CN105176883B

CN105176883B - 一株高产中温α-淀粉酶的枯草芽孢杆菌及其液体发酵方法

Info

Publication number: CN105176883B
Application number: CN201510677367.1A
Authority: CN
Inventors: 王兴吉; 郭庆文; 高晓娜; 张�杰
Original assignee: Shandong Lonct Enzymes Co ltd
Current assignee: Shandong Lonct Enzymes Co ltd
Priority date: 2015-10-19
Filing date: 2015-10-19
Publication date: 2019-05-14
Anticipated expiration: 2035-10-19
Also published as: CN105176883A

Abstract

本发明提供一株高产中温α‑淀粉酶的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)诱变株及其液体发酵方法。该菌株通过常压室温等离子体(ARTP)诱变选育获得，保藏编号为CGMCC No.10786。经发酵条件优化，平均发酵酶活力可达到7309u/mL，最高为7400u/mL。且该菌株与诱变前原始菌株相比，具有更强的抑菌效果。该菌株液体发酵所产中温α‑淀粉酶的最适作用温度为60～70℃，该酶在60～70℃条件下保存12h仍具有75％以上酶活；该酶最适反应pH为5.2～6.2，在pH5.2～6.2条件下保存12h后仍有85％以上酶活。

Description

一株高产中温α-淀粉酶的枯草芽孢杆菌及其液体发酵方法

技术领域

本发明涉及一株高产中温α-淀粉酶的枯草芽孢杆菌菌株及其液体发酵方法，属于微生物育种和发酵技术领域。

背景技术

α-淀粉酶全称为α-1,4-葡聚糖水解酶(EC 3.2.1.1)，作用于淀粉时，可从分子内部切开α-1,4-糖苷键而生成糊精和还原糖，由于产物的末端葡萄糖残基C1碳原子为α-构型，故得名为α-淀粉酶。淀粉酶是最早实现工业化生产并且是迄今为止用途最广、产量最大的酶制剂品种。

其中，中温α-淀粉酶是一类最适反应温度在50～70℃的α-淀粉酶。目前，中温α-淀粉酶已经广泛应用于变性淀粉及淀粉糖、焙烤工业、啤酒酿造、酒精工业等行业，也用于饲料、轻化工业、食品、造纸、医药、石油开采等各个领域。

近年来中温α-淀粉酶已经引起研究人员的广泛关注，具有广阔的应用前景。但是现有的中温α-淀粉酶在发酵时的最大酶活仍难以令人满意，因此急需研发出产量更高、发酵周期更短的中温α-淀粉酶的菌株及其发酵方法，以满足日益增长的工业化生产需求。

公开号为CN104450572A的发明专利申请公布了一株产中温α-淀粉酶的枯草芽孢杆菌，所述菌株通过氯化锂-硫酸二乙酯复合诱变获得，保藏号为CCTCC NO：M 2013600，该菌株所产中温α-淀粉酶最适作用温度为65℃，该酶在65℃条件下保存24h仍具有80％酶活，70℃条件下保存12h仍具有50％以上酶活；该酶最适反应pH值为5.0，在pH4-6下保存18h后仍有80％以上的酶活；该酶酶活力为7000-8500U/mL，特别适合反应温度高、液化工艺与糖化工艺并存的工业化需求。

公开号为CN102127514A的发明专利申请公布了一株高产强稳定性中温中性α-淀粉酶的枯草芽孢杆菌XLG-1，保藏号为CGMCC NO.3871，其最高产酶活性为4255U/mL，其产中温中性α-淀粉酶的初始发酵培养基为：玉米粉5-15％，豆饼粉4-10％，(NH)₂SO₄0.4％，K₂HPO₄0.8％，CaCl 0.2％，培养条件为：250mL三角瓶装30mL发酵培养基，接种量为10％(体积比)，37℃，200-250r/min，发酵72h，其所产中温中性淀粉酶的酶学特性在于：最适作用温度为40-60℃，最适反应pH为5-7，该酶分子量在58KD左右。

发明内容

本发明的目的是提供一株适于液体发酵高产中温α-淀粉酶的枯草芽孢杆菌突变菌株及其液体发酵生产方法。

本发明提供的高产中温α-淀粉酶的菌株具体为枯草芽孢杆菌菌株(Bacillussubtilis)BS-122，该菌株已于2015年05月07日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所(邮编100101)，保藏编号为CGMCC No.10786，分类命名：枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。

所述枯草芽孢杆菌突变菌株是采用枯草芽孢杆菌BS2007(申请人于2007年从土壤中筛选得到)进行常压室温等离子体(ARTP)诱变选育获得。枯草芽孢杆菌BS2007的液体发酵酶活最高为4600u/mL，诱变株的液体发酵酶活可达到6000u/mL，经发酵条件优化，平均发酵酶活力可达到7309u/mL，最高可达7400u/mL。中温α-淀粉酶酶活力单位定义为：1mL液体酶，于65℃、pH＝6.0条件下，1h液化1g可溶性淀粉，即为1个酶活力单位，以u/mL表示。

利用本发明枯草芽孢杆菌突变菌株(CGMCC No.10786)液体发酵产中温α-淀粉酶的方法，包括如下步骤：

种子培养：将中温α-淀粉酶的生产菌株枯草芽孢杆菌CGMCC No.10786进行摇瓶培养制备种子液；摇瓶培养基组成为：可溶性淀粉2-3％，酵母膏0.2-0.5％，蛋白胨0.2-0.4％，氯化钙0.1-0.2％，其余为水，pH值6.5～6.7；培养条件为：温度37℃，转速200rpm，培养周期6h；

液体发酵：在50L发酵罐进行液体发酵，发酵培养基组成为：玉米粉5.5-10％，豆饼粉3-4.5％，可溶性淀粉2-4.2％，硫酸铵0.2-0.4％，磷酸氢二钠0.8-1.0％，氯化钙0.1-0.2％，其余为水，pH值6.5～6.7；培养条件为：接种量为6～10％，装液量60％，温度37℃，转速200～800rpm，罐压0.07MPa，风量0.2～1.5vvm，培养周期70h；

补料方式：发酵10h时，流速10g/h/L恒速流加补料培养基；补料培养基组成为：葡萄糖40％，可溶性淀粉3％，硫酸铵0.2-0.4％，磷酸氢二钠0.8-1.0％，氯化钙0.8％，其余为水；

中温α-淀粉酶的提取与精制：发酵结束后，按发酵液体积加入0.6％的氯化钙，2％磷酸氢二钠进行发酵液絮凝；加入3％珍珠岩助滤剂，使用板框压滤机进行压滤，滤液经超滤机超滤浓缩后加入稳定剂得到液体酶制剂。

本发明菌株所产中温α-淀粉酶的酶学性质：最适作用温度为60～70℃，该酶在pH6.0，温度60～70℃条件下保存12h仍具有75％以上酶活；最适反应pH为5.2～6.2，在温度25℃，pH5.2～6.2条件下保存12h后，温度60℃条件下测定，仍有85％以上酶活。

本发明菌株具有抗菌性能：诱变株较原始菌株对大肠杆菌、米曲霉、毕赤酵母具有更强的抑制作用；原始菌株对葡萄球菌没有抑制作用，但是诱变菌株对葡萄球菌具有较强的抑制作用。

有益效果：

本发明通过对原始菌株进行ARTP诱变提高酶活后，对诱变株进行培养基优化和发酵条件优化，建立了适宜于工业化生产的液体发酵产中温α-淀粉酶的方法，平均发酵活力在7309u/mL。生产的中温α-淀粉酶有效温度范围35～90℃，最适温度范围60～70℃；有效pH范围4.5～8.0，最适pH值范围5.2～6.2。发酵酶活力高，酶作用最适温度、pH值范围宽泛、抑菌性能更强，可广泛应用于啤酒、味精、淀粉糖、酒精、发酵工业的液化以及印染退浆、饲料、果汁加工、焙烤等行业。

附图说明

图1：本发明中温α-淀粉酶在不同温度下保存12h的相对酶活；

图2：本发明中温α-淀粉酶在不同pH下保存12h的相对酶活。

具体实施方式

下面通过具体的实施方案叙述本发明。除非特别说明，本发明中所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的范围，本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对这些实施方案中的物料成分和用量进行的各种改变或改动也属于本发明的保护范围。

实施例1：菌株的选育

(1)菌悬液制备：

将培养至对数期的枯草芽孢杆菌BS2007菌液8000rpm离心5min，弃上清，用10％甘油重悬即为菌悬液，菌悬液的细胞浓度在10⁷个/ml。

(2)ARTP诱变：

吸取10μL菌悬液于载片中央并涂抹均匀；用无菌镊子将载片放于ARTP系统操作室旋转台上的对应孔位，调节载台下方旋钮，使载片处于气流端口2mm处，设置气流量10SLM，调节功率至100W，选择诱变照射时间分别为20s、25s、30s；样品处理完毕，用无菌镊子将载片移至装有1mL生理盐水的EP管中，将EP管在振荡器上震荡1min，把附着在载片上的菌体洗脱到液体中，形成新的菌悬液；对新的菌悬液进行适当稀释，取100μL涂布于淀粉筛选平板上。淀粉筛选培养基配方：葡萄糖5％，氯化钠0.2％，酵母粉0.2％，营养肉汤0.3％，蛋白胨0.5％，玉米淀粉1％，琼脂1.3％，调pH7.0左右。37℃培养过夜，长出单菌落后挑取淀粉水解圈直径与菌落直径比值较大的菌落共600个。

(3)诱变菌株的摇瓶初步筛选：

将挑选的600个淀粉水解圈直径与菌落直径比值较大的菌落进行单瓶摇瓶发酵，摇瓶配方为：玉米粉5.5％，豆饼粉4.5％，淀粉4.2％，硫酸铵0.4％，磷酸氢二钠1.8％，氯化钙0.27％，调pH7.0，加入碳酸钙1％。培养温度37℃，培养时间70h，转速200rpm。

培养结束后按照中华人民共和国国家标准GB8275-2009测定中温α-淀粉酶酶活，从其中筛选出20株酶活较出发菌株提高15％以上的诱变菌株。

(4)诱变菌株的摇瓶复筛：

将初筛筛选出的20株诱变菌株进行三次摇瓶实验，每次实验设置三组平行实验。实验结果显示有3株菌摇瓶发酵稳定性较好，而且酶活力较高。这3株菌摇瓶实验的酶活情况如下：

实施例2：液体发酵生产中温α-淀粉酶

经过培养基配方优化及发酵工艺优化后的液体发酵方法如下。

工艺流程：保藏菌种→斜面活化→平皿培养→种子液摇瓶培养→50L发酵罐发酵培养→提取与精制

种子培养：将摇瓶复筛到的3株诱变菌株进行常规摇瓶培养制成种子液，使用500mL三角瓶装液量为50mL。摇瓶培养基配方为：可溶性淀粉3％，酵母膏0.3％，蛋白胨0.3％，氯化钙0.2％，其余为水，pH值6.5；培养条件为：温度37℃，转速200rpm，培养周期6h；

液体发酵：在50L发酵罐进行液体发酵。发酵培养基组成为：玉米粉6％，豆饼粉3％，可溶性淀粉3％，硫酸铵0.4％，磷酸氢二钠0.8％，氯化钙0.2％，其余为水，pH值6.5；培养条件为：接种量为6％，装液量60％，温度37℃，转速800rpm，罐压0.07MPa，风量1.5vvm，培养周期70h；

补料方式：发酵10h时，流速10g/h/L恒速流加补料培养基；补料培养基组成为：葡萄糖40％，可溶性淀粉3％，硫酸铵0.4％，磷酸氢二钠0.8％，氯化钙0.8％，其余为水；

通过上述方法进行发酵培养，其中，菌株BS-122的发酵情况较好。下表是诱变株BS-122进行6批发酵的发酵周期和发酵酶活力，平均发酵活力为7309u/mL，最高达到7400u/mL。

批次

发酵周期(h)

发酵酶活力(u/mL)

1	70	7256
			2	70	7400
3	70	7359
			4	70	7190
5	70	7286
			6	70	7366

将突变菌株BS-122于2015年05月07日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.10786。

中温α-淀粉酶的提取与精制：发酵结束后，按发酵液体积加入0.6％的氯化钙，2％磷酸氢二钠及150PPM聚丙烯酰胺进行发酵液絮凝；加入3％珍珠岩助滤剂，使用板框压滤机进行压滤，滤液经超滤机超滤浓缩后加入稳定剂得到液体酶制剂。

所产中温α-淀粉酶的基本性质：(1)温度范围及温度稳定性：有效温度范围35～90℃，最适温度范围60～70℃，该酶在60～70℃条件下保存12h仍具有75％以上酶活(如图1所示)。(2)pH值范围及pH稳定性：有效pH范围4.5～8.0，最适pH值范围5.2～6.2，在pH5.2～6.2条件下保存12h后仍有85％以上酶活(如图2所示)。(3)金属离子对酶活性的影响：钙离子可提高酶的稳定性，没有钙离子，酶活力完全丧失。除钙离子外，锰离子和镁离子对该酶的活力也有明显的促进作用。

另本发明中温α-淀粉酶酶活测定的方法：按照中华人民共和国国家标准GB8275-2009。

实施例3：突变菌株的抗菌性能测试

菌体粗提液的制备：取菌株BS-122发酵至40h的发酵液8000r/min 4℃离心5min去菌体，取上清液经细菌过滤器(0.22μm)过滤后得到菌体粗提液。

利用牛津杯定量扩散法测试对测试真菌的抗性：将灭过菌的牛津杯放入直径为9cm的培养皿中央，在无菌条件下将融化的固体PDA培养基倒入平板内，待凝固后取出牛津杯，在培养皿边缘等距离接种3块(直径5mm)大小基本相同的指示菌，向培养基中牛津杯中加入180μl诱变菌或原始菌的粗提液。28℃培养，等菌丝长满平板后，测量抑菌圈直径。

利用牛津杯定量扩散法测试对测试细菌的抗性：将待试细菌在28℃培养12h，然后将病原细菌配成3×10⁸cfu/ml的菌悬液，取1ml菌悬液加入到融化并冷却至50℃左右的LB培养基中，混匀，迅速倒入已经放好牛津杯的平皿中，冷却后取出牛津杯，向牛津杯孔中加入180μl诱变菌或原始菌的粗提液。28℃培养48h，测量抑菌圈直径。

测定结果如下表所示，诱变菌BS-122比出发菌具有更强的抑菌效果。应用于发酵生产时，更不易染杂菌，具有更高的经济效益。

指示菌	原始菌抑菌圈直径	诱变菌BS-122抑菌圈直径
			大肠杆菌	++	+++
葡萄球菌	-	++
			米曲霉	+	+++
毕赤酵母	+	++

注：+表示抑菌直径<10mm，++表示10mm≦抑菌直径<20mm，+++表示20mm≦抑菌直径<30mm。

Claims

1.一株产中温α-淀粉酶的枯草芽孢杆菌，其特征在于，所述枯草芽孢杆菌的保藏编号为CGMCC No.10786。

2.权利要求1所述枯草芽孢杆菌的用途，其特征在于，所述枯草芽孢杆菌用于发酵产中温α-淀粉酶，发酵酶活力最高为7400u/mL。

3.利用权利要求1所述枯草芽孢杆菌制备中温α-淀粉酶的方法，包括如下步骤：

种子培养：将枯草芽孢杆菌CGMCC No.10786进行摇瓶培养制备种子液；摇瓶培养基组成为：可溶性淀粉2-3%，酵母膏0.2-0.5%，蛋白胨0.2-0.4%，氯化钙0.1-0.2%，其余为水，pH值6.5~6.7；培养条件为：温度37℃，转速200rpm，培养周期6h；

液体发酵：在50L发酵罐进行液体发酵，发酵培养基组成为：玉米粉5.5-10%，豆饼粉3-4.5%，可溶性淀粉2-4.2%，硫酸铵0.2-0.4%，磷酸氢二钠0.8-1.0%，氯化钙0.1-0.2%，其余为水，pH值6.5~6.7；培养条件为：接种量为6~10%，装液量60%，温度37℃，转速200~800rpm，罐压0.07 MPa，风量0.2~1.5vvm，培养周期70h；

补料方式：发酵10h时，流速10g/h/L恒速流加补料培养基；补料培养基组成为：葡萄糖40%，可溶性淀粉3%，硫酸铵0.2-0.4%，磷酸氢二钠0.8-1.0%，氯化钙0.8%，其余为水；

中温α-淀粉酶的提取与精制：发酵结束后，按发酵液体积加入0.6%的氯化钙，2％磷酸氢二钠进行发酵液絮凝；加入3%珍珠岩助滤剂，使用板框压滤机进行压滤，滤液经超滤机超滤浓缩后加入稳定剂得到液体酶制剂。