CN110526418A - 一种利用固定化密孔菌降解养殖废水中抗生素的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种利用固定化密孔菌降解养殖废水中抗生素的方法，其特征在于，包括以下步骤：S1、将密孔菌Pycnoporus sp.SYBC‑L10接种于菌包中，静置条件下培养30‑40天菌丝长满培养基；S2、首先将含有四环类抗生素或磺胺类抗生素的养殖废液pH调整至3.0‑6.0，后缓慢加入菌包中，静置孵育一段时间放出液体即可。本发明提供了一种利用固定化密孔菌降解养殖废水中抗生素的方法，既廉价又高效去除养殖废水中四环类和磺胺类抗生素的方法，与传统的物理化学法相比，绿色安全，环境友好，符合可持续发展需求，在未来治理环境中的抗生素应用中具有广阔的应用前景。

Description

一种利用固定化密孔菌降解养殖废水中抗生素的方法
技术领域
本发明涉及细胞固定化和微生物转化技术领域，尤其涉及一株密孔菌细 胞的固定化及利用该固定化细胞催化降解养殖废水中的抗生素。
背景技术
近年来，养殖业的迅速发展极大地促进了人们生活水平的提高。在养殖 的过程中为了预防疾病和促进家禽生长，四环类抗生素(比如土霉素、金霉 素)和磺胺类抗生素(比如磺胺地索辛)被不受监管的大量使用。由于这些 抗生素对畜禽生长有促进作用，又作为饲料添加剂，所以被广泛应用，随之 而来的养殖废水给人们带来了很大的困扰。因为养殖废水通常属高浓度有机 污水，而且悬浮物和氨氮含量大，并且含有大量的抗生素，一般的微生物难 以生长，也不能有效的降解抗生素。
发明内容
本发明要解决的技术问题是克服现有技术中养殖业废水中的抗生素难以 去除的缺陷，提供一种利用固定化密孔菌降解养殖废水中抗生素的方法。
为了解决上述技术问题，本发明提供了如下的技术方案：
一种利用固定化密孔菌降解养殖废水中抗生素的方法，包括以下步骤：
S1、将密孔菌Pycnoporus sp.SYBC-L10接种于菌包中，静置条件下培 养30-40天菌丝长满培养基；
S2、首先将含有四环类抗生素或磺胺类抗生素的养殖废液pH调整至 3.0-6.0，后缓慢加入菌包中，静置孵育一段时间放出液体即可。
本专利涉及到的保藏编号为：CCTCC NO:M2015020的Pycnoporus sp. SYBC-L10属于密孔菌属。申请人发现该菌能够大量分泌胞外漆酶以及一种天 然的漆酶氧化还原介体3-羟基-2-氨基苯甲酸(3-hydroxyanthranilic acid, 3-HAA)，培养基中加入一定量的果糖能够显著提高胞外3-HAA的含量。抗生 素降解实验证明菌Pycnoporus sp.SYBC-L10产的漆酶加3-HAA标准品能够 有效的降解四环类和磺胺类抗生素，说明密孔菌Pycnoporussp.SYBC-L10 具备高效的降解四环类和磺胺类抗生素的潜力。在实际应用中，利用固定化细胞转化具有很多优势，比如催化后菌不会随废液流走，易于分离和回收等。 因此研究和建立一种利用固定化密孔菌降解养殖废水中抗生素的方法具有重 要意义。
固定化密孔菌细胞生产制备工艺可以采用如下步骤：
(1)菌的活化：将所述密孔菌Pycnoporus sp.SYBC-L10划线接种于 PDA平板培养基，30℃培养3-4d；PDA培养基组成：土豆200g L-1,葡萄糖 20g L-1，琼脂粉20g L-1，pH自然；
(2)斜面培养：将步骤(1)所述平板培养基上生长的菌种转接至PDA 斜面30℃培养4-6d，待菌丝长满斜面，PDA培养基组成同步骤(1)，pH自然；
(3)原种培养：将步骤(2)所述斜面上的菌丝连同培养基一起转接入 原种培养基培养，30℃，静置条件下培养12-15天菌丝长满培养基，大口玻 璃瓶装好原种培养基，纱布牛皮纸包好115℃,30min灭菌后使用，原种培养 基组成(0.5kg/per)：木屑78％(156g)，麸皮20％(40g)，石膏1％(2g)， 白糖1％(2g)，水750mL(300g)，pH自然；
(4)菌包培养：将步骤(3)所得原种按一定比例接种到菌包中，30℃， 静置条件下培养30-40天菌丝长满培养基，菌包用纱布牛皮纸包好115℃, 30min灭菌后使用，菌包培养基组成(1.25kg/per)：木屑78％(390g)，麸 皮20％(100g)，石膏1％(5g)，果糖1％(5g)，水750mL(750g)，pH 自然；
(5)保存：将步骤(4)所得菌包室温下保存备用，定期洒水，保持一 定湿度，菌包可自己生长1年以上；
本发明所提供的密孔菌Pycnoporus sp.SYBC-L10已于2015年 保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC#NO：M2015020， 地址：中国，武汉，武汉大学。该专利的生物材料样品的相关保藏信 息已经在申请日前的专利公告上公布(申请号201510125457.X，申 请日为2015-03-23)。
本发明所达到的有益效果是：本发明提供了一种利用固定化密孔菌降解 养殖废水中抗生素的方法，实验证明，该菌产的漆酶(Lac-Q)具有相对较好 的冷适应性、热稳定性、金属离子稳定性及有机溶剂稳定性等优点，在酸性 范围内(pH3.0-6.0)，无论是在0℃的极端低温条件下还是在70℃的高温条件 下漆酶(Lac-Q)均能高效的降解四环类和磺胺类抗生素，降解速率快，降解 后抑菌效果显著降低。综上所述，本发明成功的找到了一种既廉价又高效去 除养殖废水中四环类和磺胺类抗生素的方法，与传统的物理化学法相比，绿色安全，环境友好，符合可持续发展需求，在未来治理环境中的抗生素应用 中具有广阔的应用前景。
具体实施方式
以下对本发明的优选实施例进行说明，应当理解，此处所描述的优选实 施例仅用于说明和解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例
菌株
密孔菌Pycnoporus sp.SYBC-L10已于2015年保藏于中国典型培养物保 藏中心，保藏编号为CCTCC#NO：M2015020，地址：中国，武汉，武汉大学。
培养基
PDA培养基组成：土豆200g L-1,葡萄糖20g L-1，琼脂粉20g L-1，pH 自然；
原种培养基组成(0.5kg/per)：木屑78％(156g)，麸皮20％(40g)， 石膏1％(2g)，白糖1％(2g)，水750mL(300g)，pH自然；
菌包培养基组成(1.25kg/per)：木屑78％(390g)，麸皮20％(100g)， 石膏1％(5g)，果糖1％(5g)，水750mL(750g)，pH自然；
主要仪器
立式蒸汽压力灭菌锅(YXQ-LS-50上海博迅)；超净工作台(苏州净化设 备有限公司)
实例1应用固定化密孔菌去除猪场废水中的抗生素
1.1将保藏编号为CCTCC#NO：M2015020的Pycnoporus sp.SYBC-L10固 定在固体培养基上：
(1)菌的活化：将所述密孔菌Pycnoporus sp.SYBC-L10划线接种于 PDA平板培养基，30℃培养3-4d；
(2)斜面培养：将步骤(1)所述平板培养基上生长的菌种转接至PDA 斜面30℃培养4-6d，待菌丝长满斜面；
(3)原种培养：将步骤(2)所述斜面上的菌丝连同培养基一起转接入 原种培养基培养，30℃，静置条件下培养12-15天菌丝长满培养基，大口玻 璃瓶装好原种培养基，纱布牛皮纸包好115℃,30min灭菌后使用；
(4)菌包培养：将步骤(3)所得原种按一定比例接种到菌包中，30℃， 静置条件下培养30-40天菌丝长满培养基，菌包用纱布牛皮纸包好115℃, 30min灭菌后使用；
1.2猪场废水预处理：过滤除去大颗粒杂质，将废液pH调为酸性范围内 (pH3.0-6.0)，称取500克/份猪场废水分装好备用；
1.3将上述处理好的猪场废水缓慢加入菌包中，静置孵育30分钟，放出 液体即可，抗生素去除率达到90％-100％。
1.4重复步骤1.3，反复循环利用。
实例2应用固定化密孔菌去除鸡场废水中的抗生素
2.1将保藏编号为CCTCC#NO：M2015020的Pycnoporus sp.SYBC-L10固 定在固体培养基上：
(1)菌的活化：将所述密孔菌Pycnoporus sp.SYBC-L10划线接种于 PDA平板培养基，30℃培养3-4d；
(2)斜面培养：将步骤(1)所述平板培养基上生长的菌种转接至PDA 斜面30℃培养4-6d，待菌丝长满斜面；
(3)原种培养：将步骤(2)所述斜面上的菌丝连同培养基一起转接入 原种培养基培养，30℃，静置条件下培养12-15天菌丝长满培养基，大口玻 璃瓶装好原种培养基，纱布牛皮纸包好115℃,30min灭菌后使用；
(4)菌包培养：将步骤(3)所得原种按一定比例接种到菌包中，30℃， 静置条件下培养30-40天菌丝长满培养基，菌包用纱布牛皮纸包好115℃, 30min灭菌后使用；
2.2鸡场废水预处理：过滤除去大颗粒杂质，将废液pH调为酸性范围内 (pH3.0-6.0)，称取500克/份鸡场废水分装好备用；
2.3将上述处理好的鸡场废水缓慢加入菌包中，静置孵育30分钟，放出 液体即可，抗生素去除率达到90％-100％。
2.4重复步骤2.3，反复循环利用。
实例3应用固定化密孔菌去除渔场废水中的抗生素
3.1将保藏编号为CCTCC#NO：M2015020的Pycnoporus sp.SYBC-L10固 定在固体培养基上：
(1)菌的活化：将所述密孔菌Pycnoporus sp.SYBC-L10划线接种于 PDA平板培养基，30℃培养3-4d；
(2)斜面培养：将步骤(1)所述平板培养基上生长的菌种转接至PDA 斜面30℃培养4-6d，待菌丝长满斜面；
(3)原种培养：将步骤(2)所述斜面上的菌丝连同培养基一起转接入 原种培养基培养，30℃，静置条件下培养12-15天菌丝长满培养基，大口玻 璃瓶装好原种培养基，纱布牛皮纸包好115℃,30min灭菌后使用；
(4)菌包培养：将步骤(3)所得原种按一定比例接种到菌包中，30℃， 静置条件下培养30-40天菌丝长满培养基，菌包用纱布牛皮纸包好115℃, 30min灭菌后使用；
3.2渔场废水预处理：过滤除去大颗粒杂质，将废液pH调为酸性范围内 (pH3.0-6.0)，称取500克/份渔场废水分装好备用；
3.3将上述处理好的渔场废水缓慢加入菌包中，静置孵育30分钟，放出 液体即可，抗生素去除率达到90％-100％。
3.4重复步骤3.3，反复循环利用。
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限 制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的 技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或 者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作 的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (3)

1.一种利用固定化密孔菌降解养殖废水中抗生素的方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、将密孔菌Pycnoporus sp.SYBC-L10接种于菌包中，静置条件下培养30-40天菌丝长满培养基；
S2、首先将含有四环类抗生素或磺胺类抗生素的养殖废液pH调整至3.0-6.0，后缓慢加入菌包中，静置孵育一段时间放出液体即可。
2.如权利要求1所述的利用固定化密孔菌降解养殖废水中抗生素的方法，其特征在于，S1中菌包中的培养基组成(1.25kg/per)为：木屑78％(390g)，麸皮20％(100g)，石膏1％(5g)，果糖1％(5g)，水750mL(750g)，pH自然。
3.如权利要求1所述的利用固定化密孔菌降解养殖废水中抗生素的方法，其特征在于S1中密孔菌Pycnoporus sp.SYBC-L10原种培养的过程为将斜面上的菌丝连同培养基一起转接入原种培养基培养，30℃，静置条件下培养12-15天菌丝长满培养基，大口玻璃瓶装好原种培养基，纱布牛皮纸包好115℃,30min灭菌后使用，原种培养基组成(0.5kg/per)：木屑78％(156g)，麸皮20％(40g)，石膏1％(2g)，白糖1％(2g)，水750mL(300g)，pH自然。
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