CN112375694B - 一株能够缓解高木糖利用与高鲁棒性拮抗的c6/c5共发酵酿酒酵母及其应用 - Google Patents

一株能够缓解高木糖利用与高鲁棒性拮抗的c6/c5共发酵酿酒酵母及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN112375694B
CN112375694B CN202011296559.5A CN202011296559A CN112375694B CN 112375694 B CN112375694 B CN 112375694B CN 202011296559 A CN202011296559 A CN 202011296559A CN 112375694 B CN112375694 B CN 112375694B
Authority
CN
China
Prior art keywords
xylose
saccharomyces cerevisiae
strain
fermentation
culture medium
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202011296559.5A
Other languages
English (en)
Other versions
CN112375694A (zh
Inventor
鲍晓明
赵建志
韦方卿
李洪兴
李在禄
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Qilu University of Technology
Original Assignee
Qilu University of Technology
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Qilu University of Technology filed Critical Qilu University of Technology
Priority to CN202011296559.5A priority Critical patent/CN112375694B/zh
Publication of CN112375694A publication Critical patent/CN112375694A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN112375694B publication Critical patent/CN112375694B/zh
Priority to US17/401,688 priority patent/US11359177B2/en
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/01—Preparation of mutants without inserting foreign genetic material therein; Screening processes therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/14—Fungi; Culture media therefor
    • C12N1/16—Yeasts; Culture media therefor
    • C12N1/18—Baker's yeast; Brewer's yeast
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/14—Fungi; Culture media therefor
    • C12N1/16—Yeasts; Culture media therefor
    • C12N1/18—Baker's yeast; Brewer's yeast
    • C12N1/185—Saccharomyces isolates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/36—Adaptation or attenuation of cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/02—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group
    • C12P7/04—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group acyclic
    • C12P7/06—Ethanol, i.e. non-beverage
    • C12P7/08—Ethanol, i.e. non-beverage produced as by-product or from waste or cellulosic material substrate
    • C12P7/10—Ethanol, i.e. non-beverage produced as by-product or from waste or cellulosic material substrate substrate containing cellulosic material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P2203/00—Fermentation products obtained from optionally pretreated or hydrolyzed cellulosic or lignocellulosic material as the carbon source
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/645—Fungi ; Processes using fungi
    • C12R2001/85—Saccharomyces
    • C12R2001/865—Saccharomyces cerevisiae

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开了一株能够缓解高木糖利用与高鲁棒性拮抗的C6/C5共发酵酿酒酵母，命名为酵酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)6M‑15，已于2020年08月17日保藏在“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，保藏编号为CGMCC No.20436。本发明还公开了所述酿酒酵母在以秸秆类木质纤维素生物质水解液为原料发酵生产二代燃料乙醇中的应用。实验证实本发明的菌株在能够耐受多重抑制物的同时，还具备了C6/C5高效共发酵能力，并且能够消耗完全部的葡萄糖和木糖生成乙醇，其糖醇转化率为0.43g g‑1。本发明的菌株和采用的筛选策略为进一步选育发酵性能更优的二代燃料乙醇生产的酿酒酵母菌株提供了技术参考与基础。

Description

一株能够缓解高木糖利用与高鲁棒性拮抗的C6/C5共发酵酿 酒酵母及其应用
技术领域
本发明涉及一种C6/C5共发酵酿酒酵母及其应用，尤其涉及一株能够缓解高木糖利用与高鲁棒性拮抗的C6/C5共发酵酿酒酵母菌株及其应用，属于生物技术领域。
背景技术
木质纤维素类生物质是地球上最丰富的可再生能源，年产量超过1013吨。随着石化资源的日益枯竭和环境污染问题，发展以木质纤维素类生物质为原料的生物基能源技术是实现能源转型的重要措施之一，也是世界范围内新能源格局的重要部分。以木质纤维类生物质为原料，通过微生物细胞工厂转化生产清洁液体燃料和化学品，是生物基能源技术的重要路径。木质纤维素因其化学结构坚固致密难以被微生物直接利用，因而需对原料进行必要的水解处理以释放微生物可直接利用的糖类组分。然而，木质纤维素水解液的化学成分较为复杂，同时含有六碳糖、五碳糖等糖类组分，以及弱酸类、呋喃类和酚类等非糖组分抑制物。其中，非糖组分抑制物通常对发酵微生物的生长和代谢具有抑制作用。因此，依据木质纤维素水解液组分特点，发酵微生物在性能上必须具备两个特点，即高效的六碳糖/五碳糖共发酵能力和较高的抑制物鲁棒性。
二代燃料乙醇是以木质纤维素为原料生产的乙醇，是国际上公认的替代化石能源的理想液体燃料之一。作为乙醇生产的主要发酵微生物，酿酒酵母因其强大的己糖发酵能力、鲁棒性以及成熟的基因操作技术，被认为是转化木质纤维素水解产物生产燃料乙醇的最具潜力的工业菌株之一。然而，野生型酿酒酵母由于缺乏戊糖(例如木糖)代谢的关键途径，只有极其微弱的戊糖代谢能力。木糖是木质纤维素类生物质中含量第二高的戊糖，其能否高效利用是提高原料底物转化效率和燃料乙醇经济盈利性的关键环节之一。为了提高酿酒酵母的木糖利用能力，国内外科学家开展了大量的工作，主要包括：1)木糖代谢起始途径的异源引入，即木糖还原酶-木糖醇脱氢酶(XR-XDH)途径和木糖异构酶(XI)途径；2)木糖代谢内源途径代谢优化；3)细胞内辅因子代谢平衡优化；4)特异性高效木糖转运蛋白筛选；5)适应性进化工程等。经过研究者们的不懈努力，酿酒酵母的纯品木糖代谢能力已基本达到葡萄糖的代谢水平。虽然酿酒酵母具备了葡萄糖和木糖共利用的能力，但其对木质纤维素水解液中抑制物的抗性仍然较低，而抑制物鲁棒性亦是影响微生物生长和代谢效率的重要因素。近十年来，科学家通过改造细胞内抑制物抗性响应途径等理性改造策略，以及随机突变和适应性进化等非理性策略，在一定程度上提高了细胞对单一抑制物的抗性。然而，对存在于木质纤维素水解液中多种类抑制物的协同抑制效应，即使较低浓度的混合抑制物亦可表现出较强的抑制作用。在研究过程中，包括申请人团队在内的国内外研究者发现，酿酒酵母在提高抑制物抗性的同时，其木糖代谢能力出现了不同程度的下降，似乎这两种性状存在此消彼长的拮抗关系。因此，在细胞内同时获得高木糖代谢和高鲁棒性这两种特性对选育二代燃料乙醇生产菌株带来了不小的挑战。
申请人在前期工作中，基于牛瘤胃宏基因组中筛选得到高活性木糖异构酶和来自Meyerozyma guilliermondii的特异性木糖转运蛋白MGT05196N360F，通过理性代谢工程及适应性进化工程构建了一株葡萄糖/木糖高效共利用重组酿酒酵母菌株，但其在含较高抑制物浓度的玉米秸秆水解液中鲁棒性较差。申请人实验发现在提高该菌株抑制物鲁棒性的研究中，鲁棒性提高的同时，木糖代谢明显下降，上面提到的拮抗关系再次出现。经检索，针对菌株中木糖代谢和鲁棒性之间的拮抗性，在酿酒酵母中目前有关消除或缓解这一拮抗性的专利和相关文献尚未见报道。
发明内容
针对目前二代燃料乙醇生产酿酒酵母菌株对木质纤维素水解液中混合抑制物抗性不足，以及菌株抑制物抗性与木糖代谢能力之间的拮抗现象，本发明要解决的问题是提供一株能够缓解高木糖利用与高鲁棒性拮抗的C6/C5共发酵酿酒酵母菌株及其应用。
本发明所述的能够缓解高木糖利用与高鲁棒性拮抗的C6/C5共发酵酿酒酵母，其特征在于：该菌株同时具备抑制物高鲁棒性和高木糖利用的特性，命名为酵酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)6M-15，菌株已于2020年08月17日保藏在“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)”，保藏编号为CGMCC No.20436。
上述酵酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)6M-15是通过常温常压等离子体(ARTP)迭代诱变，并结合在高毒性(含多种抑制物)玉米秸秆预处理液和纯木糖培养基中交替驯化和筛选获得的，具体技术步骤如下：
(1)出发菌株在高毒性玉米秸秆预处理液中的生长测试：
出发菌株为申请人实验室前期构建的C6/C5共发酵酿酒酵母菌株LF1，该菌株已申报专利，专利申请号：201510747241.7，保藏号：CGMCC No.11331。
高毒性玉米秸秆预处理原液(以下简称预处理液)中主要糖组分为葡萄糖和木糖(浓度分别为14g L-1和43g L-1)；主要抑制物为乙酸、5-羟甲基糠醛、糠醛及总酚类化合物(浓度分别为3.5g L-1、2.7g L-1、0.3g L-1和3.3g L-1)。
在YP培养基中添加不同比例的预处理液，考察其对菌株生长的影响。结果显示，预处理液添加比例为50％(v/v)时，菌株生长受到明显抑制，说明50％(v/v)预处理液中抑制物浓度能够对细胞造成显著的毒性。基于此，确定50％(v/v)预处理液的添加量可以作为后续筛选抑制物鲁棒性提高菌株的选择压力条件。
(2)ARTP诱变处理：
首先，绘制出发菌株LF1经ARTP诱变的致死率曲线。然后，根据致死率对LF1进行诱变处理，诱变后的菌体置于YPD培养基中孵育30min恢复生长。最后，将菌体置于含50％(v/v)预处理液的YP培养基中连续驯化培养30天。
(3)鲁棒性显著提高菌株的筛选：
取适量上述驯化后的菌体培养液，无菌水洗涤后涂布到含50％(v/v)预处理液的YP固体培养基进行培养。挑选直径较大的单菌落若干，通过Bioscreen全自动生长曲线分析仪测试上述菌落在50％(v/v)预处理液培养基中的生长能力。对生长较快的菌株于40mL的相同培养基条件下进行复筛，筛选得到鲁棒性最高的菌株，命名为LF1-6。
(4)多轮ARTP迭代诱变缓解木糖利用和鲁棒性之间的拮抗现象：
筛选得到的菌株LF1-6鲁棒性显著提高，但其木糖利用能力下降。为恢复其木糖利用能力，通过多轮ARTP迭代诱变，在纯木糖固体培养基中厌氧培养，挑选生长较快的单菌落测试其木糖利用能力，最终获得一株明显缓解木糖利用与鲁棒性之间拮抗现象的C6/C5共发酵酿酒酵母菌株，命名为酵酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)6M-15。
本发明所述能够缓解高木糖利用与高鲁棒性拮抗的C6/C5共发酵酿酒酵母在以秸秆类木质纤维素生物质水解液为原料发酵生产二代燃料乙醇中的应用。
上述的应用中，所述以秸秆类木质纤维素生物质水解液为原料摇瓶发酵生产二代燃料乙醇的方法是：
用玉米秸秆水解液代替YP培养基中的水，使发酵培养基中的组分及浓度是：20gL-1蛋白胨、10g L-1酵母粉、50.23±0.39g L-1葡萄糖、25.62±0.47g L-1木糖、0.93±0.13gL-1纤维二糖、1.03±0.31g L-1半乳糖、8.09±0.24g L-1阿拉伯糖、4.36±0.28g L-1乙酸、1.09±0.25g L-1 5-羟甲基糠醛、0.35±0.06g L-1糠醛、4.78±0.13g L-1总酚类化合物，pH3.5±0.2；发酵条件：培养温度为30±2℃，150mL限氧瓶中装有40mL培养基的加料比例，摇床转速为200±20rpm，橡胶塞封口，插上注射器针头控制限氧条件，初始接种OD值为10，限氧条件培养96±10小时消耗完全部葡萄糖和木糖，发酵产物离心过滤即得到含乙醇的上清液。
进一步优选以秸秆类木质纤维素生物质水解液为原料摇瓶发酵生产二代燃料乙醇的方法是：
用玉米秸秆水解液代替YP培养基中的水，使发酵培养基中的组分及浓度是：20gL-1蛋白胨、10g L-1酵母粉、50g L-1葡萄糖、25g L-1木糖、0.93g L-1纤维二糖、1.03g L-1半乳糖、8.09g L-1阿拉伯糖、4.36g L-1乙酸、1.09g L-15-羟甲基糠醛、0.35g L-1糠醛、4.78g L-1总酚类化合物，pH 3.5±0.1；发酵条件：培养温度为30℃，150mL限氧瓶中装有40mL培养基的加料比例，摇床转速为200rpm，橡胶塞封口，插上注射器针头控制限氧条件，初始接种OD值为10，限氧条件培养96±1小时消耗完全部葡萄糖和木糖，发酵产物离心过滤得到含乙醇的上清液。
实验证实：消耗完全部葡萄糖和木糖，糖醇转化率为0.43g g-1，达到理论值的85％。
本发明公开了一株能够缓解高木糖利用与高鲁棒性拮抗的酿酒酵母菌株6M-15，其在高毒性玉米秸秆水解液中表现出优良的发酵性能，具有应用于二代燃料乙醇工业化生产的极大潜力。本发明的创新之处在于，基于二代燃料乙醇生产菌株选育过程中凸显的高木糖利用与高鲁棒性之间的拮抗现象，采用新兴的ARTP诱变育种技术，同时结合厌氧筛选策略，经过多轮迭代诱变及筛选，最终使得菌株能够耐受多重抑制物的同时，还具备了C6/C5高效共发酵能力，并且实验证实本发明提供的菌株6M-15能够消耗完全部的葡萄糖和木糖生成乙醇，其糖醇转化率为0.43g g-1。本发明的菌株和采用的筛选技术策略为进一步选育发酵性能更优的二代燃料乙醇生产的酿酒酵母菌株提供了技术参考与基础。
附图说明
图1出发菌株LF1在高毒性玉米秸秆预处理液YP培养基中的生长情况。
图2出发菌株LF1经ARTP诱变的致死率。
图3Bioscreen筛选高抗性突变菌株。
图4不同菌株在含有50％(v/v)预处理液的YP培养基和40g L-1的YPX培养基中限氧发酵性能。(a)LF1和LF1-6在含50％(v/v)预处理液的YP培养基中的生长。LF1和LF1-6在YPX培养基(40g L-1木糖)中的生长(b)，木糖消耗(c)和乙醇产量(d)。
图5出发菌株LF1和突变菌株LF1-6M，6M-15在YPX培养基(40g L-1木糖)中的限氧发酵性能。(a)菌株生长，(b)木糖代谢，(c)乙醇产量。
图6出发菌株LF1(a)和突变菌株6M-15(b)在高浓度混合糖(80g L-1葡萄糖和40gL-1木糖)中的限氧发酵性能。
图7是出发菌株LF1(a)和突变菌株6M-15(b)在未脱毒的玉米秸秆水解液YP培养基中的限氧发酵性能。
具体实施方式
下面结合具体附图和实施例对本发明内容进行详细说明。如下所述例子仅是本发明的较佳实施方式而已，应该说明的是，下述说明仅仅是为了解释本发明，并非对本发明作任何形式上的限制，凡是依据本发明的技术实质对实施方式所做的任何简单修改，等同变化与修饰，均属于本发明技术方案的范围内。
下述实施例中，所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均从商业途径得到。
实施例1微生物培养基及基础培养条件确定
(1)酿酒酵母培养基
YP培养基：20g L-1蛋白胨，10g L-1酵母粉；YPD培养基：YP培养基添加20g L-1葡萄糖；YPX培养基：YP培养基添加40g L-1木糖；YPGX培养基：YP培养基添加40g L-1木糖，80g L-1葡萄糖。含预处理液YP培养基：根据实验需要添加不同比例的玉米秸秆预处理液；全水解液YP培养基：用水解液代替YP培养基的水。相应的固体培养基添加20g L-1琼脂粉。
(2)玉米秸秆预处理液及水解液的制备
将绝干的玉米秸秆粉粹成直径小于1mm的颗粒，100g秸秆颗粒与0.5％的稀硫酸按照固液比1：5混合，转入不锈钢管式反应器，加热至180℃反应40min，将反应物混合物离心后，所得上清液即为玉米秸秆预处理液(以下简称预处理液)。
将上述反应物混合物转移至摇瓶中，NaOH调节pH至4.8，添加纤维素酶20FPU/g进行酶解，反应温度为50℃，转速时间为200rpm，酶解48h，离心所得上清液即为玉米秸秆水解液(以下简称水解液)。
预处理液和水解液主要糖组份及抑制物浓度如表1所示。
表1玉米秸秆预处理液和水解液成分表
Figure BDA0002785521760000051
(3)基础培养条件
限氧摇瓶培养条件：培养温度为30℃，150mL限氧瓶中装有40mL培养基，摇床转速为200rpm，橡胶塞封口，插上注射器针头控制限氧条件，作三个平行发酵实验，每4h取样一次。
Bioscreen全自动生长曲线分析仪培养条件：培养体积为200μL，起始接种量OD600为0.2，培养温度为30℃，作三个平行发酵实验，每0.5h自动取样检测OD值。
实施例2原料组分及发酵产物检测方法确定
通过高效液相色谱法测定预处理液、水解液以及乙醇发酵时底物、产物的浓度。
取1mL样品，高速离心(13000r/min、5min)去除样品中的杂质或者菌体，取上清液用0.22μm微孔滤膜过滤，用高效液相色谱仪系统Waters e2695测定其成分含量。标样浓度：葡萄糖49.998g L-1、木糖48.891g L-1、纤维二糖9.857g L-1、半乳糖6.029g L-1、阿拉伯糖6.074g L-1、5-羟甲基糠醛0.630g L-1、糠醛1.042g L-1。色谱条件：①葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、纤维二糖、半乳糖、乙酸和乙醇使用HPX-87H离子排阻色谱柱(Bio-Rad Aminex)进行分析，该色谱柱在45℃下以5mM H2SO4作为流动相，使用Waters 2414RI示差折光检测器；②糠醛和5-HMF使用WondaSil C18色谱柱(GL Sciences)在40℃下使用40％甲醇作为流动相，使用Waters 2998PDA紫外检测器。预处理液中总酚的含量通过福林试剂法检测，以香草醛为标准品，与Folin—Ciocalteu试剂反应，于725nm检测吸收值。
实施例3能够缓解高木糖利用与高鲁棒性拮抗的C6/C5共发酵酿酒酵母菌株的选育
出发菌株为申请人实验室前期构建的C6/C5共发酵酿酒酵母菌株LF1，该菌株已申报专利，专利申请号：201510747241.7，保藏号：CGMCC No.11331。通过常温常压等离子体(ARTP)迭代诱变，并结合在高毒性(含多种抑制物)玉米秸秆预处理液和纯木糖培养基中交替驯化和厌氧筛选，以期获得能够缓解高木糖利用与高鲁棒性拮抗的C6/C5共发酵酿酒酵母菌株，具体技术步骤如下：
(1)确定显著抑制出发菌株生长的高毒性玉米秸秆预处理液的浓度
测试培养基中预处理液的添加量对出发菌株的生长影响。酿酒酵母YP培养基分别添加0％(对照)、10％、30％、50％(v/v)的预处理液，出发菌株LF1的初始接种OD600为0.2，接种体积40mL，培养温度为30℃，转速200rpm，培养24h。结果如图1所示，预处理液添加比例为50％(v/v)时，菌株生长受到明显抑制。基于此，确定将培养基中50％(v/v)预处理液添加量作为后续实验中筛选鲁棒性提高菌株的压力条件。
(2)ARTP诱变处理
①测试不同辐射时间对出发菌株致死率的影响。挑取出发菌株单菌落培养至对数生长中期，离心收集菌液，用无菌水洗涤2～3次后，适量稀释制成OD600值在0.6～0.8的菌悬液，取10μL菌悬液涂布在无菌金属载片上，在ARTP诱变育种仪中设置0s(对照)、15s、30s、45s四个时间梯度，每个梯度做三个平行样品，进行诱变处理。全部样品处理完毕，用无菌镊子将载片分别放至装有1mL无菌水的EP管中，使用振荡器振荡5min，把附着在载片上的细胞洗脱到无菌水中，形成新的菌悬液，并浓缩至100μL，全部涂布YPD平板，30℃培养，待长出菌落后，根据实验组与对照组的菌落数量差异，计算致死率。
②确定诱变条件。在120W的功率、气体流量10SLM的条件下，照射15s时，出发菌株的致死率为97.2％，照射30s时没有菌株存活(见图2)，因此，以15s诱变时间、120W功率、10SLM气量作为ARTP诱变育种的条件。
③根据②中确定的诱变条件，诱变后的出发菌株置于YPD培养基中孵育30min恢复生长。最后，将菌体置于含50％(v/v)预处理液的YP培养基中驯化培养。以细胞生物量倍增为转接指标，经过约30天的转接驯化培养，细胞生物量倍增时间显著缩短并维持不变，将细胞涂布在含50％(v/v)预处理液的YP固体培养基中分离单菌落。
(3)鲁棒性显著提高菌株的筛选
将(2)③中的细胞涂布在含50％(v/v)预处理液的YP固体培养基中，30℃培养，菌落长出后，挑选相对直径较大的菌落，通过Bioscreen全自动生长曲线分析仪(Oy GrowthCurves Ab Ltd,Helsinki,Finland)测试突变株在50％(v/v)预处理液YP培养基中的生长性能(见图3)，培养体积为200μL，起始接种量OD600为0.2，培养温度为30℃。对生长较快的菌株于40mL相同培养基条件下进行复筛，筛选得到鲁棒性最高的菌株，命名为LF1-6。
在50％(v/v)预处理液培养基中分批发酵测试，发酵条件如下所述：培养温度为30℃，150mL限氧瓶中装有40mL 50％(v/v)预处理液培养基，摇床转速为200rpm，橡胶塞封口，插上注射器针头控制限氧条件，初始接种OD值为0.2，每4h取一次样，发酵实验重复三次，数据取平均值进行计算。结果显示(见图4a)，LF1-6的鲁棒性显著提升，而出发菌株几乎不长。但是在40g L-1的木糖培养基中，突变株LF1-6的木糖利用速率(见图4c)和乙醇生成速率(见图4d)均明显低于出发菌株LF1，高木糖利用与高鲁棒性之间呈现拮抗关系。将突变株LF1-6在50％(v/v)预处理液培养基和纯木糖培养基中交替驯化，筛选得到一株木糖代谢能力提高的菌株，命名为LF1-6M，其在相同条件的木糖培养基中发酵20h，其OD600提升了44.23％，木糖利用率提升了6.58％，但与出发菌株LF1的木糖利用率相比，差距依然很大(42.4％vs95.6％)，拮抗问题没能有效解决(见图5a和b)。
(4)多轮迭代ARTP诱变和厌氧筛选缓解木糖利用和鲁棒性拮抗的菌株
针对上述拮抗问题，以LF1-6M为出发菌株，进行多轮迭代ARTP诱变，在纯木糖固体YPX培养基中厌氧培养，并在含有50％(v/v)预处理液的YP培养基和YPX培养基中交替驯化，以生长OD600值为检测指标，驯化至细胞生物量倍增时间显著缩短并维持不变。取适量最终菌悬液涂布到含有50％的YP固体培养基上，待菌株长出后挑选直径较大的菌落测试木糖利用能力和鲁棒性，最终筛选得到突变株鲁棒性和木糖代谢同步提高的菌株，命名为酵酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)6M-15，菌株已于2020年08月17日保藏在“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)”，保藏编号为CGMCC No.20436。
实施例4不同突变株在YPX和YPGX培养基中的发酵性能及乙醇产量比较
(1)培养基：YPX培养基：20g L-1蛋白胨，10g L-1酵母粉，40g L-1木糖；YPGX培养基：20g L-1蛋白胨，10g L-1酵母粉，80g L-1葡萄糖，40g L-1木糖。
(2)菌种活化：挑取待测菌株单菌落接种到5mL YPX液体培养基，30℃，200rpm培养24小时，再转接至10mL YPX液体培养基二次活化12小时。将活化菌种分别接种至盛有40mLYPX和YPGX液体培养基的150mL的三角瓶中发酵培养。
(3)发酵条件：培养温度为30℃，150mL限氧瓶中装有40mL培养基，摇床转速为200rpm，橡胶塞封口，插上注射器针头控制限氧条件，初始接种OD值为0.2，每4h取样一次检测OD值，样品离心过滤得上清液，采用实施例2所述HPLC方法检测糖组分和发酵产物的变化，每菌株作三个平行实验。
发酵结果显示：
在纯木糖YPX培养基中，突变株的木糖利用能力逐渐提升(见图5)，LF1≈6M-15>LF1-6M，发酵24h时，6M-15能利用全部的木糖，基本达到了出发菌株LF1的木糖代谢水平，且乙醇产量最高点的糖醇转化率达到理论值的90.98％。进一步地，在80g L-1葡萄糖和40g L-1木糖的混糖YPGX培养基中，6M-15展现出优良的发酵性能(见图6)。6M-15在28h内可以消耗完全部糖组分，相比出发菌株LF1，发酵时间缩短了8h(28h vs.36h)，乙醇浓度最高可达54.98g L-1，糖醇转化率达到理论值的91.37％。从上述结果来看，通过多轮迭代ARTP诱变和厌氧筛选，高鲁棒性菌株的木糖代谢能力得到恢复。
实施例5出发菌株LF1和突变株6M-15在玉米秸秆水解液YP培养基中的乙醇发酵性能
(1)玉米秸秆水解液YP培养基：用玉米秸秆水解液代替YP培养基(20g L-1蛋白胨，10g L-1酵母粉)中水。培养基中主要糖组分及浓度：50g L-1葡萄糖和25g L-1木糖，以及主要抑制物及浓度：4.36g L-1乙酸、1.09g L-15-羟甲基糠醛、0.35g L-1糠醛及4.78g L-1总酚类化合物，pH～3.5。
(2)菌种活化过程如实施例4所述。
(3)发酵条件如实施例4所述，初始接种OD值为10，每12h取样一次，检测方法如实施例2所述。
发酵结果显示：
在低pH(～3.5)、含多种较高浓度抑制物的全水解液YP培养基发酵过程中，出发菌株LF1的生长受到了严重抑制，葡萄糖代谢速率缓慢，木糖几乎不被利用，发酵结束时，LF1只利用了50％的葡萄糖，且仅产生大约7.5g L-1的乙醇。而突变株6M-15的生长几乎不受影响，葡萄糖利用速率较快，24h即可利用全部葡萄糖，同时木糖同步利用，发酵结束时，6M-15可以消耗完全部的葡萄糖和木糖，乙醇产量为30.53g L-1，糖醇转化率为0.43g g-1，达到了理论值的85％(见图7)。
当秸秆类生物水解液中乙酸、5-羟甲基糠醛、糠醛以及总酚化合物等主要抑制物浓度不高于上述浓度，以及pH不低于3.5时，该菌株生长优势明显，葡萄糖和木糖转化产乙醇得率不低于0.43g g-1。
从上述结果来看，本发明最终筛选得到的突变株6M-15同时具备了高木糖利用速率和对水解液中抑制物高鲁棒性的特性，显著缓解了以木质纤维类生物质水解液为原料生产二代燃料乙醇的酿酒酵母菌株选育过程中凸显的高木糖利用与高鲁棒性拮抗的问题。总起来讲，本发明选育的6M-15菌株(保藏编号为CGMCC No.20436)在具备C6/C5共发酵能力的同时，还具备抵抗木质纤维类生物质水解液中多重抑制物的能力，是一株应用于二代燃料乙醇工业化生产的潜力菌株，同时也为进一步选育发酵性能更优的二代燃料乙醇生产的酿酒酵母菌株提供了优良的底盘细胞。
实施例6本发明所述能够缓解高木糖利用与高鲁棒性拮抗的C6/C5共发酵酿酒酵母在以秸秆类木质纤维素生物质水解液为原料发酵生产二代燃料乙醇中的应用。
其中，所述以秸秆类木质纤维素生物质水解液为原料摇瓶发酵生产二代燃料乙醇的方法是：
用玉米秸秆水解液代替YP培养基中的水，使发酵培养基中的组分及浓度是：20gL-1蛋白胨、10g L-1酵母粉、50g L-1葡萄糖、25g L-1木糖、0.93g L-1纤维二糖、1.03g L-1半乳糖、8.09g L-1阿拉伯糖、4.36g L-1乙酸、1.09g L-15-羟甲基糠醛、0.35g L-1糠醛、4.78g L-1总酚类化合物，pH 3.5±0.1；发酵条件：培养温度为30℃，150mL限氧瓶中装有40mL培养基的加料比例，摇床转速为200rpm，橡胶塞封口，插上注射器针头控制限氧条件，初始接种OD值为10，限氧条件培养96±1小时消耗完全部葡萄糖和木糖，发酵产物离心过滤得到含乙醇的上清液。
具体操作如实施例4和5所述。

Claims (4)

1.一株能够缓解高木糖利用与高鲁棒性拮抗的C6/C5共发酵酿酒酵母，其特征在于：该菌株同时具备抑制物高鲁棒性和高木糖利用的特性，命名为酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）6M-15，菌株已于2020年08月17日保藏在“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，保藏编号为CGMCC No. 20436。
2.权利要求1所述能够缓解高木糖利用与高鲁棒性拮抗的C6/C5共发酵酿酒酵母在以秸秆类木质纤维素生物质水解液为原料发酵生产二代燃料乙醇中的应用。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述以秸秆类木质纤维素生物质水解液为原料发酵生产二代燃料乙醇的方法是：
配方为20 g L- 1蛋白胨、10 g L- 1酵母粉的培养基命名为YP培养基，用玉米秸秆水解液代替YP培养基中的水，使发酵培养基中的组分及浓度是：20 g L- 1蛋白胨、10 g L- 1酵母粉、50.23±0.39 g L-1葡萄糖、25.62±0.47 g L-1木糖、0.93±0.13 g L-1纤维二糖、1.03±0.31 g L-1半乳糖、8.09±0.24 g L-1阿拉伯糖、4.36±0.28 g L-1乙酸、1.09±0.25 gL-1 5-羟甲基糠醛、0.35±0.06 g L-1糠醛、4.78±0.13g L-1总酚类化合物，pH 3.5±0.2；发酵条件：培养温度为30±2℃，150 mL限氧瓶中装有40 mL培养基的加料比例，摇床转速为200±20 rpm，橡胶塞封口，插上注射器针头控制限氧条件，初始接种OD值为10，限氧条件培养96±10小时消耗完全部葡萄糖和木糖，发酵产物离心过滤即得到含乙醇的上清液。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述以秸秆类木质纤维素生物质水解液为原料发酵生产二代燃料乙醇的方法是：
配方为20 g L- 1蛋白胨、10 g L- 1酵母粉的培养基命名为YP培养基，用玉米秸秆水解液代替YP培养基中的水，使发酵培养基中的组分及浓度是：20 g L- 1蛋白胨、10 g L- 1酵母粉、50 g L-1葡萄糖、25 g L-1木糖、0.93 g L-1纤维二糖、1.03 g L-1半乳糖、8.09g L-1阿拉伯糖、4.36 g L-1乙酸、1.09 g L-15-羟甲基糠醛、0.35 g L-1糠醛、4.78 g L-1总酚类化合物，pH 3.5±0.1；发酵条件：培养温度为30℃，150 mL限氧瓶中装有40 mL培养基的加料比例，摇床转速为200 rpm，橡胶塞封口，插上注射器针头控制限氧条件，初始接种OD值为10，限氧条件培养96±1小时消耗完全部葡萄糖和木糖，发酵产物离心过滤得到含乙醇的上清液。
CN202011296559.5A 2020-11-18 2020-11-18 一株能够缓解高木糖利用与高鲁棒性拮抗的c6/c5共发酵酿酒酵母及其应用 Active CN112375694B (zh)

Priority Applications (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202011296559.5A CN112375694B (zh) 2020-11-18 2020-11-18 一株能够缓解高木糖利用与高鲁棒性拮抗的c6/c5共发酵酿酒酵母及其应用
US17/401,688 US11359177B2 (en) 2020-11-18 2021-08-13 C6/C5 co-fermented Saccharomyces cerevisiae capable of relieving antagonism between high xylose utilization and high robustness and application thereof

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202011296559.5A CN112375694B (zh) 2020-11-18 2020-11-18 一株能够缓解高木糖利用与高鲁棒性拮抗的c6/c5共发酵酿酒酵母及其应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN112375694A CN112375694A (zh) 2021-02-19
CN112375694B true CN112375694B (zh) 2021-06-18

Family

ID=74585828

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202011296559.5A Active CN112375694B (zh) 2020-11-18 2020-11-18 一株能够缓解高木糖利用与高鲁棒性拮抗的c6/c5共发酵酿酒酵母及其应用

Country Status (2)

Country Link
US (1) US11359177B2 (zh)
CN (1) CN112375694B (zh)

Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114561377B (zh) * 2022-02-24 2023-05-19 齐鲁工业大学 一株高鲁棒性高木糖利用且能水解寡糖的三价性酿酒酵母工业菌株及其应用
CN115232757B (zh) * 2022-06-22 2023-05-23 首都师范大学 酿酒酵母菌株、发酵菌株及其构建方法和生物乙醇生产方法
CN116223733B (zh) * 2023-01-04 2023-09-15 齐鲁工业大学(山东省科学院) 一种c5/c6共利用酿酒酵母木糖代谢与鲁棒性之间拮抗程度的定量表征方法
CN116496917A (zh) * 2023-03-24 2023-07-28 湖北大学 一种高效共利用木糖和葡萄糖的重组酿酒酵母及其应用
CN116555359B (zh) * 2023-06-25 2023-12-08 齐鲁工业大学(山东省科学院) 一种生物转化杨木生物质生产燃料乙醇的方法
CN116590165B (zh) * 2023-07-10 2023-09-26 齐鲁工业大学(山东省科学院) 一株利用木糖生产香叶醇的酿酒酵母菌株及其应用

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105199976B (zh) * 2015-11-05 2020-12-18 山东大学 一株共发酵葡萄糖和木糖的重组酿酒酵母菌株及其应用
US10829789B2 (en) * 2016-12-21 2020-11-10 Creatus Biosciences Inc. Methods and organism with increased xylose uptake
CN109706089B (zh) * 2019-02-14 2021-08-10 中国石油化工股份有限公司 一种耐受抑制物的木糖发酵菌株及其构建方法和应用
CN110358690B (zh) * 2019-07-24 2020-07-21 中溶科技股份有限公司 一种耐抑制物的酿酒酵母菌及其选育方法和应用

Also Published As

Publication number Publication date
CN112375694A (zh) 2021-02-19
US20220154131A1 (en) 2022-05-19
US11359177B2 (en) 2022-06-14

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN112375694B (zh) 一株能够缓解高木糖利用与高鲁棒性拮抗的c6/c5共发酵酿酒酵母及其应用
Kuhad et al. Bioethanol production from pentose sugars: Current status and future prospects
Sedlak et al. Production of ethanol from cellulosic biomass hydrolysates using genetically engineered Saccharomyces yeast capable of cofermenting glucose and xylose
CN109706089B (zh) 一种耐受抑制物的木糖发酵菌株及其构建方法和应用
Kádár et al. Ethanol fermentation of various pretreated and hydrolyzed substrates at low initial pH
WO2010072093A1 (zh) 一种纤维素乙醇的生产方法
Cortivo et al. Conversion of fermentable sugars from hydrolysates of soybean and oat hulls into ethanol and xylitol by Spathaspora hagerdaliae UFMG-CM-Y303
Bao et al. Optimization of key factors affecting biohydrogen production from microcrystalline cellulose by the co-culture of Clostridium acetobutylicum X 9+ Ethanoigenens harbinense B 2
Zakpaa et al. Production of bio-ethanol from corncobs using Aspergillus niger and Saccharomyces cerevisae in simultaneous saccharification and fermentation
Cheng et al. Biohydrogen production from pretreated lignocellulose by Clostridium thermocellum
Martiniano et al. Evaluation of novel xylose-fermenting yeast strains from Brazilian forests for hemicellulosic ethanol production from sugarcane bagasse
CN102250967B (zh) 一种用食品废物制备生物燃料丁醇的方法
Örlygsson Ethanol production from biomass by a moderate thermophile, Clostridium AK1
Dekker Ethanol production from D-xylose and other sugars by the yeast Pachysolen tannophilus
Weerasinghe et al. Isolation and identification of cellulase producing and sugar fermenting bacteria for second-generation bioethanol production
CN104673712A (zh) 一株同步利用葡萄糖与木糖生产醇类燃料的菌株及其应用
CN116042730B (zh) 一种生物转化玉米纤维生产燃料乙醇的方法
NL2030489B1 (en) C6/c5 co-fermentation saccharomyces cerevisiae capable of relieving antagonism between high xylose utilization and high robustness and use thereof
CN108504584A (zh) 一种适于提高葡萄糖木糖共发酵酿酒酵母耐受多种预处理抑制物的培养基及应用
CN114561377B (zh) 一株高鲁棒性高木糖利用且能水解寡糖的三价性酿酒酵母工业菌株及其应用
Yeon et al. Bioethanol production from the hydrolysate of rape stem in a surface-aerated fermentor
CN111154664B (zh) 一种耐受阿魏酸的酿酒酵母菌株及其应用
CN106554924B (zh) 生产乙醇的重组酿酒酵母菌株、其构建方法以及利用该菌株生产乙醇的方法
CN110055184B (zh) 酿酒酵母、包含其的微生物制剂及使用其生产乙醇的方法
CN112011472A (zh) 一株具有xr-xdh途径的可快速发酵木糖的酿酒酵母菌株及构建方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant
EE01 Entry into force of recordation of patent licensing contract

Application publication date: 20210219

Assignee: SDIC BIOTECHNOLOGY INVESTMENT Co.,Ltd.

Assignor: Qilu University of Technology

Contract record no.: X2022370000018

Denomination of invention: A C6/C5 co-fermentative Saccharomyces cerevisiae that can alleviate the antagonism of high xylose utilization and high robustness and its application

Granted publication date: 20210618

License type: Common License

Record date: 20220831

EE01 Entry into force of recordation of patent licensing contract