CN101525585A - 广州芽孢杆菌及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种广州芽孢杆菌Bacillus guangzhouensis GIMN1.001及其应用，该菌已在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏日期为2008年11月10日，保藏编号为CCTCCNo.M208211。本发明广州芽孢杆菌具有耐重金属镉和铅的能力，其耐重金属能力强，在对重金属污染的土壤修复中起着重要作用。
Description
技术领域
本发明属于微生物技术领域，特别是涉及一种能耐重金属镉和铅的新的细菌及其应用。
背景技术
在珠江三角洲地区，重金属污染是土壤污染的重要构成，严重地威胁着农产品的安全性和人体的健康。土壤的重金属污染具有隐蔽性或潜伏性、不可逆性和长期性，造成的后果很严重，影响对象广泛，影响区域广、危害人口多。研发经济高效的污染土壤修复技术是改善我国环境质量的迫切要求，也是世界科技的研究热点。
重金属污染土壤的修复包括两种策略：一是改变重金属在土壤中的存在形态使其固定从而降低其在环境中的迁移性和生物可利用性(stabilization)，二是从土壤中去除重金属(extraction)。微生物在重金属污染土壤的修复中具有重要的意义，筛选能够耐受重金属的微生物菌种资源成为目前重金属污染修复的热点之一。
发明内容
本发明的目的是提供一种能够耐受重金属镉和铅的新的细胞——广州芽孢杆菌。
该菌命名为广州芽孢杆菌Bacillus Guangzhouensis GIMN1.001，编号为CCTCCNo.M208211。
本发明所述的广州芽孢杆菌是从广州的番茄根际土壤中采集，经实验室分离培养获得。该菌培养条件为：
(1)培养基：采用营养琼脂培养基(NA)。
具体配方为：蛋白胨10.0g，酵母膏5g，氯化钠(NaCl)5g，琼脂20.0g，水1000ml；pH6.8～7.0；
(2)培养温度：28℃。
本发明广州芽孢杆菌(Bacillus guangzhouensis GIMN1.001)的分子分类地位的确定。
该菌株的16SrDNA序列如SEQ ID NO：1所示。
测序结果与GenBank数据库中的已知序列进行BLAST比较，确定与菌株巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)亲缘关系最近的种属。从数据库获得相关种属的16SrDNA序列，构建系统发育树。
广州芽胞杆菌的基因序列只与巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)有98.2％的同源性，但通过DNA-DNA杂交显示，广州芽孢杆菌与巨大芽胞杆菌模式菌株DSMZ32＝ATCC14581只有14.43％同源性。本发明的广州芽胞杆菌与其同源性最高的芽孢杆菌菌株微生物学特性的比较见表1。
表1广州芽孢杆菌与其同源性最高的巨大芽孢杆菌菌株微生物学特性比较
注：+：阳性；-：阴性；d：11％～89％菌株为阳性
综合16SrDNA序列分析和DNA-DNA杂交结果(1987年国际系统细菌学委员会ICSB规定，DNA同源性小于70％或杂交分子的热解链温度差小于或等于2℃为细菌种的界线，Wayneet al，1987)，本发明的芽孢杆菌是一种新的细菌，命名为广州芽孢杆菌Bacillusguangzhouensis GIMN 1.001。
本发明广州芽孢杆菌具有以下有益效果：
本发明广州芽孢杆菌具有耐受重金属镉和铅的能力，其耐受能力强，尤其是耐受铅的能力很强，在对重金属污染的土壤修复中起着重要作用。
本发明菌株广州芽孢杆菌Bacillus guangzhouensis GIMN1.001已于2008年11月10日保藏于国家知识产权局指定的保藏单位中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为No.M208211。
附图说明
图1是本发明广州芽孢杆菌的透射电子显微镜照片(A，3500倍；B：5000倍)；
图2是本发明广州芽孢杆菌及部分相关菌株依据16S rDNA序列构建的系统发育树。
具体实施方式
以下通过具体实施例来详细说明本发明。
实施例1：本发明广州芽孢杆菌的分离
从广州市蔬菜研究所基地常年种植番茄的田块中番茄根际0-30cm土样，取10g土壤放入装有90mL无菌水的三角瓶中(带玻珠)，在180rpm转速下振荡30分钟，静置10分钟后取上层液稀释10倍后取0.1mL均匀涂布在营养琼脂培养基板上，翻转平板置于28℃培养箱中培养2天，即可获得本发明所述的广州芽孢杆菌Bacillus guangzhouensis GIMN1.001.
营养琼脂培养基：
蛋白胨10.0g，酵母膏5g，氯化钠(NaCl)5g，琼脂20.0g，水1000ml，pH6.8～7.0；
本发明的广州芽孢杆菌(Bacillus guangzhouensis GIMN1.001)具有下述性质：
1.形态特征
菌株GIMN1.001在NA培养基培养24h后的菌落有大小两种形态，形态较大的菌落呈灰白色，表面干燥不透明，菌落圆形或不规则形，边缘不整齐；形态较小的菌落呈白色，表面光滑，半透明，略凸起，边缘整齐。两种菌落重新划NA平板培养24h后其菌落形态差不多。
菌株GIMN1.001革兰氏染色为阳性，菌体杆状，芽孢为近似柱形，孢囊不膨大，没有伴孢晶体，有鞭毛；在细胞内可观察到颗粒状物质。
2.生理生化特征
菌株GIMN1.001的接触酶试验为阳性，不产生苯丙氨酸脱氨酶；能水解明胶、淀粉；吲哚和V-P反应为阴性，V-P培养物终pH＜6；不利用柠檬酸盐，可利用D-葡萄糖产酸，利用D-甘露醇产弱酸，不能利用L-阿拉伯糖、蔗糖产酸，在糖类中生长不产气；厌氧环境下不能生长；在5℃环境下不生长，在30℃环境下生长。
3.其他性质
甲基萘醌的主要类型为MK-7，细胞壁脂肪酸种类和含量如表2。
表2细胞壁脂肪酸种类和含量
实施例2：本发明广州芽孢杆菌16SrDNA的序列测定
1、PCR模板DNA的快速制备
将细菌划线接种在NA培养基的平板上，30℃培养过夜。取单一菌落悬浮于10μl无菌蒸馏水中，于沸水中加热5min，离心，取上清作为PCR模板DNA.
2、16SrRNA基因PCR扩增
PCR引物由上海英骏公司合成。
PrimerA：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’
PrimerB：5’-AAGGAGGTGATCCACCCCCA-3’
PCR反应体系(总体积50μl)：10倍缓冲液5μl，dNTP(2mmol/l)4μl，PrimerA(10pmol/l)1μl，PrimerB(10pmol/l)1μl，Taq酶(2U/l)0.4μl，DNA模板1μl，灭菌ddH2O 37.4μl。
PCR扩增条件：94℃5min；94℃1min，58℃1min，72℃2min，30个循环；72℃7min。
3、序列测定
PCR产物纯化后，送上海英骏公司用3730全自动测序仪测序，测试结果见附图1。
实施例3：本发明广州芽孢杆菌耐重金属能力测定
通过测定微生物对重金属的最大耐受浓度(Maximal tolerant concentration，MTC)，来确定细菌对某种金属离子的极限耐受浓度。
挑取本发明的广州芽孢杆菌菌株的单菌落，接种至装有50mL液体LB培养基的三角瓶中，在28℃的摇床上培养(180转速)至对数生长期，然后将培养好的菌液用接种针划线接种到一系列包含不同浓度的镉和铅金属离子的LB固体平板上，翻转平板置于28℃培养箱中培养4d后观察菌落的生长。
如果在某个浓度只能细微地观察到有菌落的生长，并且在略微高于这个浓度的平板上观察不到菌落的生长，这一浓度便是本发明广州芽孢杆菌菌株对这种金属的最大耐受浓度MTC。
测试结果表明，本发明广州芽孢杆菌菌株耐受镉的能力达到30mg/L，耐受铅的能力达到1000mg/L。
序列表
<110>广东省微生物研究所
<120>广州芽孢杆菌
<160>1
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>1441
<212>rDNA
<213>Bacillus guangzhouensis
<400>1
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agtaaccgtaa ggagctagcc gcctaaggtgg gacagatga 1441
Claims (4)
1.广州芽孢杆菌(Bacillus Guangzhouensis GIMN1.001)，其特征在于：其保藏编号为CCTCCNo.M208211。
2.根据权利要求1所述的广州芽孢杆菌(Bacillus Guangzhouensis GIMN1.001)，其特征在于：该广州芽孢杆菌的16SrDNA序列如SEQ ID NO：1所示。
3.根据权利要求1或2所述的广州芽孢杆菌(Bacillus Guangzhouensis GIMN1.001)，其特征在于：具有以下的微生物学特征：
a)形态特征：
广州芽孢杆菌在平板上培养24h后的菌落或呈灰白色，圆形或不规则形，表面干燥不透明，边缘不整齐；或呈白色，表面光滑，半透明，略凸起，边缘整齐；菌落重新划平板培养24h后形态差不多；革兰氏染色为阳性，菌体杆状，芽孢为近似柱形，孢囊不膨大，没有伴孢晶体，有鞭毛；在细胞内可观察到颗粒状物质；
b)生理生化特征：
广州芽孢杆菌的接触酶试验为阳性，不产生苯丙氨酸脱氨酶；能水解明胶、淀粉；吲哚和V-P反应为阴性，V-P培养物终pH＜6；不利用柠檬酸盐，可利用D-葡萄糖产酸，利用D-甘露醇产弱酸，不能利用L-阿拉伯糖、蔗糖产酸，在糖类中生长不产气；厌氧环境下不能生长；
c)其他特征：
广州芽孢杆菌甲基萘醌主要类型为MK-7。
4.权利要求1-3任一项所述的广州芽孢杆菌(Bacillus Guangzhouensis GIMN1.001)在耐重金属镉和铅中的应用。
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