酶活。
(3)酶活性：菌株304通过发酵制备的中温α-淀粉酶酶活力为7000-8500U/ml。
有益效果：
1、本发明使用紫外线-氯化锂-硫酸二乙酯复合诱变的方法获得了一株高产耐高温中温α-淀粉酶的枯草芽孢杆菌304，该菌株具有强耐酸、耐热性，产酶活力高的特点。
2、由本发明所述菌株发酵生产的酶在55-75℃之间均表现较高酶活性，说明该酶的温度适应范围较宽，其最适作用温度为65℃。该酶在65℃条件下保存24h仍具有80％酶活，70℃条件下保存12h仍具有50％以上酶活。在pH4.0-6.0时酶活性较高，且pH达到5.0时呈现最高酶活。且在pH4-6下保存18h后仍有80％以上的酶活。比现有的中温α-淀粉酶酶活力高，酶作用最适pH值范围宽泛，耐温度高，特别适合反应温度高、液化工艺与糖化工艺并存的工业化需求。
具体实施方式
下面通过具体的实施方案叙述本发明。除非特别说明，本发明中所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的范围，本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对这些实施方案中的物料成分和用量进行的各种改变或改动也属于本发明的保护范围。
实施例1：紫外线-氯化锂-硫酸二乙酯复合诱变筛选
(1)菌悬液的制备
将在平板划线分离后长出的出发菌株单菌落接入种子培养基中，100r/min，37℃培养24h后，取1mL培养液离心后用生理盐水洗涤两次，并重悬与9mL生理盐水中。
(2)紫外线-氯化锂-硫酸二乙酯复合诱变
将3mL菌悬液置于无菌平板中，在距离为30cm，功率15w的紫外灯下搅拌照射60s。将经过照射的菌液经梯度稀释后(10-1-10-5)涂布于氯化锂平板，并以未经紫外照射的菌液稀释涂平板做对照。将上述涂布均匀的平板，用黑色的布或报纸包好，置37℃培养48h，在长出菌落的平板上筛选出水解圈与菌落直径比值最大者挑至斜面保存，纯化后配制成菌悬液，经梯度稀释后(10-1-10-5)取20mL菌悬液与1mL硫酸二乙酯原液充分混合，并于37℃震荡处理40min，将处理过的菌液涂布于氯化锂平板。
(3)高产菌种的初筛
将上述涂布均匀的平板，置37℃培养48h，在长出菌落的平板上初筛出水解圈与菌落直径比值较大者挑至斜面保存，纯化后获得四株菌301，302，303，304；
(4)摇瓶发酵及耐酸性复筛
将获得的四株菌301，302，303，304在含有30mL发酵培养基的250mL摇瓶中进行摇瓶发酵，种子接种量10％(V/V)，40℃、200r/min培养72h，取发酵液5000r/min离心10min去除菌体,上清液经10000MWCO进行超滤浓缩，即得粗酶液，分别测定上述四株菌株的粗酶液的酶活及耐酸性，结果显示菌株304具有较好的酶特性。
所述的氯化锂平板：淀粉1％，蛋白胨1％，(NH)2SO40.4％，K2HPO40.8％，CaCl20.2％，氯化锂0.9％，琼脂2％。
所述的种子培养基：酵母粉0.5％，蛋白胨1％，可溶性淀粉1％，NaCl 1％。
所述的发酵培养基：玉米粉5％～15％，豆饼粉4％～10％，(NH)2SO40.4％，K2HPO40.8％，CaCl20.2％。
所述的摇瓶培养条件：该菌在含有30mL发酵培养基的250mL摇瓶中，接种量10％(V/V)，200r/min、37℃发酵培养72h。
实施例2：发酵条件优化
一种中温α-淀粉酶的制备方法，包括如下步骤：
(1)菌种活化
将保存完好的枯草芽孢杆菌304的斜面菌种接种于斜面培养基，35℃培养30h进行菌种活化，如此活化3次；
所述斜面培养基组成为：牛肉膏6g，氯化钠8g，蛋白胨15g，葡萄糖5g,琼脂20g，蒸馏水l000mL，pH值6.5，121℃灭菌20min；
(2)液体种子扩大培养
①一级种子培养：将步骤(1)活化后的斜面菌种2环接入500毫升摇瓶中，培养基装量100毫升，旋转式摇床250转/分，培养温度35℃，培养时间10h；
②二级种子培养：将一级种子按照10％的接种量接入500毫升二级种子摇瓶中，培养条件与一级种子相同；
③三级种子培养：将二级种子以10％接种量接入5000毫升三级种子摇瓶中，培养基装量1000毫升，旋转式摇床250转/分，培养温度35℃，培养时间10h；
④一级种子罐培养：将三级种子以10％接种量接入总容积为150L的一级种子罐，发酵培养基装量100L，培养温度35℃，搅拌速度300rpm，通风量(V/V)1:1.5,罐压0.05Mpa,培养时间15h；
所一级、二级、三级种子培养基重量组成为：
酵母粉0.4％，葡萄糖1.2％，蛋白胨0.4％，牛肉膏0.6％，磷酸氢二钾1.1％，中草药剂粉1.8％，海藻糖2％，硫酸钙1g,氯化镁2g,柠檬酸钠2g，不足部分纯净水补足，pH值6.5，123℃灭菌40min。
所述种子罐培养基重量组成为：
麦芽糊精10％，酵母粉0.6％，中草药剂粉1.8％，海藻糖2％，蛋白胨0.3％，玉米浆0.3％，磷酸氢二钾1.1％，硫酸镁0.08％，柠檬酸钠0.3％，不足部分纯净水补足，pH值6.5，123℃灭菌40min。
所述种子罐发酵液菌体浓度为8.0x 108个/ml；
(3)发酵罐发酵
将步骤(2)中一级种子罐发酵液以6％接种量接入发酵罐，培养温度35℃，搅拌速度250r/min，通风量(V/V)1:2,培养时间65h。
pH控制：通过补氨水或稀磷酸，控制发酵过程中pH值保持在6.5；
所述发酵培养基组成为：麦芽糊精100g，玉米粉55g，豆饼粉20g，中草药剂粉40g，海藻糖35g，酵母粉6g，玉米浆3g，硫酸铵2g，磷酸氢二钾2g，磷酸二氢钾2g，柠檬酸钠3g，消泡剂0.5g,纯净水l000mL，pH值6.5，121℃灭菌20min；
所述中草药粉剂的制备方法如下：
称取黄芪25份；党参15份；柴胡15份；黄芩10份；分别将上述中草药粉碎至粒径为2毫米以下，然后于容器中均匀混合并添加5倍重量的水，控制温度到33℃，pH值6.5，按质量比添加0.3％纤维素酶酶解1.5小时，控制温度80℃保持8分钟，然后降温至50℃，pH为6.0，按重量比分别加入0.20％的木瓜蛋白酶和果胶酶酶解50分钟，冷却到8℃保持2小时，升高温度到90℃保持15分钟，最后添加混合物料2倍重量乙醇和丙醇的混合物，控制温度至70℃保持3.4h，过滤；滤液真空浓缩后冷冻干燥获得中草药粉剂。
所述乙醇和丙醇的质量比例为1：1.2。
(4)发酵液经过滤、浓缩、调配、精滤、干燥得中温α-淀粉酶。
经上述制备方法得到发酵液经离心取上清所得的中温α-淀粉粗酶液酶活力为8500U/ml。
实施例3：淀粉酶活性的测定
(1)酶活单位的定义：1mL粗酶液，于65℃、pH 5.0条件下，1min液化1mg可溶性淀粉，即为1个酶活力单位，以U/mL表示。
(2)采用DNS法测定淀粉酶活性。
实施例4：酶学性质的测定
(1)温度对酶活性的影响以及酶的热稳定性
pH 5.0条件下，于40-90℃下分别测定实施例2所产粗酶液酶活力，结果表明该酶在55-75℃之间均表现较高酶活性，说明该酶的温度适应范围较宽，其最适作用温度为65℃。
pH 5.0条件下，将粗酶液于40-90℃下保存不同的时间后测定酶活，结果显示，该酶在65℃条件下保存24h仍具有80％酶活，70℃条件下保存12h仍具有50％以上酶活。
(2)pH对酶活性的影响以及酸稳定性研究
65℃条件下，在pH 3-8下分别测该酶酶活，结果表明该酶在pH4.0-6.0时酶活性较高，表明该酶为酸性淀粉酶，且pH达到5.0时呈现最高酶活。
65℃条件下，不同pH值下此酶的稳定性：将酶用不同pH值的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液适当稀释，在25℃下保温18h后再测此酶酶活，结果表明在pH4-6下保存18h后仍有80％以上的酶活。

Claims (5)

1.一株产中温α-淀粉酶的枯草芽孢杆菌，其特征在于，所述枯草芽孢杆菌具体为枯草芽孢杆菌304Bacillus subtilis304，保藏编号为CCTCC NO:M 2013600。
2.如权利要求1所述的一株产中温α-淀粉酶的枯草芽孢杆菌，其特征在于，所述中温α-淀粉酶具有以下特性：该酶最适作用温度为65℃，该酶在65℃条件下保存24h仍具有80％酶活，70℃条件下保存12h仍具有50％以上酶活。
3.如权利要求1-2所述的一株产中温α-淀粉酶的枯草芽孢杆菌，其特征在于，所述中温α-淀粉酶具有以下特性：该酶最适反应pH值为5.0，在pH4-6下保存18h后仍有80％以上的酶活。
4.如权利要求1-3所述的一株产中温α-淀粉酶的枯草芽孢杆菌，其特征在于，所述中温α-淀粉酶具有以下特性：该酶酶活力为7000-8500U/ml。
5.如权利要求1所述的枯草芽孢杆菌在α-淀粉酶生产中的应用。
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