CN110452858B - 一株副球菌b54及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一株畜禽养殖污水COD和氨氮协同降解的副球菌(Paracoccus acridae)B54及其应用，该细菌已于2019年4月29日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称为CGMCC，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号是CGMCC No.17653。该菌株对于COD、氨氮和总磷都有明显的降解作用。

Description

一株副球菌B54及其应用

技术领域

本发明属于微生物技术领域，尤其涉及微生物废水处理技术领域。

背景技术

近些年来，随着我国农业产业结构的不断调整，畜禽养殖业的规模化、集约化程度不断增加。一方面，规模化养殖可以在很大程度上缩短畜禽生长周期，提高产量，降低成本，然而另一方面，由于规模化使污染物聚集，处理难度增加，因此带来的环境污染也不容小觑。畜禽废水具有悬浮物浓度高、COD_cr含量高、BOD₅含量高、有机磷含量高、氨氮含量高且难运输、难降解等特点，此外，畜禽养殖废水中含有大量病原微生物、寄生虫卵以及残留的重金属元素和抗生素，如不妥善处理将会对空气、水体、土壤环境造成严重危害，破坏自然生态平衡，同时对人畜健康造成极大威胁。因此，如何实现对畜禽养殖废水的有效化处理越来越成为当前的研究重点与热点。

生物处理特别是微生物处理法作为一种绿色高效的处理方法在近年来得到了广泛的研究与应用。该方法的核心问题是高效处理菌株的研发，通过功能菌株的生理代谢过程对畜禽养殖废水中的高浓度COD、氨氮和有机磷等物质进行高效的转化和降解，从而实现养殖废水的达标排放。因此，适合的高效降解菌株成为目前实现畜禽养殖废水微生物高效处理的重点工作。

发明内容

本发明的第一目的，在于提供一株分离自猪养殖污水的副球菌(Paracoccusacridae)B54。

本发明的副球菌(Paracoccus acridae)B54于2019年4月29日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其简称为CGMCC，其地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，菌株保藏编号为CGMCC No.17653。

本发明的第二目的，在于提供一种以副球菌(Paracoccus acridae)B54为活性成分的微生物制剂。

进一步的，所述微生物制剂可用于处理禽畜养殖废水。

本发明提供的副球菌(Paracoccus acridae)B54在畜禽污水微生物处理方面具有良好效果，其不仅对氨氮有很好的降解作用，对COD和总磷也有明显的去除效果。另外，该菌株具有较广泛的温度适应性，在不同温度环境下畜禽养殖污水的处理过程中，都有良好的效果。

附图说明

图1为副球菌(Paracoccus acridae)B54在不同温度下的生长状况图。

图2为副球菌(Paracoccus acridae)B54在不同pH下的生长状况图。

图3为副球菌(Paracoccus acridae)B54对氨氮污水中COD降解效果图。

图4为副球菌(Paracoccus acridae)B54对氨氮污水中氨氮降解效果图。

图5为副球菌(Paracoccus acridae)B54对猪养殖污水中COD降解效果图。

图6为副球菌(Paracoccus acridae)B54对猪养殖污水中氨氮降解效果图。

图7为副球菌(Paracoccus acridae)B54对猪养殖污水中总磷降解效果图。

图8为副球菌(Paracoccus acridae)B54在猪养殖污水中的增殖状况图。

具体实施方式

实施例1菌株的分离与鉴定

将采集自北京大兴某养猪场的新鲜猪尿与自来水按照1：4的比例混匀后，添加质量分数为5％的新鲜猪粪搅拌均匀，静置24h后取上层液体作为猪养殖污水备用。

将上述污水随机分组在30℃、200rpm摇床自然发酵3d后取样检测COD、氨氮以及总磷的含量变化，选取污染物含量下降最明显的一组取发酵液5mL接种于富集培养基中，在30℃、200rpm摇床培养24h，随后继续取5mL培养液接种于新的富集培养基中，如此反复培养5代。

富集培养基：将上述猪养殖污水经121℃灭菌30min后作为富集培养基备用。

取富集5代后的培养液，按照10^-3-10^-7的不同比例梯度稀释，每个梯度取100μL稀释液涂布到氨氮分离培养基上，30℃培养24-48h，观察菌落生长状况，选取生长快、数量多的菌落采取多次分区划线法纯化，将纯化后的单菌落冷冻保藏备用。

氨氮分离培养基：葡萄糖5g，硫酸铵0.25g，氯化钠1g，磷酸氢二钾0.5g，七水硫酸镁0.25g，蒸馏水1L。经121℃灭菌30min后备用。

经上述分离纯化过程得到一株具有氨氮降解效果的菌株，该菌形态特征为短杆状，菌体大小为(0.35-0.5)μm×(1.4-2.0)μm，不产芽孢，菌落为圆形，边缘整齐光滑，在LB培养基上先呈淡黄绿色，随着时间的推移转而为橙红色，为革兰氏阴性好氧菌。在25-40℃之间都能较好的增殖(OD₆₀₀>0.5)，其最适生长pH在7.5-9.0之间(OD₆₀₀>1.0)。

对所得菌株进行分子生物学鉴定，通过细菌16S rDNA序列(SEQ ID NO.1)PCR扩增后进行测序比对。

扩增引物为27F：AGAGTTTGATCMTGGCTCAG，1492R：TACGGYTACCTTGTTACGACTT；

反应体系为：10×Buffer 2μL，2.5mM dNTP 1.5μL，Primer1 1μL，Primer2 1μL，模板1μL，酶0.3μL，水13.2μL，总体积20μL；

反应条件为：95℃预变性5min，30cycle的95℃变性30sec，55℃退火30sec，72℃延伸1.5min，72℃延伸10min，4℃forever保温。

PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测后，测序。

正反向测序并拼接后获得该菌的16S rDNA序列，将该序列于NCBI数据库进行Blast比对，比对结果显示，与副球菌(Paracoccus acridae)SCU-M53同源性最高，达99.9％，菌株命名为副球菌(Paracoccus acridae)B54。

副球菌(Paracoccus acridae)B54已于2019年4月29日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其简称为CGMCC，其地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC No.17653。

实施例2菌株对氨氮污水的降解

LB培养基：酵母浸出物5g，胰蛋白胨10g，氯化钠10g，蒸馏水1L。

氨氮污水：葡萄糖0.62g，乙酸钠2g，硫酸铵1g，维氏盐50mL，蒸馏水1L，pH 7.5。维氏盐：磷酸氢二钾5g，七水硫酸镁2.5g，氯化钠2.5g，七水硫酸亚铁0.05g，四水硫酸锰0.05g，蒸馏水1L。

上述培养基均在121℃下灭菌30min后备用。

挑取平板单菌落到LB液体中，30℃培养24h活化，在无菌条件下，向氨氮污水中按照5％的体积分数接入经离心去除培养基后的B54菌体，设置培养条件为30℃、200rpm，分别在0d、1d、4d、8d取样检测氨氮污水中的COD和氨氮含量。

实验结果显示，氨氮污水初始COD浓度为3900mg/L，接入菌株1d后COD去除率为28％，4d后COD去除率达到76％，之后COD的降解速率明显减慢，直至第8d时的去除率为86％；初始氨氮浓度220mg/L，接入菌株1d后氨氮去除率为18％，4d后氨氮去除率达到41％，8d后氨氮去除率达到55％。

根据以上实验结果显示，该菌株具备良好的COD以及氨氮去除能力，在畜禽养殖污水的微生物处理过程中具有较大的应用潜能。

实施例3菌株对畜禽养殖污水的降解

畜禽养殖污水的预处理方法为，将采集自北京大兴某养猪场的新鲜猪尿与自来水按照1：4的比例混匀，再添加质量分数为5％的新鲜猪粪搅拌均匀，静置24h后取上层液体作为实验室畜禽养殖污水备用。

将上述畜禽养殖污水添加0.5％糖蜜作额外碳源，经高温高压灭菌后用于该菌株的降解实验。将平板上B54单菌落挑取到LB液体中，30℃培养24h活化，在无菌条件下，向畜禽污水中按照5％的体积分数接入经离心去除培养基后的B54菌体，设置培养条件为30℃、200rpm，3d后取样检测畜禽污水中的COD和氨氮含量。实验结果显示，畜禽污水初始COD浓度为7600mg/L，3d后COD去除率为49％；初始氨氮浓度204mg/L，3d后氨氮去除率为72％；初始总磷浓度19.75mg/L，3d后总磷去除率为25％。

对该菌株在畜禽养殖污水中的增殖状况进行检测，每24h取样进行梯度稀释涂平板，然后置于30℃恒温培养箱中培养24h，计数平板中长出的菌落数，然后根据稀释梯度计算得到每个时间点样品中的菌体量。

实验结果显示，在接入菌株B54的24h内，菌体量由1.65×10⁹/mL迅速增加至9.25×10⁹/mL；在第24-48h，菌体量由9.25×10⁹/mL下降到5.25×10⁹/mL，48h之后菌株含量又略有回升直至最终趋于稳定为6.25×10⁹/mL。即该菌体的增殖主要发生在接入污水的前24h，24h之后菌体含量稍有下降，最后达到稳定。

根据以上实验结果显示，该菌株在污水中具有良好的繁殖能力，并且具备良好的COD以及氨氮去除能力，此外对于总磷也有一定的去除效果，因此在畜禽养殖污水的微生物处理过程中具有较大的应用潜能。

序列表

<110> 中国科学院微生物研究所

<120> 一株副球菌B54及其应用

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1333

<212> DNA

<213> 副球菌(Paracoccus acridae)

<400> 1

ggtccgctgc ctcccgtaag ggttagcgca cggccgtcgg gtagacccaa ctcccatggt 60

gtgacgggcg gtgtgtacaa ggcccgggaa cgtattcacc gcggcgtgct gttccgcgat 120

tactagcgat tccaacttca tggggtcgag ttgcagaccc caatccgaac tgagatggct 180

tttggggatt aacccactgt caccaccatt gtagcacgtg tgtagcccaa cccgtaaggg 240

ccatgaggac ttgacgtcat ccacaccttc ctccggctta tcaccggcag tttccacaga 300

gtgcccaact gaatgctggc aactggggac gtgggttgcg ctcgttgccg gacttaaccg 360

aacatctcac gacacgagct gacgacagcc atgcagcacc tgtctccagg ccaccgaagt 420

ggaaacccga tctctcgggc ggtcctggga tgtcaagggt tggtaaggtt ctgcgcgttg 480

cttcgaatta aaccacatgc tccaccgctt gtgcgggccc ccgtcaattc ctttgagttt 540

taatcttgcg accgtactcc ccaggcggaa tgcttaatcc gttaggtgtg tcaccgaatt 600

gcatgcaacc cgacgactgg cattcatcgt ttacggcgtg gactaccagg gtatctaatc 660

ctgtttgctc cccacgcttt cgcacctcag cgtcagtatc gagccagtga gccgccttcg 720

ccactggtgt tcctccgaat atctacgaat ttcacctcta cactcggaat tccactcacc 780

tctctcgaac tcaagaccag tagttttgaa ggcagttccg aggttgagcc ccgggatttc 840

acccccaact ttccgatccg cctacgtgcg ctttacgccc agtaattccg aacaacgcta 900

gccccctccg tattaccgcg gctgctggca cggagttagc cggggcttct tctgctggta 960

ccgtcattat cttcccagct gaaagagctt tacaacccta aggccttcat cactcacgcg 1020

gcatggctag atcagggttg cccccattgt ctaagattcc ccactgctgc ctcccgtagg 1080

agtctgggcc gtgtctcagt cccagtgtgg ctgatcatcc tctcaaacca gctatggatc 1140

gtcggcttgg taggccatta ccccaccaac tacctaatcc aacgcgggct aatccttccc 1200

cgataaatct ttcccccaaa gggcgtatac ggtattaccc ccagtttccc aggactattc 1260

cgtagagaag ggcatattcc cacgcgttac tcacccgtcc gccgctgacc ccgaaaggtc 1320

cgctcgactg cat 1333

Claims (3)

1.一株副球菌（Paracoccus acridae）B54，保藏编号为CGMCC No.17653。

2.一种微生物制剂，其活性成分为权利要求1所述的副球菌（Paracoccus acridae）B54。

3.权利要求1所述的副球菌（Paracoccus acridae）B54在制备处理畜禽养殖废水中COD、氨氮以及总磷的菌剂中的应用。

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