CN110050941B - 一种抑制黄曲霉生长并降解黄曲霉毒素b1的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种复合生物制剂在抑制黄曲霉生长和降解黄曲霉毒素B1中的方法，利用微生物酶液与植物提取物复合以实现对黄曲霉生长的抑制和AFB1降解的双重作用。将荧光假单胞菌粗酶液与罗勒叶提取液混合制备一种高效抑制黄曲霉生长并降解AFB1的复合生物制剂。当荧光假单胞菌粗酶液与罗勒叶提取液混合时，使两者所占组分比为20～80%。相同条件下，复合生物制剂能够提升解毒能力和抑菌效率，相比荧光假单胞菌粗酶液单独作用，复合生物制剂的AFB1降解率和黄曲霉生长抑制率分别提高20%和25%以上；相比罗勒叶提取液单独作用，复合生物制剂分别提高30%和27%以上。本发明在粮食安全领域防治黄曲霉污染具有广阔的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于微生态制剂领域，具体涉及一种同时抑制黄曲霉生长并降解黄曲霉毒素B1的方法。
背景技术
粮食在存储的过程中经常会被黄曲霉及其产生的黄曲霉毒素污染。为了解决这种污染现象，公开号105255775A的专利申请公开了一株高效降解黄曲霉毒素的土壤单胞菌，并表示菌株CW980能够在低浓度毒素污染条件下达到极佳的降解效果。公开号104498378A的专利申请公开了一种产黄曲霉毒素B1降解酶的细菌Sinomonassp. HSD8及其应用，并表示该菌株产酶能力较强且该酶可有效解决黄曲霉毒素污染的问题。公开号105524844A的专利申请公开了一株降解黄曲霉毒素B1的枝顶孢属菌株及其应用，其表示该微生物发酵液与黄曲霉毒素B1反应24 h后对黄曲霉毒素B1降解率可以达到78.46%。专利103981132A公开了一株节杆菌L15，将其发酵液与黄曲霉毒素溶解混匀，其可以高效降解黄曲霉毒素。公开号107201322A的专利申请公开了一种用于降解黄曲霉毒素的枯草芽孢杆菌及其应用。研究表明，枯草芽孢杆菌S1分泌的胞外酶能够降解黄曲霉毒素B1。以上发明的研究重点在于微生物及其产物降解黄曲霉毒素，其中还包括微生物所产的胞外酶和胞内酶能够高效的降解黄曲霉毒素B1，这种做法既安全又无污染。专利103211272A公开了茶叶提取物在黄曲霉毒素生物防控中的应用，所述茶叶提取物包括绿茶、红茶和黑茶等通过常规提取方法得到的茶叶提取物，对黄曲霉毒素产生菌的生长具有明显的抑制作用,同时对黄曲霉毒素的生物合成也具有显著的抑制效果。公开号106615681A公开了一种抑制黄曲霉菌的复合酸化剂及其制备方法，所述抑制黄曲霉菌的复合酸化剂由青篙、败酱草、浒苔、批把叶、艾叶、姜黄、柠檬酸、甲酸、乳酸按照特定比例和制备方法制备而成，其发明的抑制黄曲霉菌的复合酸化剂对黄曲霉菌具有显著的抑制效果。专利103210921A公开了茶多酚在黄曲霉毒素生物防控中的应用，茶多酚可应用于抑制黄曲霉毒素产生菌的生长及黄曲霉毒素的生物合成，是茶多酚的一种新用途。公开号106538924A公开了一种山苍子植物发酵液，植物发酵液为干山苍子、生姜、苍术等发酵所得产物，这种发酵液预防和抑制黄曲霉菌的效果显著，从而抑制黄曲霉毒素的产生。以上发明的重点在于抑制原料中黄曲霉真菌的生长进而抑制其产毒作用，这种方法表现出安全、高效、无污染的特点，与传统物理化学方法处理黄曲霉真菌污染相比更具备优势。于是我们通过将抑制黄曲霉真菌生长和降解黄曲霉毒素B1结合，利用微生物酶液与植物提取物复合以实现对黄曲霉生长的抑制和AFB1降解的双重作用。
董国菊发现荧光假单胞菌拮抗菌株对烟草疫霉的抑菌作用，通过平板对峙及代谢产物抑菌试验筛选对烟草疫霉具有高效拮抗作用的菌株其鉴定为荧光假单胞菌(董国菊，2012) ，但是其抑制的真菌非黄曲霉。公开号101974451A公开了抗菌蛋白PopW与生防菌的混合生防制剂PopW-PF1，其利用高浓度的抗菌蛋白与荧光假单胞菌混合而成，混合生防制剂对辣椒、番茄等蔬菜作物和水稻、大豆等粮食作物上的病毒病的防病效果达50%以上，对其它病害也有较好的防治效果如叶霉病和水稻稻曲病等，其增产效果达10%，其保护重点在于防治蔬菜和大田作物病害中的应用。本实验室通过高通量筛选具备降解黄曲霉毒素B1能力的微生物，获取一株能够降解黄曲霉毒素B1的荧光假单胞菌，并探索环境对荧光假单胞菌粗酶液降解黄曲霉毒素B1能力的影响，经研究表明荧光假单胞菌粗酶液对黄曲霉真菌具备抑制效果。前人曾报道天然植物精油能够抑制真菌和细菌的生长，通过蒸馏、浸提、冷榨等方法提取的植物精油能够用于抑菌，但是精油的提取方法过于复杂并可能造成二次环境污染，这类操作费时费力且需要使用较多化学试剂，不仅需要花费资金而且提取效率普遍较低。通过了解到一些天然药物如酚类、丁香酚、乌索酸、萜烯类、黄酮类等物质能够抑制真菌和细菌的生长，由此我们推测罗勒可能具有这些特殊的天然成分。通过制备罗勒叶提取液，并将罗勒提取液去作用不同的微生物，发现罗勒叶提取液能够很好的抑制黄曲霉真菌的生长，同时我们发现罗勒叶提取液具备降解黄曲霉毒素B1的能力。将具备多功能的荧光假单胞菌粗酶液与罗勒叶提取液结合并制备一种高效抑制黄曲霉生长并降解黄曲霉毒素B1的复合生物制剂。将植物天然产物与微生物酶液相结合，既能够抑制粮食中黄曲霉真菌的生长和产毒，又能够将粮食中原有的黄曲霉毒素B1高效降解，更具备安全性和实用性。目前，通过将罗勒提取液与荧光假单胞菌粗酶液结合，发挥抑制黄曲霉生长和降解黄曲霉毒素B1 双重作用的研究甚少。
发明内容
本发明的目的在于提供一种抑制黄曲霉生长并降解黄曲霉毒素B1的方法。
本发明采用的荧光假单胞菌、黄曲霉来自于实验室保藏，罗勒、玉米粒、花生粒源自于农场。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：
一种抑制黄曲霉生长并降解黄曲霉毒素B1的方法，其中由罗勒叶提取液与荧光假单胞菌粗酶液混合，并控制各自所占组分比在区间20%～80%，并且两组分之和为100%。
本发明一种抑制黄曲霉生长并降解黄曲霉毒素B1复合生物制剂的制备方法如下：（1）发酵培养荧光假单胞菌，将其发酵液放入相同大小的离心管中以8000转每分钟冷冻离心，将上清液与下层菌体分离，取离心后的菌体，用磷酸盐缓冲液反复冲洗菌体，之后将菌体于磷酸盐缓冲液重悬。冰浴下在超声波破碎仪中破碎菌体细胞，破碎之后将裂解液进行18000转离心，将离心上清液通过0.22 µm的滤膜过滤。之后进行超滤浓缩五倍体积，制得荧光假单胞菌粗酶液，分装并低温保藏。
（2） 将新鲜的罗勒叶进行采摘，对采摘的罗勒叶表面进行除菌，用搅拌机将罗勒叶搅拌均匀，加入适量无菌水反复搅拌成匀浆，将罗勒叶匀浆通过10000转每分钟离心并通过0.22 µm的滤膜过滤，将上清液分装制备罗勒叶提取液。将制备好的罗勒叶提取液与荧光假单胞菌粗酶液各自所占组分比在20～80%，之和为100%混合均匀，从而制备一种复合生物制剂。
本发明复合生物制剂，其作用发霉粮食的解毒时间为6～18小时。
利用国标法（编号：GB/T 17480-2008）检测黄曲霉毒素B1的含量。
研究环境因素影响对复合生物制剂作用的影响，将复合生物制剂与发霉粮食混合均匀，控制发霉粮食的温度为38℃～40℃。相同条件处理下，复合生物制剂能够提升解毒能力和抑菌效率，相比荧光假单胞菌粗酶液单独作用时，复合生物制剂的黄曲霉毒素B1降解率和
黄曲霉生长抑制率分别提高20%和25%以上；相比罗勒叶提取液单独作用时，复合生物制剂分别提高30%和27%以上。
进一步在步骤8中的复合生物制剂组分罗勒叶提取液，在制备罗勒叶提取液的过程中，控制罗勒叶与无菌水的比例1: 1 .5 g/ml。
复合生物制剂在粮食中抑制黄曲霉真菌的生长和降解黄曲霉毒素B1中的应用。
实验验证荧光假单胞菌粗酶液具备降解黄曲霉毒素B1的能力，并且我们发现荧光假单胞菌粗酶液还具备抑制黄曲霉真菌生长的效果。通过文献我们了解到酚类、萜烯类物质、黄酮类物质能够抑制真菌和细菌的生长，于是我们尝试了罗勒叶提取液并证实其能够抑制黄曲霉真菌生长，并将罗勒叶提取液作用于黄曲霉毒素B1，发现其具备降解黄曲霉毒素B1的能力。将具备黄曲霉毒素B1降解能力的微生物酶液与植物提取物结合，制备具有抑制黄曲霉生长并降解黄曲霉毒素B1双重作用的复合生物制剂。本发明能够体现生物制剂安全、高效的特点。
本复合生物制剂具有降解黄曲霉毒素B1效率高，绿色环保的特点，在抑制粮食中黄曲霉真菌生长和降解黄曲霉毒素B1中具有应用前景。在15天内，复合生物制剂表现出高效的解毒和抑菌作用，研究表明，将荧光假单胞菌粗酶液与罗勒叶提取液混合时，控制二者各自所占组分比在区间20%～80%以内，并且两组分之和为100%，控制降解黄曲霉毒素B1的温度为38℃～40℃时，复合生物制剂能够将20～1000 ppb的AFB1高效降解，降解率为83%～90%。相同条件处理下，复合生物制剂能够提升解毒能力和抑菌效率，相比荧光假单胞菌粗酶液单独作用时，复合生物制剂的毒素降解率和黄曲霉生长抑制率分别提高20%和25%以上；相比罗勒叶提取液单独作用时，复合生物制剂分别提高30%和27%以上。
具体实施方式
下面结合实施例，对本发明的具体的实施方式进一步详细描述。以下实施例是用来进一步说明本发明的内容，而不限制本发明的保护范围。对于本发明所涉及的相关内容及所做的修改，均属于本发明保护范围。
实施例1
将荧光假单胞菌发酵培养，将其发酵液放入大小适宜的离心管中以8000转每分钟冷冻离心，将上清液与下层菌体分离，取离心后的菌体，用磷酸盐缓冲液反复冲洗菌体，之后将菌体于磷酸盐缓冲液重悬。冰浴下在超声波破碎仪中破碎菌体细胞，破碎之后将裂解液进行18000转离心，将离心上清液通过0.22 µm的滤膜过滤。之后进行超滤浓缩五倍体积，制得荧光假单胞菌粗酶液，分装并低温保藏。
将新鲜的罗勒叶进行采摘，采用次氯酸钠对采摘的罗勒叶表面浸泡，进行除菌，用搅拌机将罗勒叶搅拌均匀，加入适量无菌水反复搅拌成匀浆，控制罗勒叶与无菌水的比例为1: 1.5 g/ml。将罗勒叶匀浆通过10000转每分钟离心并通过0.22 µm的滤膜过滤，取上清液分装制备罗勒叶提取液，备用。
将制备好的罗勒叶提取液与荧光假单胞菌粗酶液以组分比为（50% : 50%）制备复合生物制剂。称量被黄曲霉污染的玉米粒5 g，取1 ml复合生物制剂，将复合生物制剂与黄曲霉污染的玉米粒充分喷洒混匀放置于无菌试管中，在相同条件下采用荧光假单胞菌粗酶液或罗勒叶提取液分别单独作用于黄曲霉污染的玉米粒，另取发霉玉米粒作为空白对照组，将以上实验组与对照组放置在40℃下恒温培养12小时，通过测量0小时和12小时后各组中发霉玉米粒中黄曲霉毒素B1的含量，从而计算出复合生物制剂对黄曲霉毒素B1的降解率。
经过检测，以未处理的发霉玉米粒为对照组，复合生物制剂对发霉玉米粒中的黄曲霉毒素B1降解率为89%；相同条件下，荧光假单胞菌粗酶液单独作用后降解率为68%，罗勒叶提取液单独作用后降解率为56%。对比可得复合生物制剂与两组分单独降解黄曲霉毒素B1效率相比提高21%和33%。
将黄曲霉污染的玉米粒5 g放置于无菌试管中，分成四组，一组玉米粒添加1 ml复合生物制剂，另一组不处理作为对照组，剩下两组分别加入1 ml的荧光假单胞菌粗酶液和罗勒叶提取液，40℃下恒温培养15天，检测四组试管中黄曲霉真菌生长重量的变化，并与对照组中黄曲霉真菌重量变化对比，计算实验组中黄曲霉真菌生长的抑制率。检测0天和15天后，经复合生物制剂处理的黄曲霉污染的玉米粒中黄曲霉毒素B1的含量变化，计算复合生物制剂在培养15天之后对发霉玉米颗粒中黄曲霉毒素B1的降解率。
经检测15天后，相对于对照组，复合生物制剂对黄曲霉真菌的生长抑制率达到了87%；荧光假单胞菌粗酶液对黄曲霉真菌的生长抑制率为61%；罗勒叶提取液对黄曲霉真菌的生长抑制率为59%。由此复合生物制剂对黄曲霉真菌的抑制率，相对荧光假单胞菌粗酶液或罗勒叶提取液，分别提升了26% 和28%。经过检测，复合生物制剂在15天后对发霉玉米颗粒中黄曲霉毒素B1的降解率为89%。
实施例2
在实施例1制备荧光假单胞菌粗酶液与罗勒叶提取液的基础上，将荧光假单胞菌粗酶液与罗勒叶提取液以各自组分比（40% : 60%）制备复合生物制剂，称量被黄曲霉污染的花生粒5 g，取 1 ml复合生物制剂，将复合生物制剂与黄曲霉污染的花生粒充分喷洒混匀放置于无菌试管中，在相同条件下采用荧光假单胞菌粗酶液或罗勒叶提取液分别单独作用于黄曲霉污染的花生粒，另取发霉花生粒作为空白对照组，将以上实验组与对照组放置在38℃下恒温培养8小时，通过测量0小时和8小时后发霉花生粒中黄曲霉毒素B1的含量计算得出复合生物制剂的毒素降解率。
经过检测，以未处理发霉花生粒为对照组，复合微生物制剂对发霉花生粒中的黄曲霉毒素B1降解率为82%；相同条件下，荧光假单胞菌粗酶液单独作用后降解率为59%，罗勒叶提取液单独作用后降解率为49%。对比可得复合生物制剂与两组分单独降解黄曲霉毒素B1效率相比提高23%和33%。
将被黄曲霉污染的花生颗粒5 g放置于无菌试管中，分成四组，一组花生粒添加1ml 复合生物制剂，另一组不处理作为对照组，剩下两组分别加入1 ml的荧光假单胞菌粗酶液和罗勒叶提取液，38℃下恒温培养15天，检测四组试管中黄曲霉真菌重量的变化，以对照组中黄曲霉真菌重量变化对比，计算实验组中黄曲霉真菌生长的抑制率。并检测0天和15天后，经复合生物制剂处理的发霉花生颗粒中黄曲霉毒素B1的含量变化，计算复合生物制剂在15天后对发霉花生颗粒中黄曲霉毒素B1的降解率。
经检测15天后，相对于对照组，复合生物制剂对黄曲霉真菌的生长抑制率达到了88%；荧光假单胞菌粗酶液对黄曲霉真菌的生长抑制率为60%；罗勒叶提取液对黄曲霉真菌的生长抑制率为58%。由此复合生物制剂对黄曲霉真菌的抑制率，相对荧光假单胞菌粗酶液或罗勒叶提取液，分别提升了28% 和30%。经过检测，复合生物制剂在15天后对发霉花生颗粒中黄曲霉毒素B1的降解率为82%。
Claims (4)
1.一种抑制黄曲霉生长并降解黄曲霉毒素B1的复合生物制剂制备方法：
(1)发酵培养荧光假单胞菌，将其发酵液放入大小合适的离心管中以8000转每分钟冷冻离心，将上清液与下层菌体分离，取离心后的菌体，用磷酸盐缓冲液反复冲洗菌体，之后将菌体于磷酸盐缓冲液重悬；冰浴下在超声波破碎仪中破碎菌体细胞，破碎之后将裂解液进行18000转离心，将离心上清液通过0.22 µm的滤膜过滤；之后进行超滤浓缩五倍体积，制得荧光假单胞菌粗酶液，分装并低温保藏；
(2)将新鲜的罗勒叶进行采摘，对采摘的罗勒叶表面进行除菌，用搅拌机将罗勒叶搅拌均匀，加入适量无菌水反复搅拌成匀浆，将罗勒叶匀浆通过10000转每分钟离心并通过0.22µm的滤膜过滤，将上清液分装制备罗勒叶提取液，其中在制备罗勒叶提取液的过程中，控制罗勒叶与无菌水的比例为1: 1.5 g/ml；
(3)将制备好的罗勒叶提取液与荧光假单胞菌粗酶液各自所占组分比在20～80%，之和为100%混合均匀，从而制备一种复合生物制剂。
2.如权利要求1所述的一种抑制黄曲霉生长并降解黄曲霉毒素B1的复合生物制剂制备方法制备的复合生物制剂，其特征在于制备复合生物制剂时保证荧光假单胞菌粗酶液和罗勒叶提取液各自所占组分比在区间20%～80%以内，并且两组分之和为100%。
3.如权利要求2所述的复合生物制剂，其作用发霉粮食的解毒时间为6～18小时。
4.如权利要求2所述的复合生物制剂，其作用发霉粮食的温度控制在38℃～40℃下时，其解毒和抑菌效率最优。
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