CN111635867B - 一种产油酵母及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种产油酵母及其应用，属于微生物技术领域。本发明所提供的德马特丝孢酵母(Trichosporon dermatis)，已于2020年5月21日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 2020139。本发明所提供的产油酵母可以廉价的木质纤维素类生物质的水解液为底物，同时利用水解液中的木糖和葡萄糖生产油脂，糖利用效率和生产强度提高，在分批补料发酵8天后，油脂产量可达31.33g/L，油脂含量60.83％。使得废弃的资源可再利用，且降低生产成本，具有广阔的应用前景。

Description

一种产油酵母及其应用
技术领域
本发明涉及一种产油酵母及其应用，属于微生物技术领域。
背景技术
某些微生物如酵母、细菌、霉菌和微藻能够利用碳水化合物、碳氢化合物和油脂作为碳源积累油脂，凡是油脂积累量超过细胞干重的20％的微生物，即可称为产油微生物。微生物油脂，特别是酵母所产油脂，其脂肪酸组成与植物油脂类似，以C16和C18系脂肪酸为主，如棕榈酸、硬脂酸、油酸等。微生物油脂可以代替昂贵的动植物油脂作为生产生物柴油的原料，对促进生物柴油大规模工业化生产具有积极作用。此外，产油微生物还具有发酵周期短、不受季节气候影响、碳源利用广等优点，具有良好的发展前景，将在未来生物柴油产业的发展中发挥重要作用。但培养微生物碳源成本高和微生物油脂产量低等问题限制了微生物油脂的发展。
我国是农业大国，每年大约会产生7亿吨亿秸秆类生物质，加上林业加工剩余物，我国每年产生的农林纤维类生物质剩余物高达20亿吨，但是我国并没有对这些生物质进行有效利用。生物质中含有丰富的碳水化合物(纤维素、半纤维素)，充分水解后能得到葡萄糖，可以满足产油酵母生长代谢对碳源的要求。利用这些含纤维质糖的水解液培养产油酵母，有可能大幅度降低微生物油脂的生产成本，为实现规模化生产微生物油脂提供可能。
此外，农林生物质水解液中不仅含有丰富的葡萄糖，还会得到木糖等单糖。然而，大多数微生物代谢过程中存在葡萄糖效应，即当培养基中含有葡萄糖和木糖时，会优先利用葡萄糖，只有当葡萄糖浓度较低时才开始利用木糖。这种机制会导致利用水解液发酵周期长，纤维素资源的利用率低，生产成本高等技术问题。因此，获得能够同时利用葡萄糖、木糖混合糖的高产油脂酵母，已经成为微生物油脂技术领域的重要方向。
发明内容
本发明旨在提供一种利用纤维质水解液培养高产油脂酵母发酵生产微生物油脂的方法。为克服上述油脂酵母产油不高的不足，以野生油脂酵母ZZ-46为出发菌，以一定浓度的浅蓝菌素和TTC作为筛选因子对突变体进行初筛，利用尼罗红荧光检测对初筛突变菌株进行高通量筛选，最终获得遗传性状稳定的高产油脂酵母。并且可直接利用纤维质水解液发酵生产油脂，使产油微生物培养更高效地利用木质纤维素来源的原料，提高微生物油脂生产的技术经济性，具有广阔的应用前景。
本发明提供的一株产油酵母(Trichosporon dermatis)，已于2020年5月21日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 2020139。
本发明提供了一种同时利用木糖和葡萄糖的方法，将所述产油酵母加入含有木糖和葡萄糖的体系中。
在本发明的一种实施方式中，将所述产油酵母在22～28℃发酵7～9天。
在本发明的一种实施方式中，将所述产油酵母加入发酵体系发酵产油。
在本发明的一种实施方式中，所述发酵体系中的碳源来自于木质纤维素类生物质原料的水解混合糖液。
在本发明的一种实施方式中，所述水解混合糖液的制备方法为：
(1)碱催化常压甘油有机溶剂预处理木质纤维素类生物质原料：称取90～150g干燥的木质纤维素类生物质原料装入1000～5000mL三口烧瓶中，再加入900～1500g甘油和0.2％(w/w)NaOH固体；将装有基质的三口烧瓶放入恒温加热套中，同时机械搅拌使基质混合均匀并200～250℃保持8～12min；反应结束后，将1000～1500mL自来水倒入烧瓶中使基质充分解离，然后用G1砂芯漏斗过滤，接着用1500～2000mL自来水对滤饼洗涤两次并抽滤，最终所得滤饼即是木质纤维素类生物质基质。将基质分为两部分，一部分晾晒至含水量45～55％，于2～4℃保存；另一部分于100～110℃烘箱烘至绝重；
(2)预处理后基质的酶解：称取含水量为45～55％的基质10～20g装于150～250mL圆底烧瓶中，加入2～5FPU·g-1干基的纤维素酶0.5～1.0mL(使用柠檬酸缓冲液将原酶液稀释至55～65FPU·g-1)以及添加剂PEG 4000 180～200mg、曲拉通X-100 350～400mg、茶皂素180～200mg、牛血清白蛋白180～200mg、木聚糖酶20～25mg，用柠檬酸缓冲液(50mM，pH 4.5～5.0)补至45～55mL；在酶解第10～12h、22～24h、34～36h时分别补充3.0～3.5g、2.5～3.0g、2.5～3.0g干基；在45～55℃下，酶解68～78h；酶解结束后8000～10000r·min-1离心4～6min。
在本发明的一种实施方式中，所述木质纤维素类生物质包括农业秸秆和林业加工剩余物类废弃物原料。
在本发明的一种实施方式中，将OD600为6～8的所述产油酵母以5％～10％的添加量加入发酵体系。
在本发明的一种实施方式中，所述发酵体系中的总糖含量为70～90g/L；氮源为大豆蛋白胨、NH4Cl或酵母提取物；碳/氮＝(273～373)∶1。
在本发明的一种实施方式中，所述发酵体系中发酵液的装液量为12％～20％。
在本发明的一种实施方式中，在发酵过程中进行补料，所述补料是补加终浓度10～20g/L为葡萄糖和木糖的混合物，混合物中葡萄糖和木糖的比例为(1～2)∶1。
在本发明的一种实施方式中，所述将所述产油酵母在22～28℃、pH6～8发酵7～9天。
本发明还保护所述产油酵母，或一种同时利用木糖和葡萄糖的方法，或一种提高油脂产量的方法在食品、医药、农业、化工领域生产油脂中的应用。
本发明的有益效果：
农林木质纤维素类生物质废弃物，是一种纤维素和半纤维素含量较高的可再生资源，来源广泛，成本低廉，但因其水解液中含有葡萄糖和木糖的混合糖，而混合糖培养微生物通常会出现葡萄糖效应，造成发酵周期长，效率低。本发明所获的高产油脂酵母，可以同时利用葡萄糖和木糖积累大量油脂，糖利用效率和生产强度提高，在分批补料发酵8天后，油脂产量可达31.33g/L，油脂含量60.83％。使得废弃的资源可再利用，且降低生产成本，具有广阔的应用前景。
生物材料保藏
本发明所提供的德马特丝孢酵母，分类命名为德马特丝孢酵母L7 Trichosporondermatis L7，已于2020年5月21日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M2020139，保藏地址为中国.武汉.武汉大学。
附图说明
图1为出发菌ZZ-46的同步耗糖曲线。
图2为菌株L7的同步耗糖曲线。
图3为菌株L7在5L发酵罐中分批补料发酵结果，补料碳源葡萄糖/木糖＝2∶1。
图4为菌株L7在5L发酵罐中分批补料发酵结果，补料碳源葡萄糖/木糖＝1∶1。
具体实施方式
YPD固体培养基：酵母提取物10g/L，蛋白胨20g/L，葡萄糖20g/L，琼脂15g/L。
YPD种子培养基：酵母提取物10g/L，蛋白胨20g/L，葡萄糖20g/L。
复筛发酵培养基：碳源：葡萄糖46.67g/L、木糖23.33g/L；氮源：酵母提取物0.75g/L、NH4Cl 0.1g/L；无机盐：MgCl2·6H2O 1g/L、Na2SO4 0.1g/L；磷酸缓冲液：KH2PO4 11.8g/L、K2HPO4·3H2O 3.7g/L；痕量元素：CaCl2·2H2O 40mg/L、FeSO4·7H2O 5.5mg/L、一水合柠檬酸5.2mg/L、ZnSO4·7H2O 1mg/L、MnSO4·H2O 0.76mg/L、18mol H2SO4 1.84×10-3mg/L，灭菌后备用。
实施例中使用的野生产油酵母菌株为德马特丝孢酵母Trichosporon.dermatisZZ-46，保藏于南阳市工业微生物菌种保藏中心，菌株编号NICC 30027。
甘蔗渣水解液的制备：
(1)碱催化常压甘油有机溶剂预处理甘蔗渣
称取100g干燥的甘蔗渣装入5000mL三口烧瓶中，再加入1000g甘油和0.2％(w/w)NaOH固体。将装有基质的三口烧瓶放入恒温加热套中，同时机械搅拌使基质混合均匀并240℃保持10min。反应结束后，将1500mL自来水倒入烧瓶中使基质充分解离，然后用G1砂芯漏斗过滤，接着用2000mL自来水对滤饼洗涤两次并抽滤，最终所得滤饼即是甘蔗渣基质。将基质分为两部分，一部分晾晒至含水量50％，于4℃保存；另一部分于105℃烘箱烘至绝重。
(2)预处理后基质的酶解
称取含水量为50％的基质16g装于250mL圆底烧瓶中，加入3FPU·g-1干基的纤维素酶0.875mL(使用柠檬酸缓冲液将原酶液稀释至60FPU·g-1)以及添加剂PEG 4000 192mg、曲拉通X-100 356mg、茶皂素193mg、牛血清白蛋白190mg、木聚糖酶21mg，用柠檬酸缓冲液(50mM，pH 4.8)补至50mL。在酶解第12h、24h、36h时分别补充3.5g、3g、3g干基。采用机械搅拌进行酶解，转速150r，温度50℃，酶解72h。酶解结束后10000r·min-1离心5min，取上清测定葡萄糖和木糖的浓度。
(3)甘蔗渣水解液的稀释
根据上述方法获得的甘蔗渣水解液混合糖(208g/L)的含量为：葡萄糖140g/L、木糖68g/L。依据发酵需要将该水解液用去离子水稀释3倍至70g/L，或稀释2.6倍至80g/L，并用NaOH将pH调至6。
实施例1：菌株的突变及筛选
(1)菌悬液的制备：保藏的野生产油酵母菌株经活化后，挑取单菌落于YPD种子培养基中，25℃，140r/min培养36h，取1mL菌液8000r离心5min收集菌体，以无菌生理盐水洗涤三次，在涡旋仪上混匀使菌体分散，调整菌悬液浓度为OD600＝1的菌悬液，备用；
(2)ARTP诱变：在超净工作台中取10ul野生油脂酵母ZZ-46菌悬液涂布在无菌金属载片上，将金属载片置于ARTP诱变仪操作室载物台的凹槽内，以氮气为工作气体，设定功率为100W，处理距离2mm，气体流量10L/min，处理时间140s；
(3)平板预筛选：将经过处理的菌悬液用无菌生理盐水稀释10-2稀释度，然后涂布于含有1.67×10-3％(w/v)的TTC和4.107×10-6mol/L浅蓝菌素的筛选平板上，置于25℃恒温培养箱中避光培养2天；
(4)高通量筛选：挑取筛选平板上大且红的单菌落于48孔板中培养(1mL培养基/孔)，在25℃、200r/min的摇床中培养2天，将100uL的菌液移到96孔板利用酶标仪检测OD600nm的吸光值表征细胞浓度。每个孔板中再添加5uL的尼罗红溶液，混匀后避光染色5min，用荧光强度表征油脂产量。检测的发射波长为485nm，吸收波长为595nm。荧光强度为：测出的样品荧光强度减去没有加尼罗红的样品背景荧光强度；
(5)DES诱变：通过ARTP诱变获得的高产突变菌株经过活化和种子液培养制得菌悬液，取OD600＝1的菌悬液2mL，加入2mL pH 7.0的磷酸缓冲液，再加入0.2mL 50％硫酸二乙酯-乙醇溶液，25℃条件下振荡70min。处理结束后，向反应混合物中加入25％的硫代硫酸钠1mL终止反应；
(6)DES诱变后的筛选：DES处理后的菌悬液按照步骤(3)和(4)进行平板预筛选和高通量筛选。
(7)摇瓶复筛：将初筛得到的高产菌株挑取单菌落接种于YPD种子培养基中，25℃，140r/min培养36h，按10％的接种量接种于50mL基础发酵培养基中，25℃，140r/min发酵7天。发酵液离心收集菌体，测定菌体生物量、发酵液油脂产量以及菌体油脂含量，结果如表1所示。
根据测定的相关指标，筛选出综合效果较好的菌株L7，并将其送至中国典型培养物保藏中心保藏。
表1复筛菌株生产性能
Figure BDA0002539907620000051
将菌株L7进行传代培养(培养方法同复筛)，检测了第一代到第七代的生物量、油脂产量和油脂含量。由表2可知，突变菌株的生物量、油脂产量和油脂含量都较稳定。结果表明，该菌株具有良好的遗传稳定性。
表2菌株L7传代稳定性
Figure BDA0002539907620000052
实施例2：利用甘蔗渣水解液发酵
甘蔗渣水解液发酵培养基组分：甘蔗渣水解液稀释至总糖70g/L，pH调至6，未添加其他氮源、无机盐等物质。
甘蔗渣水解液发酵：将菌株L7的单菌落接种于YPD种子培养基中，25℃、140r/min条件下培养36h，至OD600为7.6，然后按照10％的接种量接种50/250mL(即在250mL的锥形瓶装50mL发酵培养基)甘蔗渣水解液培养基中，140r/min，25℃发酵7天。
菌株发酵产油：将菌株L7，在甘蔗渣水解液发酵培养基中发酵，其生物量、油脂产量和油脂含量与出发菌株ZZ-46生物量、油脂产量和油脂含量分别为18.87g/L、9.26g/L和49.07％，出发菌株ZZ-46为15.21g/L、6.76g/L和44.46％，其中生物量、油脂产量相比出发菌株分别提高了24.06％、36.98％。
实施例3：利用甘蔗渣水解液作为碳源的发酵培养基
甘蔗渣水解液作为碳源的发酵培养基组分：甘蔗渣水解液稀释至总糖70g/L，pH调至6，添加氮源：酵母提取物0.75g/L、NH4Cl 0.1g/L；无机盐：MgCl2·6H2O 1g/L、Na2SO40.1g/L；磷酸缓冲液：KH2PO4 11.8g/L、K2HPO4·3H2O 3.7g/L；痕量元素：CaCl2·2H2O 40mg/L、FeSO4·7H2O 5.5mg/L、一水合柠檬酸5.2mg/L、ZnSO4·7H2O 1mg/L、MnSO4·H2O 0.76mg/L、18mol H2SO4 1.84×10-3mg/L。
菌株发酵产油：将菌株L7的单菌落接种于YPD种子培养基中，在25℃、140r/min条件下培养36h，至OD600为7.6，然后按照10％的接种量接种50/250mL甘蔗渣水解液培养基中，140r/min，25℃发酵7天。
菌株L7，在甘蔗渣水解液作为碳源的发酵培养基中发酵后，其生物量、油脂产量和油脂含量分别达到22.12g/L、11.18g/L和50.54％。
实施例4：菌株L7在摇瓶优化条件下发酵产油
发酵培养基组分：甘蔗渣水解液稀释至总糖80g/L，并且添加大豆蛋白胨作为氮源，保持C/N＝273∶1，此外还添加无机盐：MgCl2·6H2O 1g/L、Na2SO4 0.1g/L；磷酸缓冲液：KH2PO411.8g/L、K2HPO4·3H2O 3.7g/L；痕量元素：CaCl2·2H2O 40mg/L、FeSO4·7H2O 5.5mg/L、一水合柠檬酸5.2mg/L、ZnSO4·7H2O 1mg/L、MnSO4·H2O 0.76mg/L、18mol H2SO4 1.84×10-3mg/L。
菌株发酵产油：将菌株L7的单菌落接种于YPD种子培养基中，在22℃、140r/min条件下培养36h，至OD600为7.6，然后按照10％的接种量接种40/250mL甘蔗渣水解液培养基中，pH调至6，140r/min，22℃、发酵8天。
其生物量、油脂产量和油脂含量达到26.73g/L、14.00g/L和52.37％。
实施例5：摇瓶条件下补料分批发酵
具体实施条件参见实施例4，在此基础上，设计了四种补料方式：初始补料点为发酵的第二天，补料次数分别为2、3、4、5次，每隔一天补料一次，每次补料量为15g/L(补料为葡萄糖/木糖＝2∶1的混合糖)。
具体方式为：将菌株L7的单菌落接种于YPD种子培养基中，在25℃、140r/min条件下培养36h，至OD600为7.6，然后按照10％的接种量接种40/250mL甘蔗渣水解液培养基中，140r/min，22℃发酵，一共发酵9天。
补料2次：分别在第2天和第3天补料；
补料3次：分别在第2天、第3天和第4天补料；
补料4次：分别在第2天、第3天、第4天和第5天补料；
补料5次：分别在第2天、第3天、第4天、第5天和第6天补料。
每次补料添加终浓度为15g/L的混合糖(葡萄糖/木糖＝2∶1)。
发酵结果如表3，结果显示，补料两次所获得的油脂产量和油脂含量最大，分别是20.21g/L和57.93％，此时生物量为34.89g/L，较分批摇瓶培养分别提高44％、11％和31％。
表3不同补料次数下菌株L7的产油性能
Figure BDA0002539907620000071
实施例6：L7菌株在5L发酵罐发酵产油
(1)发酵罐分批发酵
具体发酵培养基组分和实施方式参见实施例4。
菌株发酵产油：将菌株L7的单菌落接种于YPD种子培养基中，在25℃、140r/min条件下培养36h，至OD600为7.6，然后按照10％的接种量接种2L甘蔗渣水解液培养基中，pH调至6，22℃、发酵5天；发酵过程中用2M NaOH调节pH，保持pH稳定在6，转速和DO相关联，保持DO在30％以上，发酵过程中添加有机硅消泡剂控制发酵过程中产生的泡沫。
发酵结果显示：生物量、油脂产量和油脂含量分别为33.33g/L、18.11g/L和54.34％
(2)发酵罐分批补料培养
采用葡萄糖/木糖＝2∶1，或葡萄糖/木糖＝1∶1的补料液进行补料发酵。
菌株发酵产油：将菌株L7的单菌落接种于YPD种子培养基中，在25℃、140r/min条件下培养36h，至OD600为7.6，然后按照10％的接种量接种2L甘蔗渣水解液培养基中，pH调至6，22℃进行发酵。发酵过程中用2M NaOH调节pH，保持pH稳定在6，转速和DO相关联，保持DO在30％以上。发酵过程中添加有机硅消泡剂控制发酵过程中产生的泡沫。
在第2和3天进行补料，补料为终浓度20g/L的混糖(葡萄糖/木糖＝2∶1，或葡萄糖/木糖＝1:1)。
在发酵至第8天时，油脂含量达到最大，其中当葡萄糖/木糖＝＝2∶1时，油脂产量能达到31.33g/L。
表4不同比例补料下菌株L7的产油性能
Figure BDA0002539907620000081
对比例1
具体实施方式参见实施例4，区别在于，将80g/L的总糖替换为50g/L、60g/L、70g/L、90g/L、100g/L，发酵后得到的生物量、油脂产量与油脂含量分见表5。
表5不同总糖含量下菌株L7的产油性能
Figure BDA0002539907620000082
对比例2
具体实施方式参见实施例4，区别在于，将氮源大豆蛋白胨替换为NH4Cl、(NH4)2SO4、酵母提取物、鱼粉蛋白胨、NH4Cl+酵母提取物，发酵后得到的生物量、油脂产量与油脂含量分见表6。
表6不同氮源条件下菌株L7的产油性能
Figure BDA0002539907620000083
对比例3
具体实施方式参见实施例4，区别在于，将C/N＝273∶1替换为123∶1、223∶1、323∶1、373∶1、423∶1、523∶1，发酵后得到的生物量、油脂产量与油脂含量分见表7。
表7不同C/N条件下菌株L7的产油性能
Figure BDA0002539907620000091
对比例4
具体实施方式参见实施例4，区别在于，将接种量10％替换为5％、7.5％、12.5％、15％，发酵后得到的生物量、油脂产量与油脂含量分见表8。
表8不同接种量下菌株L7的产油性能
Figure BDA0002539907620000092
对比例5
具体实施方式参见实施例4，区别在于，将装液量40/250mL替换为30/250mL、50/250mL、60/250mL、70/250mL，发酵后得到的生物量、油脂产量与油脂含量分见表9。
表9不同装液量下菌株L7的产油性能
Figure BDA0002539907620000093
对比例6
具体实施方式参见实施例4，区别在于，将pH 6替换为pH 4、pH 5、pH 7、pH 8，发酵后得到的生物量、油脂产量与油脂含量分见表10。
表10不同pH下菌株L7的产油性能
Figure BDA0002539907620000101
对比例7
具体实施方式参见实施例4，区别在于，将温度22℃替换为25℃、28℃、31℃，发酵后得到的生物量、油脂产量与油脂含量分见表11。
表11不同发酵温度下菌株L7的产油性能
Figure BDA0002539907620000102
对比例8
具体实施方式参见实施例4，区别在于，将发酵时间8天替换为7天、9天，发酵后得到的生物量、油脂产量与油脂含量分见表12。
表12不同发酵时间下菌株L7的产油性能
Figure BDA0002539907620000103
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (9)

1.一株产油酵母，分类命名为德马特丝孢酵母(Trichosporon dermatis)，已于2020年5月21日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 2020139。
2.一种同时利用木糖和葡萄糖产油脂的方法，其特征在于，将权利要求1所述产油酵母加入含有木糖和葡萄糖的体系中。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，将所述产油酵母在22～28℃发酵7～10天。
4.一种提高油脂产量的方法，其特征在于，将权利要求1所述产油酵母加入发酵体系发酵产油；所述发酵体系以葡萄糖和木糖为碳源。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，将OD600为6～8的所述产油酵母种子液以体积比5％～10％的添加量加入发酵体系。
6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述发酵体系中的总糖含量为70～90g/L；氮源为大豆蛋白胨、NH4Cl或酵母提取物；碳/氮＝(273～373)∶1。
7.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述发酵体系中发酵液的装液量为12％～20％，在22～28℃、pH6～8发酵7～10天。
8.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，在发酵过程中进行补料；所述补料是补加终浓度为10～20g/L的葡萄糖和木糖的混合物，混合物中葡萄糖和木糖的比例为(1～2)∶1。
9.权利要求1所述产油酵母在食品、医药、农业、化工领域生产油脂中的应用。
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