CN113621676B - 一步式高效筛选黄曲霉毒素防控菌的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一步式高效筛选黄曲霉毒素防控菌的方法。测定黄曲霉毒素生防菌试验处理组和对照组指示分子AFT‑YJFZ01含量，计算生防菌对指示分子AFT‑YJFZ01抑制率，根据抑制率结果，高效筛选黄曲霉毒素防控菌，所述的指示分子AFT‑YJFZ01氨基酸序列如SEQID NO.1所示。其可用于一步式筛选出同时抑制黄曲霉毒素源头合成及其产毒菌生长的黄曲霉毒素防控菌，易操作，实用性强，容易推广应用，对发展黄曲霉毒素微生物防控技术与保障食品安全具有重要意义。

Description

一步式高效筛选黄曲霉毒素防控菌的方法

技术领域

本发明涉及一步式高效筛选黄曲霉毒素防控菌的方法。

背景技术

黄曲霉毒素毒性强、危害大，是污染食品种类最多的污染物，我国是世界上黄曲霉毒素污染最严重国家之一，近年总体呈现污染加重趋势，严重威胁食品安全和人民健康。黄曲霉毒素是自然界毒性最强的一类真菌毒素，其中黄曲霉毒素B1是国际癌症研究组织(International Agency for Research on Cancer,IARC)认定的I类致癌物，已引发过多起人畜群体中毒事件，成为肝癌病例高发的主要原因之一。根据近5年Web of Science检索数据统计：黄曲霉毒素污染食品及原料种类超过了110种，高居污染物首位。因此，筛选黄曲霉毒素防控菌，对推进黄曲霉毒素绿色防控技术发展与应用具有重要意义。

现有黄曲霉毒素防控菌筛选方法归纳起来，主要是通过检测处理后的黄曲霉毒素含量，通过比较黄曲霉毒素含量差异从而评价筛选出效果较好的防控菌。然而，这类常规方法筛选出来的生防菌仍存在两个重要疑问没有解决：(1)生防菌是否有抑制黄曲霉生长的效果？ (2)生防菌是否能够从黄曲霉毒素的生物合成的源头阻断毒素合成？要解答上述两个重要疑问，一方面仍需要进一步通过抑菌试验来测定生防菌对黄曲霉毒素产毒菌生长得抑菌效果，另一方面仍需要通过测定黄曲霉毒素生物合成通路——如一系列前体物质。

那么，如何才能实现黄曲霉毒素防控菌的一步式高效筛选？

针对这一瓶颈难题，发明人团队经过多年攻关研究，成功发现了一种黄曲霉毒素产毒菌产毒力指示分子——对于在相同产毒条件下培养的不同产毒菌株，该指示分子含量与菌株的黄曲霉毒素产毒力成正相关。进一步研究还发现，对于同一株黄曲霉毒素产毒菌而言，在一定培养时间内，该指示分子含量与菌的生产量成正相关。经深入研究发现，只要该指示分子的产生被抑制，黄曲霉毒素合成通路的源头也一定被抑制。在此基础上，成功发明了一种高效筛选黄曲霉毒素防控菌的方法，并应用于高效筛选出既能源头抑制黄曲霉毒素合成，又能抑制黄曲霉毒素产毒菌生长的有效防控菌，为黄曲霉毒素高效绿色防控提供了重要支撑。

发明内容

本发明针对现有技术存在的不足，提供一步式高效筛选黄曲霉毒素防控菌的方法及其应用，其应用于一步式高效筛选出既能源头抑制黄曲霉毒素合成，又能抑制黄曲霉毒素产毒菌生长的有效防控菌，容易推广应用。

为解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案为：

一步式高效筛选黄曲霉毒素防控菌的方法，测定候选黄曲霉毒素生防菌试验处理组和对照组指示分子AFT-YJFZ01含量，计算生防菌对指示分子AFT-YJFZ01抑制率，根据指示分子AFT-YJFZ01抑制率结果，高效筛选黄曲霉毒素防控菌，所述的指示分子AFT-YJFZ01氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；抑制率越高，则表明其同时抑制黄曲霉毒素源头合成及抑制产毒菌生长的效果越好，从而筛选出效果较好的黄曲霉毒素防控菌。

按上述方案，所述的黄曲霉毒素生防菌试验处理组和对照组可以但不限于通过如下步骤实现：花生仁粉末、黄曲霉产毒菌孢子、系列候选防控菌混合在培养基中培养一定时间，获得试验处理组，其中用培养基代替候选防控菌培养一定时间则获得对照组。

按上述方案，所述的花生仁粉末，可以但不限于是中花6号、鲁花8号等品种去壳后研磨制成的粉末状产物。

按上述方案，所述的黄曲霉产毒菌孢子，可以但不限于是5×10⁵及以上cfu/mL的黄曲霉产毒菌孢子液。黄曲霉产毒菌指可产黄曲霉毒素的黄曲霉产毒菌，比如黄曲霉菌标准产毒菌株3.4408等，但并不限于此。

按上述方案，所述的培养基可以是液态的沙氏培养基，也可以是其他具有类似功效的培养基。

按上述方案，所述的混合在培养基中培养一定时间可以但不限于是24h及以上。

黄曲霉毒素指示分子浓度的定量检测，可通过采用指示分子分子AFT-YJFZ01的氨基酸序列或其中的部分序列，通过常规抗体制备流程，制备出与该蛋白质对应的抗体，并实现对该指示分子肽的定量检测，也可以通过其他检测技术手段实现对这些与该指示分子肽有一一对应关系的定量检测，从而达到上述检测，部分序列是指与该黄曲霉毒素指示分子蛋白质有一一对应关系的全序列中的一部分。

具体地，所述的指示分子AFT-YJFZ01含量可以但不限于通过如下步骤实现：

a处理组与对照组培养一定时间后，对培养物充分匀浆，制备成待测溶液，加入到孔底包被有指示分子AFT-YJFZ01的纳米抗体或单克隆抗体的酶标板孔中，反应，洗板；

b加入指示分子AFT-YJFZ01多克隆抗体反应，洗板；

c加入与指示分子AFT-YJFZ01多克隆抗体发生结合反应的辣根过氧化物酶标记抗体，反应，洗板；

d加入显色液反应；加入终止液，酶标仪读取并计算待测溶液中AFT-YJFZ01的含量；

用系列浓度的起标准物质作用的指示分子AFT-YJFZ01纯品溶液，替换待测溶液，用于制作标准曲线，再根据酶标仪读数计算指示分子AFT-YJFZ01含量。

所述的生防菌对AFT-YJFZ01的抑制率，可以通过如下方式计算：抑制率＝(对照组AFT-YJFZ01含量-处理组AFT-YJFZ01含量)/对照组AFT-YJFZ01含量×100％。

按上述方案，AFT-YJFZ01的多克隆抗体与AFT-YJFZ01的纳米抗体或单克隆抗体的动物源不同，可利用指示分子AFT-YJFZ01直接作抗原，制备获得纳米抗体或单克隆抗体、以及兔源多克隆抗体，具体地：

指示分子AFT-YJFZ01的纳米抗体或单克隆抗体的获得可采用如下方法：利用AFT-YJFZ01作为免疫抗原，采用常规方式免疫羊驼或者Balb/c鼠，再利用已知常规的纳米抗体或鼠源单克隆抗体制备技术方案即可研制获得；

指示分子AFT-YJFZ01的多克隆抗体的获得可采用如下方法：利用AFT-YJFZ01作为免疫抗原，采用常规方式免疫新西兰大白兔等试验兔，再利用已知常规的多克隆抗体制备技术方案即可研制获得黄曲霉毒素指示分子AFT-YJFZ01的兔源多克隆抗体；

所述的与指示分子子AFT-YJFZ01的多克隆抗体发生结合反应的辣根过氧化物酶标记的抗体为辣根过氧化物酶标记羊抗兔抗体，可以直接购买商品获得。

所述的ELISA包被缓冲液是指常规碳酸盐缓冲液，配制方法为：称取NaHCO₃1.465g、 Na₂CO₃ 0.795g,加入去离子水定容至500mL即可。

所述的ELISA显色液是指ELISA常规的双氧水与TMB显色液。

所述的终止液是指ELISA常规的显色终止液2mol/L硫酸水溶液，配制方法为：取44mL浓硫酸加入到300mL去离子水中，搅拌到冷却，最后定容至400mL即可。

本发明提供的一步式高效筛选黄曲霉毒素防控菌方法用于筛选出但不限于解淀粉酶芽孢杆菌、路德维希肠杆菌和拟康氏木霉菌等黄曲霉毒素防控菌。

本发明基于(1)黄曲霉毒素的产毒菌产毒力指示分子AFT-YJFZ01肽一旦被抑制，则黄曲霉毒素生物合成通路的源头也一定被抑制；(2)对于同一产毒菌株，黄曲霉毒素的产毒菌产毒力指示分子AFT-YJFZ01肽与菌株生长量呈正相关关系，由此成功发明了一步式高效筛选既能源头抑制黄曲霉毒素合成，又能抑制黄曲霉毒素产毒菌生长的有效防控菌，能应用于筛选出解淀粉酶芽孢杆菌、路德维希肠杆菌和拟康氏木霉菌等黄曲霉毒素防控菌，为黄曲霉毒素高效绿色防控提供了重要支撑。

本发明有益效果在于：

1.可用于一步式筛选出同时抑制黄曲霉毒素源头合成及其产毒菌生长的黄曲霉毒素防控菌，2.易操作，实用性强，容易推广应用，3.对发展黄曲霉毒素微生物防控技术与保障食品安全具有重要意义。

附图说明

图1为黄曲霉毒素产毒菌产毒力指示分子AFT-YJFZ01免疫快速检测方法标准曲线。

具体实施方式

指示分子AFT-YJFZ01的初始获得用发掘方法：

(1)取黄曲霉强产毒力菌株，培养获得菌株培养物和胞外分泌蛋白质混合物；然后将菌株培养物细胞破碎，获得胞内蛋白质混合物；将上述胞外分泌蛋白质混合物和胞内蛋白质混合物合并，加入碳二亚胺偶联获得黄曲霉抗原；

(2)将上述黄曲霉抗原免疫试验动物，获得纳米抗体库或单克隆抗体库；

(3)获得不同产毒力的黄曲霉菌株的蛋白质合并溶液，利用步骤(2)获得的抗体库中的抗体，检测不同产毒力的黄曲霉菌株的蛋白质，获得系列检测信号；

(4)找出检测信号与上述黄曲霉菌株产毒力呈现正相关的纳米抗体，即黄曲霉菌株产毒力指示分子抗体，与黄曲霉菌株产毒力指示分子抗体对应的蛋白质即发掘出的黄曲霉菌株产毒力指示分子。

上述方案中，步骤(1)的黄曲霉强产毒力菌株是通过常规方法从自然界分离、鉴定，或者通过人工改造获得，其产毒力经NY/T 2311—2013标准方法鉴定结果不小于10μg/kg。

步骤(3)中所述的不同产毒力的黄曲霉菌株不少3株，其产毒力经NY/T 2311—2013 标准方法鉴定结果呈现为高、中、低至少3个层次。

所述的黄曲霉强产毒力菌株培养中采用的培养基为察氏培养基或者其他可供黄曲霉正常生长的营养物，培养时间不少于12h，培养的环境温度为15～35℃。

所述的菌株培养物细胞破碎是通过常规液氮研磨或者细胞破碎仪等方法。

所述的碳二亚胺的用量为每1.0mL合并的胞外分泌蛋白质混合物和胞内蛋白质混合物中，加入碳二亚胺量为0.005～0.1g。

所述的偶联反应指在15～37℃反应2～6h，在4～10℃反应过夜。

所述的免疫是常规免疫方式，接种黄曲霉抗原。所述的试验动物是指小白鼠或者羊驼或者其他具有相似效果的试验动物。

按上述方案，所述的抗体制备流程是指常规的纳米抗体制备技术流程或者常规的基于细胞融合的杂交瘤单克隆抗体制备技术流程。

按上述方案，所述的检测不同产毒力的黄曲霉菌株的蛋白质是指采用常规的Western Blot技术流程，即将不同产毒力的黄曲霉菌株的蛋白质移至硝酸纤维素膜上，再利用上述抗体库中抗体，经直接方法或者间接方法检测，或者采用具有类似功效的其他技术流程。

按上述方案，上述直接方法是指将上述抗体库中抗体通过常规方法与信号材料偶联，再与上述移至硝酸纤维素膜上的相应蛋白质发生免疫结合反应。

按上述方案，上述间接方法是指将上述抗体库中抗体先与上述移至硝酸纤维素膜上的相应蛋白质发生免疫结合反应，然后再利用第二抗体与信号材料偶联物与上述结合到硝酸纤维素膜上的抗体发生免疫结合反应。

上述检测中信号材料是辣根过氧化物酶或者是胶体金或者是荧光材料或者是具有类似功效的其他材料。检测信号是显色反应信号或者是斑点信号或者是荧光信号。

指示分子AFT-YJFZ01抗体可以在获知黄曲霉毒素指示指示分子AFT-YJFZ01全部序列后，利用其全部肽段或部分肽段通过常规的抗体制备技术流程制备获得。

按照如下配方配置察氏培养基：3％(w/v)蔗糖，0.3％(w/v)NaNO3，0.1％(w/v)K2HPO4，0.05％(w/v)MgSO4·7H2O，0.05％(w/v)KCl，0.001％(w/v)FeSO4，pH6.5，配置获得察氏培养基。随机选取公开文献《中国典型花生产区黄曲霉菌分布、产毒力与侵染研究》——中国农业科学院硕士学位论文，作者张杏，第33页——公布的产毒真菌菌株 HLJ-1、HeNZY-2、HuBha-24、JXZS-29-2、LNct-6、GXfc-34、GDZJ-108-19、JSnt-1、 HuNdx-7、HBHA-8-17等10株，分别接种到上述察氏培养基中，于28℃200rpm/min培养 5天后，常规方法充分匀浆、破碎细胞，再用常规的蛋白质纯化系统、蛋白质电泳、免疫亲和等方法，即可纯化获得指示AFT-YJFZ01。试验结果表明，上述产毒真菌菌株培养物中均可以制备得到AFT-YJFZ01，在同样培养条件下，HBHA-8-17制备得到AFT-YJFZ01的量最多，而HLJ-1制备得到AFT-YJFZ01的量最少。

所述的免疫亲和方法，是利用指示分子AFT-YJFZ01的纳米抗体或单克隆抗体，通过常规方法制备成免疫亲和柱，再利用免疫亲和方法从黄曲霉毒素产毒真菌细胞破碎液中富集纯化，去离子水溶解获得。具体可用上样液稀释黄曲霉毒素产毒真菌细胞破碎液，经常规滤纸过滤后，再连续加到上述免疫亲和柱中，待基本流尽时，再免疫亲和柱常规淋洗液洗涤柱体，最后用pH 2.2的甘氨酸缓冲液或者70％甲醇水溶液洗脱，收集洗脱液后通过常规超滤离心方法及时去除溶液，再用无菌水从超滤离心管中溶解出留在超滤离心管内的蛋白质，即可获得指示分子AFT-YJFZ01水溶液。

实施例1黄曲霉毒素产毒菌产毒力指示分子AFT-YJFZ01的纳米抗体制备

利用AFT-YJFZ01作为免疫抗原，采用常规方式免疫羊驼或者Balb/c鼠，再利用已知常规的纳米抗体或鼠源单克隆抗体制备技术方案即可研制获得。

将上述制备获得的AFT-YJFZ01溶解在常规PBS缓冲液或者生理盐水中至浓度不低于 0.1mg/mL，再和弗氏完全佐剂等体积混合乳化，通过背部皮下或皮内多点注射方式免疫羊驼，之后每隔2-4周加强免疫1次，加强免疫时用弗氏不完全佐剂替换弗氏完全佐剂。采用常规ELISA流程监测免疫效果，至羊驼血清效价不再上升后，随后对免疫羊驼的静脉取血、提取总RNA、合成cDNA、VHH基因的扩增、VHH基因片段的回收、VHH基因与双酶切处理的pCANTAB 5E(his)载体的连接、连接产物电转化、构建纳米抗体基因库以及纳米抗体基因库的拯救等操作按照专利文献CN103866401A的方法完成，最终获得拯救后的纳米抗体基因库。

将上述制备获得的AFT-YJFZ01按8μg/孔、2μg/孔、0.5μg/孔、0.1μg/孔的梯度固定在96孔酶标板等固相载体上，参考专利文献CN103866401A的方法对上述拯救后的纳米抗体基因库进行2-4次淘选，再用AFT-YJFZ01和间接非竞争ELISA鉴定每一噬菌体克隆产生的抗体，阳性结果对应的噬菌体为噬菌体阳性克隆，再将此阳性克隆通过纳米抗体制备的常规方式制备出纳米抗体，即为AFT-YJFZ01的纳米抗体，用于进一步应用研究工作，优选经ELISA方法表征，具有特异性强、亲和力高的纳米抗体。

实施例2黄曲霉毒素产毒菌产毒力指示分子AFT-YJFZ01的单克隆抗体制备

利用AFT-YJFZ01作为免疫抗原，采用常规方式免疫羊驼或者Balb/c鼠，再利用已知常规的纳米抗体或鼠源单克隆抗体制备技术方案即可研制获得。

将上述制备获得的AFT-YJFZ01溶解在常规PBS缓冲液或者生理盐水中至浓度不低于 0.1mg/mL，再和弗氏完全佐剂等体积混合乳化，通过背部皮下或皮内多点注射方式BALB/c 鼠，之后每隔2-4周加强免疫1次，加强免疫时用弗氏不完全佐剂替换弗氏完全佐剂。采用常规ELISA流程监测免疫效果，至BALB/c鼠血清效价不再上升后，随后分离免疫小鼠脾细胞、脾细胞与鼠源骨髓瘤细胞SP2/0融合、半固体培养基对杂交瘤细胞的选择性培养操作按照专利文献CN103849604A的方法完成，待半固体培养基上长出针尖白色斑点后，将白色斑点分别挑取到内置杂交瘤常规培养基的96孔培养板，从而获得单克隆杂交瘤资源库。

参考专利文献CN103849604A的方法获取上述单克隆杂交瘤培养上清即单克隆抗体，将上述制备获得的AFT-YJFZ01按8μg/孔、2μg/孔、0.5μg/孔、0.1μg/孔的梯度固定在96孔酶标板等固相载体上，再用间接非竞争ELISA程序鉴定每一单克隆抗体，挑取阳性克隆，获得AFT-YJFZ01单克隆抗体，并用于进一步应用研究工作，优选经检测具有特异性强、亲和力高的AFT-YJFZ01单克隆抗体。

实施例3黄曲霉毒素产毒菌产毒力指示分子AFT-YJFZ01的兔源多克隆抗体制备

利用AFT-YJFZ01作为免疫抗原，采用常规方式免疫新西兰大白兔等试验兔，再利用已知常规的兔多克隆抗体制备技术方案即可研制获得。

将上述制备获得的AFT-YJFZ01直接用作抗原，以浓度不低于0.1mg/mL的溶液与弗氏完全佐剂等体积混合乳化，通过背部皮下或皮内多点注射方式新西兰大白兔，之后每隔2-4 周加强免疫1次，加强免疫时用弗氏不完全佐剂替换弗氏完全佐剂。采用常规ELISA流程监测免疫效果，至免疫动物血清效价不再上升后，通过常规方法制备获得免疫动物的血清，即为黄曲霉毒素产毒菌产毒力指示分子AFT-YJFZ01的特异性兔源多克隆抗体。

实施例4黄曲霉毒素产毒菌产毒力指示分子AFT-YJFZ01的免疫快速检测方法建立

AFT-YJFZ01的免疫快速检测方法即双抗夹心间接非竞争ELISA方法的基本操作程序：酶标板中包被AFT-YJFZ01的特异性纳米抗体，洗板；加入封闭液封闭，洗板；加入AFT-YJFZ01或待测液反应，洗板；加入AFT-YJFZ01兔源多克隆抗体反应，洗板；加入辣根过氧化物酶标记的羊抗兔抗体反应，洗板；加入显色液反应；加入终止液，酶标仪毒素并计算结果。以下工作均采用该基本程序完成。

抗体最佳浓度的确定：采用设计棋盘滴定法同时进行多个平行实验，采用不同浓度的上述特异性纳米抗体包被，另外将上述兔源多克隆抗体设置为不同浓度，最终根据结果确定纳米抗体和兔源多克隆抗体的最佳工作浓度，即在节省抗体用量的原则下选择OD450nm值近似1.0的点所对应的上述两种抗体浓度，ELISA结果研究表明，虽然上述纳米抗体和兔源多克隆抗体的其他浓度也可以实现检测，但是上述纳米抗体的最佳包被浓度为2.0μg/mL，上述兔源多克隆抗体的最佳浓度为3.0μg/mL。

最佳抗体包被条件的确定：包被是ELISA方法研究的第一步，包被效果的好坏对ELISA的结果有着非常关键的影响。为确定不同包被条件对检测结果的影响，选择了4℃包被过夜、37℃恒温包被2h、37℃恒温包被1h三种不同的条件包被在孔内，检测结果表明，研究的三种包被方式均可以实现包被，但是4℃下包被过夜为最佳包被条件。

最佳封闭剂的确定：抗体完成包被以后，为了避免酶标板孔未被占用的位点对ELISA 后续的步骤造成干扰，需要利用一些惰性蛋白即封闭剂来占用这些位点，而不适当的封闭剂会与二抗非特异性结合，造成假阳性的情况。本研究采用3％BSA/PBST、3％脱脂奶粉 /PBST、5％脱脂奶粉/PBST三种不同的封闭剂进行封闭，研究结果表明，虽然三种封闭剂均可不同程度的达到封闭的目的，但是5％脱脂奶粉/PBST的封闭效果最佳，为最佳封闭剂。

封闭时间的确定：研究分别设置37℃恒温封闭1h、2h、3h三种不同的封闭时长进行封闭，检测的结果表明37℃、封闭2h的设置下阳性孔OD450nm值/阴性孔OD450nm值的数值最大，阳性样品OD450nm值＞1，因此37℃恒温封闭2h为最佳封闭时间。

上述兔源多克隆抗体反应时间的确定：研究分别采用37℃恒温反应30min、50min、1h 三个反应时长进行反应，检测结果表明：37℃恒温下反应50min为上述兔源多克隆抗体的最佳反应时间。

黄曲霉毒素产毒菌产毒力指示分子AFT-YJFZ01的ELISA标准曲线绘制：将AFT-YJFZ01分子分别稀释至0.00003、0.0003、0.003、0.03、0.3、3、30、300ng/mL，每孔200 μL入孔，采用上述最佳条件绘制AFT-YJFZ01的ELISA标准曲线，结果见图1。在上述最佳优化条件下建立的双抗夹心酶联免疫吸附分析方法的相关系数达0.9980，对AFT-YJFZ01 分子检测限可达到0.1ng/mL，表明该检测方法具有良好的检测灵敏度和准确度。

方法特异性评价：为评价黄曲霉毒素产毒菌产毒力指示分子AFT-YJFZ01的上述免疫检测方法的特异性，研究选取几株与黄曲霉菌具有一定同源性的真菌尖孢镰刀菌、黑曲霉、赭曲霉菌、串珠镰刀菌等，通过对这些真菌培养物的细胞破碎液进行检测，结果见表1，上述方法对与黄曲霉菌有同源性的真菌的蛋白质均无明显的交叉反应，表明建立的黄曲霉毒素产毒菌产毒力指示分子AFT-YJFZ01免疫快速检测方法具有良好的特异性。

表1.黄曲霉毒素产毒菌产毒力指示分子免疫快速检测方法特异性测定结果

方法重复性评价：为评价上述建立的黄曲霉毒素产毒菌产毒力指示分子AFT-YJFZ01免疫快速检测方法的重复性，随机取4株黄曲霉毒素的产毒菌株——阳性1、阳性2、阳性3、阳性4和1株黄曲霉毒素的不产毒菌株——阴性5研究，对测定结果的板内、板间的数据变异进行分析。上述研究结果见表2、3，经计算板内变异系数为0.5％-3.5％，板间的变异系数为0.9％-5.7％，均在7％以下，因此，上述方法具有良好的重复性。

表2.指示分子AFT-YJFZ01免疫快速检测方法板内重复性测定结果

表3指示分子AFT-YJFZ01免疫快速检测方法板间重复性测定结果

方法准确度评价：为了评价上述方法的检测准确度，同时也是为了考察方法的实用性，选择花生和玉米样品为例进行研究评价，在玉米和花生样品中添加黄曲霉毒素产毒菌产毒力指示分子AFT-YJFZ01，检测结果的回收率越接近100％，说明方法越准确、越实用。该研究结果见表4，结果表明，上述建立的黄曲霉毒素产毒菌产毒力指示分子免疫快速检测方法用于检测花生和玉米中产毒力指示分子AFT-YJFZ01，其回收率达到了82.5％-109.5％，说明该方法准确度高，可以应用到实际样品检测中去，具有良好的实用性。

表4.黄曲霉毒素产毒菌产毒力指示分子免疫快速检测方法添加回收试验结果

实施例5黄曲霉毒素防控菌的筛选——细菌菌株

1)待筛选细菌菌株的制备：将12株待筛选细菌菌株——见表5——分别在LB平板中活化，在37℃培养箱中培养24h，用挑针挑取活化出的待筛选菌株的单菌落，转移至装有15mL LB液体培养基的三角瓶中，于28℃、200r·min-1振荡培养12h。吸1％培养液转接至装有15mL LB液体培养基培的三角瓶中，28℃、200r·min-1振荡培养12h，获得待筛选菌株的发酵液，终浓度为1×10⁷CFU/mL。

2)黄曲霉毒素产毒菌的制备：以《中国典型花生产区黄曲霉菌分布、产毒力与侵染研究》——中国农业科学院硕士学位论文，作者张杏，第33页——公布的黄曲霉毒素产毒菌株HuNdx-7为例，挑取少量HuNdx-7菌株的菌液，接种在DG18固体培养基上活化，28℃恒温黑暗条件倒置培养，待DG18培养基上长满黄绿色孢子后，取0.1％吐温水冲洗孢子，收集即制成孢子悬浮液，高倍显微镜下进行计数，计算孢子悬浮液中孢子浓度，取上述孢子悬浮液转移至200ml的沙氏液体培养基中，至孢子终浓度为5×10⁵cfu/ml。

3)防控试验：将上述12株待筛选菌株发酵液分别与黄曲霉毒素产毒菌株孢子悬浮液共同培养于含有中花6号花生粉末的沙氏液体培养基中，28℃200rpm共培养1天，每个处理设置3个重复，其中用沙氏培养基代替待筛选菌株培养一定时间则获得对照组。

4)指示分子AFT-YJFZ01含量的测定与防控菌的选择：采用实施例4建立的方法，测定上述试验处理组和对照组指示分子AFT-YJFZ01含量，通过如下方式计算待筛选菌株对AFT-YJFZ01的抑制率：

AFT-YJFZ01抑制率＝(对照组AFT-YJFZ01含量-处理组AFT-YJFZ01含量)/对照组AFT-YJFZ01含量×100％

上述研究结果见表5，结果表明，不同菌株之间AFT-YJFZ01抑制率存在显著差异，AFT-YJFZ01抑制率越高，则表明同时抑制黄曲霉毒素源头合成及其产毒菌生长的效果越好，由此推断并筛选出效果较好的黄曲霉毒素防控菌解淀粉芽孢杆菌(菌株01)、侧孢短芽孢杆菌、路德维希肠杆菌、短黄杆菌等菌株，可以用于进一步制剂研制与开发利用。

表5待筛选的12株生防菌对AFT-YJFZ01抑制效果

5)验证确认：为进一步验证上述一步法筛选结果的可靠性，采用常规多步法——抑菌试验+抑制产毒试验。

将上述步骤1)最终的待筛选菌株的发酵液与2)最终孢子悬浮液共培养于沙氏液体培养基中，28℃200rpm共培养1天，每个处理设置3个重复，其中用沙氏培养基代替待筛选菌株培养一定时间则获得对照组。采用《GB 5009.22-2016食品安全国家标准食品中黄曲霉毒素B族和G族的测定》中的高效液相色谱-质谱联用方法测定处理组与对照组黄曲霉毒素水平，通过如下方式计算待筛选菌株对黄曲霉毒素的抑制率：

黄曲霉毒素抑制率＝(对照组黄曲霉毒素含量-处理组黄曲霉毒素含量)/对照组黄曲霉毒素含量×100％

上述黄曲霉毒素抑制率计算结果见表6。

通过将上述菌丝洗净、晾干，测定处理组与对照组菌丝干重，通过如下方式计算待筛选菌株对产毒菌的抑制率：

产毒菌抑制率＝(对照组产毒菌干重-处理组产毒菌干重)/对照组产毒菌干重×100％

计算对产毒菌生长抑制效果，结果见表6。

表6上述待筛选的12株生防菌对黄曲霉毒素与产毒菌生长抑制效果

根据上述研究结果，解淀粉芽孢杆菌(菌株01)、侧孢短芽孢杆菌、路德维希肠杆菌、短黄杆菌等菌株对黄曲霉毒素与产毒菌生长抑制效果显著优于其他菌株，由此确认本发明技术方案结果是正确可靠。

实施例6黄曲霉毒素防控菌的筛选——真菌菌株

1)待筛选菌株的制备：将12株待筛选的真菌菌株——见表7——分别用接种针从斜面培养基钩取大小合适的菌块，接种至PDA培养基，放置于恒温培养箱中，于25±1℃、90％湿度培养，待长满孢子后，取0.1％吐温水冲洗孢子，收集即制成孢子悬浮液，高倍显微镜下进行计数，计算孢子悬浮液中孢子浓度，取上述孢子悬浮液转移至200ml的沙氏液体培养基中，至孢子终浓度为5×10⁵cfu/ml，获得的即为待筛选菌株发酵液。

2)黄曲霉毒素产毒菌的制备：以《中国典型花生产区黄曲霉菌分布、产毒力与侵染研究》——中国农业科学院硕士学位论文，作者张杏，第33页——公布的黄曲霉毒素产毒菌株HuNdx-7为例，挑取少量HuNdx-7菌株的菌液，接种在DG18固体培养基上活化，28℃恒温黑暗条件倒置培养，待DG18培养基上长满黄绿色孢子后，取0.1％吐温水冲洗孢子，收集即制成孢子悬浮液，高倍显微镜下进行计数，计算孢子悬浮液中孢子浓度，取上述孢子悬浮液转移至200ml的沙氏液体培养基中，至孢子终浓度为5×10⁵cfu/ml。

3)防控试验：将上述系列待筛选菌株发酵液分别与黄曲霉毒素产毒菌株孢子悬浮液共同培养于含有鲁花8号花生粉末的沙氏液体培养基中，28℃200rpm共培养1天，每个处理设置3个重复，其中用沙氏培养基代替待筛选菌株培养一定时间则获得对照组。

4)指示分子AFT-YJFZ01含量的测定与防控菌的选择：采用实施例4建立的方法，测定上述试验处理组和对照组指示分子AFT-YJFZ01含量，通过如下方式计算待筛选菌株对AFT-YJFZ01的抑制率：

抑制率＝(对照组AFT-YJFZ01含量-处理组AFT-YJFZ01含量)/对照组AFT-YJFZ01含量×100％

计算生防菌对AFT-YJFZ01的抑制率，结果见表7。根据AFT-YJFZ01抑制率越高，则表明同时抑制黄曲霉毒素源头合成及其产毒菌生长的效果越好的原则，由表7很容易筛选出效果较好的黄曲霉毒素防控菌拟康氏木霉、哈茨木霉和黄曲霉不产毒菌株(菌株编号12)等，可以用于进一步生防制剂研制与利用。

表7待筛选的12株生防菌对AFT-YJFZ01抑制效果

上述实施例5和6中的黄曲霉产毒菌HuNdx-7只是一个列举，并不限于此，使用其他黄曲霉产毒菌如黄曲霉菌标准产毒菌株3.4408也可。

综合上述实例，本发明技术方案可用于一步式筛选出同时抑制黄曲霉毒素源头合成及其产毒菌生长的黄曲霉毒素防控菌，易操作，实用性强，容易推广应用，对发展黄曲霉毒素微生物防控技术与保障食品安全具有重要意义。

＜110＞ 中国农业科学院油料作物研究所

＜120＞ 一步式高效筛选黄曲霉毒素防控菌的方法

＜160＞ 1

＜210＞ 1

＜211＞ 33172

＜212＞ PRT

＜213＞ 黄曲霉

＜400＞ 1

AIGVEEPEAD PTYYHNAIGV EEPEADPTYY HNNKAIGVEE PEADPTYYHN NKTTASMVWE 60

EAQQVSGKAS VETPASIEAA SELSKAVSPS FEDVWSQPRD GAGQMFIPLN PNAYSPNTLN 120

KDGAGQMFIP LNPNAYSPNT LNKGSPKDGV YVDKSVTSGF VDGIKDGLRD VGGPIEDQNS 180

LQVGDRDVHG FATRFEQLPI NQPRFGKPVG AVGSAAFGKP VGAVGSAATA LKGDNEIPQA 240

ATAHDSAWDF FSQQPSGDNE IPQAATAHDS AWDFFSQQPS SLHGPNFEQL PINQPRGPTL 300

LEDFIFRGVD FTEDPLLQGR GVGAHGVFTS YHGGPNFEQL PINQPRHVDG FGIHTFRLAS 360

VETPASIEAA SELSKLFSYL DTQLNRLFYN SLTPAEQQFV VDAIRNAGIQ TSRNAGIQTS 420

RDGVYVDKNS LTPAEQQFVV DAIRNYFAET EQVMFQPGHN YFAETEQVMF QPGHIVRPEE 480

YVPITKPLQI VIDGFRPNAY SPNTLNKPVG AVGSAATALK QDLFEAIEAG RQLSEDGVDV 540

VVVAERSEDG VDVVVVAERS LTPAEQQFVV DAIRSMVWEE AQQVSGKSPS FEDVWSQPRS 600

VETPASIEAA SELSKSVTSG FVDGIKDGLR TTDVGTFGQK VDFTEDPLLQ GRVETPASIE 660

AASELSKVGF LASVETPASI EAASELSKYP EWELGVQIMD EEDQLKFDHE RVPERFGFDL 720

FDPTKFDLFD PTKFGKPVGA VGSAATNPDF MRQDLFEAIE AGRFVTDNGD SKLVKFVTDN 780

GDSKSVTSGF VDGIKGFDLF DPTKVPVHNN NRDGAGQMFI PLNPNAYSPN TLNKIVPEEY 840

VPITKDGVYV DKSVTSGFVD GIKFENSNVK SSVVRVGGPI EDQNSLQVGD RGDNEIPQAA 900

TAHDSVTSGF VDGIKDTTDV GTFGQKLKGV GAHGVFTGDN EIPQAATAHF VVDAIRTLLE 960

DFIFRFTEDP LLQGRPDLIH AVKPRVDGFG IHTFRGVGAH GVFYLDTQLN RNVIIQLNRK 1020

PVGAVGSAAT ALKDGVYVDK NNVIIQLNRI VPEEYVPITK LGKTPAEQQF VVDAIRFENS 1080

NVKEQVMFQP GHIVRGVDFT EDPLLQGRAI GVEEPEADPT YYHNAIGVEE PEADPTYYHN 1140

ASMVWEEAQQ VSGKASMVWE EAQQVSGKAS MVWEEAQQVS GKASMVWEEA QQVSGKASMV 1200

WEEAQQVSGK ASMVWEEAQQ VSGKASMVWE EAQQVSGKAS MVWEEAQQVS GKASMVWEEA 1260

QQVSGKASMV WEEAQQVSGK ASMVWEEAQQ VSGKASMVWE EAQQVSGKAS MVWEEAQQVS 1320

GKASMVWEEA QQVSGKASMV WEEAQQVSGK ASMVWEEAQQ VSGKASMVWE EAQQVSGKAS 1380

MVWEEAQQVS GKASMVWEEA QQVSGKASMV WEEAQQVSGK ASMVWEEAQQ VSGKASMVWE 1440

EAQQVSGKAS MVWEEAQQVS GKASMVWEEA QQVSGKASMV WEEAQQVSGK ASMVWEEAQQ 1500

VSGKASMVWE EAQQVSGKAS MVWEEAQQVS GKAVSPSFED VWSQPRAVSP SFEDVWSQPR 1560

AVSPSFEDVW SQPRAVSPSF EDVWSQPRAV SPSFEDVWSQ PRAVSPSFED VWSQPRAVSP 1620

SFEDVWSQPR AVSPSFEDVW SQPRAVSPSF EDVWSQPRAV SPSFEDVWSQ PRAVSPSFED 1680

VWSQPRAVSP SFEDVWSQPR AVSPSFEDVW SQPRAVSPSF EDVWSQPRAV SPSFEDVWSQ 1740

PRAVSPSFED VWSQPRAVSP SFEDVWSQPR AVSPSFEDVW SQPRAVSPSF EDVWSQPRAV 1800

SPSFEDVWSQ PRAVSPSFED VWSQPRAVSP SFEDVWSQPR AVSPSFEDVW SQPRAVSPSF 1860

EDVWSQPRAV SPSFEDVWSQ PRAVSPSFED VWSQPRDGAG QMFIPLNPNA YSPNTLNKDG 1920

AGQMFIPLNP NAYSPNTLNK DGAGQMFIPL NPNAYSPNTL NKDGAGQMFI PLNPNAYSPN 1980

TLNKDGAGQM FIPLNPNAYS PNTLNKDGAG QMFIPLNPNA YSPNTLNKDG AGQMFIPLNP 2040

NAYSPNTLNK GSPKDGAGQM FIPLNPNAYS PNTLNKGSPK DGVYVDKDGV YVDKDGVYVD 2100

KSVTSGFVDG IKDGVYVDKS VTSGFVDGIK FENSNVKSSV VRFGFDLFDP TKFGFDLFDP 2160

TKFGKPVGAV GSAATALKFG KPVGAVGSAA TALKFGKPVG AVGSAATALK FGKPVGAVGS 2220

AATALKFGKP VGAVGSAATA LKFGKPVGAV GSAATALKFG KPVGAVGSAA TALKFGKPVG 2280

AVGSAATALK FGKPVGAVGS AATALKFGKP VGAVGSAATA LKFGKPVGAV GSAATALKFG 2340

KPVGAVGSAA TALKFGKPVG AVGSAATALK FVTDNGDSKF VTDNGDSKLV KFVTDNGDSK 2400

LVKFVTDNGD SKLVKGPTLL EDFIFRGVDF TEDPLLQGRG VDFTEDPLLQ GRGVDFTEDP 2460

LLQGRGVDFT EDPLLQGRGV DFTEDPLLQG RGVDFTEDPL LQGRHGGPNF EQLPINQPRH 2520

GGPNFEQLPI NQPRHGGPNF EQLPINQPRH GGPNFEQLPI NQPRHGGPNF EQLPINQPRH 2580

GGPNFEQLPI NQPRHGGPNF EQLPINQPRH GGPNFEQLPI NQPRHGGPNF EQLPINQPRH 2640

GGPNFEQLPI NQPRHGGPNF EQLPINQPRH GGPNFEQLPI NQPRHGGPNF EQLPINQPRH 2700

GGPNFEQLPI NQPRHGGPNF EQLPINQPRH GGPNFEQLPI NQPRHGGPNF EQLPINQPRH 2760

GGPNFEQLPI NQPRHGGPNF EQLPINQPRH GGPNFEQLPI NQPRHGGPNF EQLPINQPRH 2820

GGPNFEQLPI NQPRHGGPNF EQLPINQPRH VDGFGIHTFR HVDGFGIHTF RHVDGFGIHT 2880

FRHVDGFGIH TFRHVDGFGI HTFRHVDGFG IHTFRHVDGF GIHTFRHVDG FGIHTFRHVD 2940

GFGIHTFRHV DGFGIHTFRH VDGFGIHTFR HVDGFGIHTF RHVDGFGIHT FRHVDGFGIH 3000

TFRHVDGFGI HTFRHVDGFG IHTFRHVDGF GIHTFRHVDG FGIHTFRHVD GFGIHTFRHV 3060

DGFGIHTFRI VPEEYVPITK IVPEEYVPIT KIVPEEYVPI TKLFSYLDTQ LNRLFSYLDT 3120

QLNRLFSYLD TQLNRLFSYL DTQLNRLFYN SLTPAEQQFV VDAIRLFYNS LTPAEQQFVV 3180

DAIRNAGIQT SRNAGIQTSR DGVYVDKNNV IIQLNRNYFA ETEQVMFQPG HNYFAETEQV 3240

MFQPGHIVRN YFAETEQVMF QPGHIVRNYF AETEQVMFQP GHIVRNYFAE TEQVMFQPGH 3300

IVRNYFAETE QVMFQPGHIV RNYFAETEQV MFQPGHIVRN YFAETEQVMF QPGHIVRNYF 3360

AETEQVMFQP GHIVRNYFAE TEQVMFQPGH IVRNYFAETE QVMFQPGHIV RNYFAETEQV 3420

MFQPGHIVRN YFAETEQVMF QPGHIVRNYF AETEQVMFQP GHIVRNYFAE TEQVMFQPGH 3480

IVRNYFAETE QVMFQPGHIV RQDLFEAIEA GRQDLFEAIE AGRQLSEDGV DVVVVAERQL 3540

SEDGVDVVVV AERQLSEDGV DVVVVAERQL SEDGVDVVVV AERSLQGKAS MVWEEAQQVS 3600

GKSLQGKASM VWEEAQQVSG KSPSFEDVWS QPRSVTSGFV DGIKSVTSGF VDGIKDGLRS 3660

VTSGFVDGIK DGLRSVTSGF VDGIKDGLRS VTSGFVDGIK DGLRSVTSGF VDGIKDGLRS 3720

VTSGFVDGIK DGLRSVTSGF VDGIKDGLRS VTSGFVDGIK DGLRSVTSGF VDGIKDGLRS 3780

VTSGFVDGIK DGLRTTDVGT FGQKTTDVGT FGQKTTDVGT FGQKTTDVGT FGQKTTDVGT 3840

FGQKLKTTDV GTFGQKLKVG FLASVETPAS IEAASELSKV GFLASVETPA SIEAASELSK 3900

VGFLASVETP ASIEAASELS KVGFLASVET PASIEAASEL SKVGFLASVE TPASIEAASE 3960

LSKVGFLASV ETPASIEAAS ELSKVPVHNN NRDGAGQMFI PLNPNAYSPN TLNKVPVHNN 4020

NRDGAGQMFI PLNPNAYSPN TLNKVPVHNN NRDGAGQMFI PLNPNAYSPN TLNKYPEWEL 4080

GVQIMDEEDQ LKYPEWELGV QIMDEEDQLK ALFNRDIATG KANNYCSNQV EGPYSLYSGR 4140

DIATGKVSIA KDYACPWNGG EEVSLKDYAC PWNGGEEVSL KVEYSDAAKE GDPEMYGNNE 4200

TVNKVCAKAN NYCSNQVEGP YSLYSGREPG ICETTPGVKE QTASVVNGTA VIKGFSATGD 4260

YPRGGPGSSS MIGLMQENGP CRGYLEDIAY VLDSGIKGYY DISHFDPDIG LMQENGPCRL 4320

AAEGDPEMYG NNETVNKNAP LSIWMNGGPG SSSMIGLMQE NGPCRNQVEG PYSLYSGRNY 4380

CSNQVEGPYS LYSGRPGGCK DQIIECRQVE GPYSLYSGRQ YGNFSFTRSN QVEGPYSLYS 4440

GRTNASYVGG LVRTVYDMAM EAWSKTVYDM AMEAWSKPGG TVYDMAMEAW SKPGGCKVAL 4500

VYGDRDYACP WNGGEEVSLK VFEAGHEVPA YQPETAYEIF VFEAGHEVPA YQPETAYEIF 4560

HRVSIWTESY GGRYCSNQVE GPYSLYSGRY GPSFTAFFQE QNEKVALVYG DRVEYSDAAK 4620

FRISYKEPGI CETTPGVKFT AFFQEQNEKS IWTESYGGRN YIVVDADSSF WFFESRISYK 4680

EPGIHDDRVS IWTESYGGRY GPSFTAFFQE QNEKVALVYG DRDYAANNYC SNQVEGPYSL 4740

YSGRANNYCS NQVEGPYSLY SGRANNYCSN QVEGPYSLYS GRANNYCSNQ VEGPYSLYSG 4800

RANNYCSNQV EGPYSLYSGR ANNYCSNQVE GPYSLYSGRA NNYCSNQVEG PYSLYSGRAN 4860

NYCSNQVEGP YSLYSGRANN YCSNQVEGPY SLYSGRANNY CSNQVEGPYS LYSGRANNYC 4920

SNQVEGPYSL YSGRANNYCS NQVEGPYSLY SGRANNYCSN QVEGPYSLYS GRANNYCSNQ 4980

VEGPYSLYSG RANNYCSNQV EGPYSLYSGR ANNYCSNQVE GPYSLYSGRA NNYCSNQVEG 5040

PYSLYSGRAN NYCSNQVEGP YSLYSGRANN YCSNQVEGPY SLYSGRDIAT GKVSIAKDYA 5100

CPWNGGEEVS LKDYACPWNG GEEVSLKGDP EMYGNNETVN KVCAKANNYC SNQVEGPYSL 5160

YSGRGGPGSS SMIGLMQENG PCRIGLMQEN GPCRIGLMQE NGPCRISYKE PGICETTPGV 5220

KISYKEPGIC ETTPGVKISY KEPGICETTP GVKISYKEPG ICETTPGVKI SYKEPGICET 5280

TPGVKISYKE PGICETTPGV KISYKEPGIC ETTPGVKNAP LSIWMNGGPG SSSMIGLMQE 5340

NGPCRNAPLS IWMNGGPGSS SMIGLMQENG PCRNAPLSIW MNGGPGSSSM IGLMQENGPC 5400

RNAPLSIWMN GGPGSSSMIG LMQENGPCRN APLSIWMNGG PGSSSMIGLM QENGPCRNAP 5460

LSIWMNGGPG SSSMIGLMQE NGPCRNAPLS IWMNGGPGSS SMIGLMQENG PCRNAPLSIW 5520

MNGGPGSSSM IGLMQENGPC RNAPLSIWMN GGPGSSSMIG LMQENGPCRN APLSIWMNGG 5580

PGSSSMIGLM QENGPCRNAP LSIWMNGGPG SSSMIGLMQE NGPCRPGGCK DQIIECRTVY 5640

DMAMEAWSKT VYDMAMEAWS KTVYDMAMEA WSKTVYDMAM EAWSKTVYDM AMEAWSKTVY 5700

DMAMEAWSKT VYDMAMEAWS KTVYDMAMEA WSKPGGTVYD MAMEAWSKPG GTVYDMAMEA 5760

WSKPGGCKTV YDMAMEAWSK PGGCKTVYDM AMEAWSKPGG CKTVYDMAME AWSKPGGCKT 5820

VYDMAMEAWS KPGGCKTVYD MAMEAWSKPG GCKTVYDMAM EAWSKPGGCK TVYDMAMEAW 5880

SKPGGCKVAL VYGDRDYACP WNGGEEVSLK VALVYGDRDY ACPWNGGEEV SLKVALVYGD 5940

RDYACPWNGG EEVSLKVALV YGDRDYACPW NGGEEVSLKV ALVYGDRDYA CPWNGGEEVS 6000

LKVALVYGDR DYACPWNGGE EVSLKVALVY GDRDYACPWN GGEEVSLKVA LVYGDRDYAC 6060

PWNGGEEVSL KVALVYGDRD YACPWNGGEE VSLKVALVYG DRDYACPWNG GEEVSLKVFE 6120

AGHEVPAYQP ETAYEIFHRV FEAGHEVPAY QPETAYEIFH RVFEAGHEVP AYQPETAYEI 6180

FHRVFEAGHE VPAYQPETAY EIFHRVFEAG HEVPAYQPET AYEIFHRVFE AGHEVPAYQP 6240

ETAYEIFHRV FEAGHEVPAY QPETAYEIFH RVFEAGHEVP AYQPETAYEI FHRVFEAGHE 6300

VPAYQPETAY EIFHRVSIWT ESYGGRVSIW TESYGGRVSI WTESYGGRVS IWTESYGGRV 6360

SIWTESYGGR VSIWTESYGG RVSIWTESYG GRVSIWTESY GGRVSIWTES YGGRVSIWTE 6420

SYGGRVSIWT ESYGGRVSIW TESYGGRYGP SFTAFFQEQN EKYGPSFTAF FQEQNEKYGP 6480

SFTAFFQEQN EKAAWLFEDS QAKADEINQI FDAISYMKAD VPSGSTNITH GRAFPCFDEP 6540

ALKAGMIADA GALASSGYQS TSGLLSLLKA VEQSLDAIRD GHILQQFKFA AGETSAIHPN 6600

IRGFDNEAEF IVWNEIVARI VDVLLDEKIV DVLLDEKNSG ASRLNADHSA IYRLTFTGIL 6660

NDNMAGFYRN GGEKEYNVVY DRNQDIYMPL GGLRNVGFPV VTVAEDAASS SIKSSHPIEV 6720

PVKSSHPIEV PVKRTGDVRP EEDTTLYPVM LGLRTHEIGW EFSEKTKQGL DENTMLTERT 6780

LGLALSDEVK VYATPDQDIE HGRYLASTQM EPTDARYLGE DVFIQGVRQG LLTVEDRGSV 6840

FSIVLKAAQE MFQRQGLDEN TMLTERTDVE SWLKAGMIAD AGALASSGYQ STSGLLSLLK 6900

FAAGETSAIH PNIRLTFTGI LNDNMAGFYR NGGEKEYNVV YDRNGGEKEY NVVYDRNGGE 6960

KEYNVVYDRN GGEKEYNVVY DRNQDIYMPL GGLRVYATPD QDIEHGRYLA STQMEPTDAR 7020

AWYENGITNC VGDNTRCCDS GVEQLVSFSD VSDFKDADAC NGGGIEYDSP ADTPLEFKDN 7080

TCNAPIPVSF PVAPTDTKDP YMFHQANLRD QCNYSLQYTI GNKFAANGNY GSETTAAVIN 7140

NFNGRFTTSA SDGFDGMQVN PRGNGVIEAA AGKGNVAGNI LVIAKITTAD MDGISSWLPT 7200

INGKIYYNCD TPACTVQEWI DTSAGSGDFS NLLATEKKPL GTGTDLWPKL DDLFVWWTTP 7260

ANRLVDWPIV TITHQEMSAN MNAGSSYFVE VGHNMNAGSS YFVEVGHNGN GVIEAAAGKQ 7320

AWVETMVQEF VRSMWPYFTT SASDGFDGMQ VNPRTPLLNQ QNSMWPYFTT SASDGFDGMQ 7380

VNPRVIANGN VAGNILVIAK YFTSNGIIPP AITGLHNGDA LRQITGVTLS AKSASDGFDG 7440

MQVNPRDPYM FHQANSDVSD FKEAGLKGII PPAITGLHNG DALRYFTSNG IIPPAITGLH 7500

NEISFNQAWL RLVDWPIVTI THQEMSANFL DRKPLGTGTD LANGNVAGNI LVIAKHQEMS 7560

ANFLDRYNRD QCNYSLQYTI GNKAWYENGI TNCVGDNTRA WYENGITNCV GDNTRAWYEN 7620

GITNCVGDNT RAWYENGITN CVGDNTRAWY ENGITNCVGD NTRAWYENGI TNCVGDNTRA 7680

WYENGITNCV GDNTRAWYEN GITNCVGDNT RDADACNGGG IEYDSPADTP LEFKDADACN 7740

GGGIEYDSPA DTPLEFKDAD ACNGGGIEYD SPADTPLEFK DNTCNAPIPV SFPVAPTDTK 7800

DNTCNAPIPV SFPVAPTDTK DPYMFHQAND PYMFHQANLR DPYMFHQANL RDPYMFHQAN 7860

LRDPYMFHQA NLRDQCNYSL QYTIGNKEIS FNQAWLREIS FNQAWLREIS FNQAWLREIS 7920

FNQAWLREIS FNQAWLREIS FNQAWLREIS FNQAWLRFAA NGNYGSETTA AVINNFNGRF 7980

AANGNYGSET TAAVINNFNG RFAANGNYGS ETTAAVINNF NGRFAANGNY GSETTAAVIN 8040

NFNGRFAANG NYGSETTAAV INNFNGRFAA NGNYGSETTA AVINNFNGRF AANGNYGSET 8100

TAAVINNFNG RFAANGNYGS ETTAAVINNF NGRFAANGNY GSETTAAVIN NFNGRITTAD 8160

MDGISSWLPT INGKITTADM DGISSWLPTI NGKITTADMD GISSWLPTIN GKITTADMDG 8220

ISSWLPTING KITTADMDGI SSWLPTINGK KPLGTGTDLW PKKPLGTGTD LWPKKPLGTG 8280

TDLWPKKPLG TGTDLWPKKP LGTGTDLWPK KPLGTGTDLW PKKPLGTGTD LWPKKPLGTG 8340

TDLWPKKPLG TGTDLWPKKP LGTGTDLWPK KPLGTGTDLW PKKPLGTGTD LWPKLDDLFV 8400

WWTTPANRLD DLFVWWTTPA NRLDDLFVWW TTPANRLDDL FVWWTTPANR LVDWPIVTIT 8460

HQEMSANLVD WPIVTITHQE MSANFLDRLV DWPIVTITHQ EMSANFLDRM NAGSSYFVEV 8520

GHNGNGVIEA AAGKMNAGSS YFVEVGHNGN GVIEAAAGKM NAGSSYFVEV GHNGNGVIEA 8580

AAGKMNAGSS YFVEVGHNGN GVIEAAAGKM NAGSSYFVEV GHNGNGVIEA AAGKMNAGSS 8640

YFVEVGHNGN GVIEAAAGKM NAGSSYFVEV GHNGNGVIEA AAGKMNAGSS YFVEVGHNGN 8700

GVIEAAAGKM NAGSSYFVEV GHNGNGVIEA AAGKTPLLNQ QNSMWPYFTT SASDGFDGMQ 8760

VNPRTPLLNQ QNSMWPYFTT SASDGFDGMQ VNPRTPLLNQ QNSMWPYFTT SASDGFDGMQ 8820

VNPRTPLLNQ QNSMWPYFTT SASDGFDGMQ VNPRTPLLNQ QNSMWPYFTT SASDGFDGMQ 8880

VNPRTPLLNQ QNSMWPYFTT SASDGFDGMQ VNPRTPLLNQ QNSMWPYFTT SASDGFDGMQ 8940

VNPRVIANGN VAGNILVIAK VIANGNVAGN ILVIAKYFTS NGIIPPAITG LHNGDALRAS 9000

HTVDKNGIWS SEVKATDNYI ANAAAAVAKD LLQDIVTWDD KEAGIYLIAR GPLNEGGLYA 9060

ERGTNYVALS LWALESDGAK HTDYSSQEST SYKLGSFELS YTTPVLTGYG NVESPEQPKL 9120

SGQDASAITW KLTGNLGGED YQDKLTGNLG GEDYQDKVRN SAYNYWVPEL PTEGTSPGFS 9180

TSKPGIGFYT AQFDLDLPKQ GFHQPQPPSE SWESGSPLEG LSKSPGSFFV VRSSYDDSAW 9240

VSADLPKTSY DYGSPITETR YPDADYMQYV MDQARNGIWS SEVKVLVLYG GPKASPSYLT 9300

ATPRYLDTLP EIKTLHLEQS PSTPYAQLYV NGYQYGKKAD IVVPFPWGGP GFEKAQLYVN 9360

GYQYGKAQLY VNGYQYGKAT DNYIANAAAA VAKLSGQDAS AITWKLTGNL GGEDYQDKVR 9420

NGIWSSEVKQ GFHQPQPPSE SWESGSPLEG LSKSSYDDSA WVSADLPKYP DADYMQYVMD 9480

QARYPDADYM QYVMDQARAL TNGAGAIKEA IADVLEHLGE NDEDIAVYAP NPFYKGFAPL 9540

EYLGSNFENG ELPKGFDNAG FVMGTSSSLF NQFILRGKMP MPILVADGRH FQLINTAAYW 9600

KIPNVAIAVS GGGYRLNGTD IPNFLKLNLS SFDASGYIDR LPDICNTCFK MPMPILVADG 9660

RNSILEGPDV KSAAALSTSE KDWLQVRSSS LFNQFILRTF LNLGLNKTNT KLPDICNTCF 9720

KTSLTDYWGR SSFDASGYID RSTSEKDWLQ VRGTDIPNFL KLNLGLNKGF DNAGFVMGTS 9780

SSLFNQFEYL GSNFENGELP KMPILVADGR DLYDAVKINT AAYWKSIALG DDFKKALTNG 9840

AGAIKALTNG AGAIKALTNG AGAIKALTNG AGAIKGKMPM PILVADGRGK MPMPILVADG 9900

RGKMPMPILV ADGRGKMPMP ILVADGRGKM PMPILVADGR GKMPMPILVA DGRHFQLINT 9960

AAYWKHFQLI NTAAYWKLPD ICNTCFKLPD ICNTCFKMPI LVADGRMPMP ILVADGRMPM 10020

PILVADGRMP MPILVADGRM PMPILVADGR MPMPILVADG RMPMPILVAD GRMPMPILVA 10080

DGRMPMPILV ADGRMPMPIL VADGRNSILE GPDVKNSILE GPDVKNSILE GPDVKSAAAL 10140

STSEKDWLQV RSAAALSTSE KDWLQVRSAA ALSTSEKDWL QVRSAAALST SEKDWLQVRS 10200

AAALSTSEKD WLQVRSAAAL STSEKDWLQV RSAAALSTSE KDWLQVRSAA ALSTSEKDWL 10260

QVRSAAALST SEKDWLQVRS AAALSTSEKD WLQVRSAAAL STSEKDWLQV RSAAALSTSE 10320

KDWLQVRSAA ALSTSEKDWL QVRSAAALST SEKDWLQVRS AAALSTSEKD WLQVRSAAAL 10380

STSEKDWLQV RSAAALSTSE KDWLQVRSAA ALSTSEKDWL QVRSAAALST SEKDWLQVRS 10440

AAALSTSEKD WLQVRSAAAL STSEKDWLQV RSAAALSTSE KDWLQVRSAA ALSTSEKDWL 10500

QVRSAAALST SEKDWLQVRS AAALSTSEKD WLQVRSAAAL STSEKDWLQV RTNTKLPDIC 10560

NTCFKTNTKL PDICNTCFKT NTKLPDICNT CFKAASLPAS FSGFKALVSH DGTFVADAKE 10620

NSLVWHQQVL GWLNKFNAVF SGTLKGDAGS PVFSPDSKGD AGSPVFSPDS KKIAYWQMAD 10680

ESYEADHRIQ AFVIYPENFD KLFSIPADAG DDYKPKLNPE GLISAPRLPV SEGLSLFNIL 10740

QERMINWIQG SDLGRNAESP YPPFGGASDY DLSPDGKRSE AIPNPSGDVA VFSQSQYSFK 10800

SEAIPNPSGD VAVFSQSQYS FKTAVPINGP DSPGTPEGVK TAVPINGPDS PGTPEGVKGD 10860

AGSPVFSPDS KTLATANKID PELKTLYVYT VGSEETIPSL AADWDRTTSQ WNVLDLKVVT 10920

TDSGDVRWIQ GSDLGRALVS HDGTFVADAK ALVSHDGTFV ADAKGDAGSP VFSPDSKKIA 10980

YWQMADESYE ADHRIAYWQM ADESYEADHR IAYWQMADES YEADHRLFSI PADAGDDYKP 11040

KLFSIPADAG DDYKPKLNPE GLISAPRRSE AIPNPSGDVA VFSQSQYSFK RSEAIPNPSG 11100

DVAVFSQSQY SFKTAVPING PDSPGTPEGV KTAVPINGPD SPGTPEGVKT AVPINGPDSP 11160

GTPEGVKGDA GSPVFSPDSK TTSQWNVLDL KTTSQWNVLD LKAASNFDGD TLVLGYDSGN 11220

GNPETSFMTL MRAGSTIAVT DVQITGGAVG IKASGTCSGP IQSAPTSYWL ADQDHSGDAR 11280

DAGSPKPVVQ IGHEGDVGVA EIQNMRFSVA EILPGAKGDG STDDSASLNA ILANNAANCK 11340

GTCSGPIQSA PTSYWLADQD HSGDARIVGE AWAVITGAGD AFKNSQILIQ NLSHDNSNAI 11400

AVDSKNSQIL IQNLSHDNSN AIAVDSKDNI KNVVLDTTAL SANTKSAPTS YWLADQDHSG 11460

DARVGTIITG DPLDPPVLKV TNSPSNLVWY SISTRYPAEV FLPGGTYQLG KSLGSLVLLD 11520

SSSINSGPVV RDTLVIPPGS RAQPTYAEYS NDQIVNVKSG TCSGPIQSAP TSYWLADQDH 11580

SGDARAGSTI AVTDVQITGG AVGIKAQPTY AEYSNDQIVN VKAQPTYAEY SNDQIVNVKD 11640

AGSPKPVVQI GHEGDVGVAE IQNMRFSVAE ILPGAKNSQI LIQNLSHDNS NAIAVDSKNS 11700

QILIQNLSHD NSNAIAVDSK NSQILIQNLS HDNSNAIAVD SKNSQILIQN LSHDNSNAIA 11760

VDSKDNIKNS QILIQNLSHD NSNAIAVDSK DNIKNSQILI QNLSHDNSNA IAVDSKDNIK 11820

NVVLDTTALS ANTKSAPTSY WLADQDHSGD ARVTNSPSNL VWYSISTRVT NSPSNLVWYS 11880

ISTRAGALLL GKAGVIPESL HQDTVGTFGK DRLETTAGSW ALLGSVVPRG IMDETYYQAL 11940

EFCQRGKTPE GGYAQFLTNK GPLHGIPFIV KIHQTQPYLN AILQVNPDAF KLETTAGSWA 12000

LLGSVVPRNS VVGIKPTVGL TSRTIVSPDG FNWDYGSTRT PEGGYAQFLT NKTTREEGID 12060

AALKVDFYNN LKDYLSEVEN TKAALSEWAD MRALGTETDG SVINPAQREE GIDAALKDAV 12120

YALDAIYGID ARAALSEWAD MRAALSEWAD MRAGVIPESL HQDTVGTFGK AGVIPESLHQ 12180

DTVGTFGKAG VIPESLHQDT VGTFGKAGVI PESLHQDTVG TFGKGIMDET YYQALEFCQR 12240

IHQTQPYLNA ILQVNPDAFK NSVVGIKPTV GLTSRNSVVG IKPTVGLTSR NSVVGIKPTV 12300

GLTSRTIVSP DGFNWDYGST RTTREEGIDA ALKAVWPGDM GVAVPAAFVS TGDLESVKAY 12360

QGYFHSNDDL LNRDGSASYV MPDKDRAVWP GDMGVAVPAA FVSTGDLESV KDSAFPGLWE 12420

ENIYAPSSRG GSGALGLAFS EAKGVYYVDD TATITVSGGG SHRIWYSGAY TLQTNAVPVN 12480

TGRNALQTMY DTQDKNALQT MYDTQDKTTG AFDESGPPLS QKSPDGYTLQ FSVPPGTKSS 12540

EKPSITIDGN NINKTTGAFD ESGPPLSQKI APQFGDLKAL ELIRRFQASW DKSPDGYTLQ 12600

FSVPPGTKIS SFEIQGHFKA VWPGDMGVAV PAAFVSTGDL ESVKAYQGYF HSNDDLLNRA 12660

YQGYFHSNDD LLNRAYQGYF HSNDDLLNRA YQGYFHSNDD LLNRDGSASY VMPDKDGSAS 12720

YVMPDKDRAV WPGDMGVAVP AAFVSTGDLE SVKGVYYVDD TATITVSGGG SHRGVYYVDD 12780

TATITVSGGG SHRISSFEIQ GHFKNALQTM YDTQDKNALQ TMYDTQDKNA LQTMYDTQDK 12840

NALQTMYDTQ DKTTGAFDES GPPLSQKNAL QTMYDTQDKT TGAFDESGPP LSQKNALQTM 12900

YDTQDKTTGA FDESGPPLSQ KNALQTMYDT QDKTTGAFDE SGPPLSQKSP DGYTLQFSVP 12960

PGTKSPDGYT LQFSVPPGTK SSEKPSITID GNNINKSSEK PSITIDGNNI NKSSEKPSIT 13020

IDGNNINKTT GAFDESGPPL SQKDNILPEN LDDGLPSQFV YEKFGPHEYN GDQYTSIIRL 13080

VIDLSGNGGG YILQGYDTFR NVGLVSVSLD GKPSSDPMQG IGGIKQLFPS IVQDGYTRSD 13140

KYAGEYEFQA DLFKSFEPST PAEFQAVLEK YAGEYEFQAD LFKPFAASTP GFDGYFSGSA 13200

RAASTPGFDG YFSGSARYDL NLENKAFNLA HDGHFRHFTS LEEKFFPDLL TKSIAIGGRP 13260

SSDPMQGIGG IKFGPHEYNG DQYTSIIRFG PHEYNGDQYT SIIRQLFPSI VQDGYTRQLF 13320

PSIVQDGYTR QLFPSIVQDG YTRSDKYAGE YEFQADLFKE PGAEGVCETT PGVKFANQMP 13380

NGCQDLISTC KGCQDLISTC KQLPKNPTGV KSAGYTPLKV NGVEYGETRS YSGYVDTSPE 13440

SHTFTALADY ALCAEATNMC RTIFGWDIAE GQKTIFGWDI AEGQKKVYEA GHEVPYYQPI 13500

ASLYKEPGAE GVCETTPGVK LSGLPSLDSR SYSGYVDTSP ESHTFFHNPE TAPITLWLNK 13560

IWPSYKVYEA GHEVPYYQPI ASVNGVEYGE TRTALADYAL CAEATNMCAE GVCETTPGVK 13620

FANQMPNGCQ DLISTCKFAN QMPNGCQDLI STCKFANQMP NGCQDLISTC KFANQMPNGC 13680

QDLISTCKFA NQMPNGCQDL ISTCKFANQM PNGCQDLIST CKKIWPSYKK IWPSYKSAGY 13740

TPLKVNGVEY GETRSAGYTP LKVNGVEYGE TRSAGYTPLK VNGVEYGETR SAGYTPLKVN 13800

GVEYGETRSA GYTPLKVNGV EYGETRSAGY TPLKVNGVEY GETRSAGYTP LKVNGVEYGE 13860

TRSAGYTPLK VNGVEYGETR SAGYTPLKVN GVEYGETRSA GYTPLKVNGV EYGETRSAGY 13920

TPLKVNGVEY GETRTALADY ALCAEATNMC RTALADYALC AEATNMCRTA LADYALCAEA 13980

TNMCRTALAD YALCAEATNM CRTALADYAL CAEATNMCRT ALADYALCAE ATNMCRTALA 14040

DYALCAEATN MCRTALADYA LCAEATNMCR TALADYALCA EATNMCRTIF GWDIAEGQKT 14100

IFGWDIAEGQ KTIFGWDIAE GQKTIFGWDI AEGQKTIFGW DIAEGQKTIF GWDIAEGQKT 14160

IFGWDIAEGQ KTIFGWDIAE GQKTIFGWDI AEGQKTIFGW DIAEGQKTIF GWDIAEGQKT 14220

IFGWDIAEGQ KTIFGWDIAE GQKKVNGVEY GETRVNGVEY GETRVNGVEY GETRYKEPGA 14280

EGVCETTPGV KYKEPGAEGV CETTPGVKYK EPGAEGVCET TPGVKYKEPG AEGVCETTPG 14340

VKYKEPGAEG VCETTPGVKA SDFWANELVT WWNKEAEPSQ EYVSYSHGVF LRFSYEEGEK 14400

FLNKGAKDDV FIKGGSILPM QEVALTTRKA TGDVLFNTKN AHGQEILLRN HNVLSAIPQE 14460

PYRQYQLSTV GLPAMQQYNT LGFHQCRSSE AEPSQEYVSY SHGVFLRTLG GSVDLTFYSG 14520

PTQAEVTKWA SVIDATKSEA EPSQEYVSYS HGVFLRAEPS QEYVSYSHGV FLRAEPSQEY 14580

VSYSHGVFLR AEPSQEYVSY SHGVFLRAEP SQEYVSYSHG VFLRASDFWA NELVTWWNKE 14640

AEPSQEYVSY SHGVFLREAE PSQEYVSYSH GVFLREAEPS QEYVSYSHGV FLRFSYEEGE 14700

KFLNKGGSIL PMQEVALTTR GGSILPMQEV ALTTRNAHGQ EILLRNAHGQ EILLRNHNVL 14760

SAIPQEPYRN HNVLSAIPQE PYRNHNVLSA IPQEPYRNHN VLSAIPQEPY RNHNVLSAIP 14820

QEPYRSEAEP SQEYVSYSHG VFLRWASVID ATKWASVIDA TKDPSINDDS VMIYAPAVRF 14880

LDEALTYPPP KGIQINDPSI NDDSVMIYAP AVRIASAMLD EEDEKYFNVK NGDQSPPSAL 14940

GPLPSVIERP SINDDSVMIY APAVRTDYSV CGETTIFKVY LTGESYAGQY IPYIASAMLD 15000

EEDEKVYLTG ESYAGQYIPY IASAMLDEED EKYFNVKIAS AMLDEEDEKT DYSVCGETTI 15060

FKNGDQSPPS ALGPLPSVIE RVYLTGESYA GQYIPYTLIA GAGLLGTAHT ERETTIFKNG 15120

DQSPPSALGP LPSVIERTDV QKALHVPRDD SVMIYAPAVR FLDEALTYPP PKGIQINDPS 15180

INDDSVMIYA PAVRGIQIND PSINDDSVMI YAPAVRGIQI NDPSINDDSV MIYAPAVRGI 15240

QINDPSINDD SVMIYAPAVR IASAMLDEED EKIASAMLDE EDEKYFNVKI ASAMLDEEDE 15300

KYFNVKIASA MLDEEDEKYF NVKIASAMLD EEDEKYFNVK IASAMLDEED EKYFNVKIAS 15360

AMLDEEDEKY FNVKIASAML DEEDEKYFNV KNGDQSPPSA LGPLPSVIER TDYSVCGETT 15420

IFKNGDQSPP SALGPLPSVI ERTDYSVCGE TTIFKNGDQS PPSALGPLPS VIERVYLTGE 15480

SYAGQYIPYI ASAMLDEEDE KYFNVKAHIL PPNGRDLNPN GSQFITPGGK DLNPNGSQFI 15540

TPGGKNDPVA VFDGSVIPKE AGLVPFQVSP TTKFHVLTAQ LSFPRFRDLN PNGSQFITPG 15600

GKLDRPPVIP LPPSDSDVTA FRNDPVAVFD GSVIPKPVAV FDGSVIPKTI SNVVDNELAR 15660

TTNGIVSTNE SGRDPVAVFD GSVIPKFALS TWARILPATS QVSTKAHILP PNGRAHILPP 15720

NGRAHILPPN GRDLNPNGSQ FITPGGKFAL STWARFALST WARFHVLTAQ LSFPRFHVLT 15780

AQLSFPRFRD LNPNGSQFIT PGGKFRDLNP NGSQFITPGG KFRDLNPNGS QFITPGGKND 15840

PVAVFDGSVI PKTISNVVDN ELARTISNVV DNELARTISN VVDNELARTT NGIVSTNESG 15900

RDWSDSYYQG PAFKFGLGAD NTLAFEVVTA DGQLVTASRG VGSDAWTVSE SGRITNEYVP 15960

QLEAVTPGSG CYQNEGNFRN VLENNPTGMA SVLRSKWDPN NFFYVLKTTA LTDLGIAYKV 16020

SAGVMGYQIL NAAHAKVSYT EYDSYYDHYN KYMGPLPYGN LAVATYQYGG RWDPNNFFYV 16080

LKDWSDSYYQ GPAFKGVGSD AWTVSESGRG VGSDAWTVSE SGRGVGSDAW TVSESGRGVG 16140

SDAWTVSESG RITNEYVPQL EAVTPGSGCY QNEGNFRNVL ENNPTGMASV LRNVLENNPT 16200

GMASVLRVSA GVMGYQILNA AHAKVSAGVM GYQILNAAHA KVSAGVMGYQ ILNAAHAKVS 16260

AGVMGYQILN AAHAKVSAGV MGYQILNAAH AKVSAGVMGY QILNAAHAKV SAGVMGYQIL 16320

NAAHAKVSYT EYDSYYDHYN KYMGPLPYGN LAVATYQYGG RALMNGAGAI KDAGYETSIT 16380

DYWGRDFFNH VTIKDGNWTT CVGCAILSRG FVPLEYVGSK HVYDAVQDKP TVYGFVPLEY 16440

VGSKTNTQVP DACTQCFQKQ ADMPMPLLVA DGRTAFSDIL AKSIALTDTF KILDSATYYK 16500

ALMNGAGAIK ALMNGAGAIK ALMNGAGAIK ALMNGAGAIK ALMNGAGAIK ALMNGAGAIK 16560

ALMNGAGAIK ALMNGAGAIK ALMNGAGAIK DAGYETSITD YWGRDAGYET SITDYWGRDA 16620

GYETSITDYW GRDAGYETSI TDYWGRDAGY ETSITDYWGR DFFNHVTIKD FFNHVTIKDF 16680

FNHVTIKDFF NHVTIKGFDN AGFVMGTSSS LFNQFMPLLV ADGRMPLLVA DGRMPMPLLV 16740

ADGRMPMPLL VADGRMPMPL LVADGRMPMP LLVADGRMPM PLLVADGRMP MPLLVADGRM 16800

PMPLLVADGR QADMPMPLLV ADGRQADMPM PLLVADGRQA DMPMPLLVAD GRQADMPMPL 16860

LVADGRTSIT DYWGRAHDDT VNYLYEELKK ATAFAVATYA NDLSSIPKGG DPNNVVALGG 16920

HTDSVEAGPG INDDGSGIIS NLVIAKGPYS AIVGISLEDG QKNLGCSEAD YPSDVEGKQP 16980

QVHLWSNADQ TLKTMTYSPS VEVTADVAVV KTTYNVVAQT KVGDEEIEAK AHDDTVNYLY 17040

EELKKAHDDT VNYLYEELKK AHDDTVNYLY EELKKQPQVH LWSNADQTLK TMTYSPSVEV 17100

TADVAVVKAG QFPISANDGA TSTKAGVLSW SYTWSPADKE AASAALAAGY KFDGVTWDEE 17160

NWLLKFDPSA AIYPWTSGRF VGGASTDAFA DPKLLPEEGI YITPNLPPQI PYVKPSAAIY 17220

PWTSGRVVLT LTGIEPSTIY TAEEENQVRA YVASDSELEY VTWTVDNRGD WEVTSILSID 17280

QERTLIPADK IPTGKTLSTN EEGYETSAVR VSQTNPTVTL SLLNIASKYP ILFTPYGGPG 17340

AQEVTKDGTD GWLDNLLSMK TLSTNEEGYE TSAVRKFYDS MYTERTLIPA DKIPTGKATS 17400

GGTSAAAPVF AGLVGMLNDA RDFTDITAGS SIGCDGVNPQ TGKGFPDVAA HSLTPRPDVA 17460

AHSLTPRPNS ALPQVLSNSY GDEEQTVPEY YAKSALPQVL SNSYGDEEQT VPEYYAKSYG 17520

DEEQTVPEYY AKVCNLIGLM GLRLKDLVLS LAWYQESAVS KATSGGTSAA APVFAGLVGM 17580

LNDARATSGG TSAAAPVFAG LVGMLNDARA WYQESAVSKA WYQESAVSKD FTDITAGSSI 17640

GCDGVNPQTG KGFPDVAAHS LTPRGFPDVA AHSLTPRGFP DVAAHSLTPR SALPQVLSNS 17700

YGDEEQTVPE YYAKVCNLIG LMGLRDAEEE PYDWSNEGRG ISDGIDWQAG YSAVQKMDDA 17760

EQYEATSRNI YIQSATLDGK PYSKSLNYIP VEDFDYKTLE YSYDDFTIAQ MARTMINPQD 17820

YTGENPLWKD NGIFVNSRSI NGYPLPGGAF VRMDDAEQYE ATSRTLEYSY DDFTIAQMAR 17880

DIDFGENGDG IKDYVPNTQI PVTVAANTFP GGQEGFIDFV KFQESPEGAD FWGARTKVTI 17940

SPELSIRVFQ TAFGPAGTML TYEPIVRADA IVAAIRLAED HINWVEIRVT ISPELSIRHE 18000

LGVDEIWRDI DFGENGDGIK DIDFGENGDG IKFQESPEGA DFWGARLAED HINWVEIRAG 18060

VKPSNYVGDI FGTLGGTPDF GPGRCDVATT DVYYSGKSKY TAEGYEAATK TASNFDQPHS 18120

DESALQHLRY CASAQEDNAT LQALLRYTAE GYEAATKYVD AGGFEPSIKL QALLRSKYTA 18180

EGYEAATKTA SNFDQPHSDE SALQHLRGHL TAMTGDGVND APSLKTAALV QGASDSGHFK 18240

TGTLTANQLS IRAYGIVVAT AKTGDGVNDA PSLKMLTGDA LAIAKLAIEH EVDAHGKIEN 18300

MLSHLSKDKS ETETETEIEI SNKIKEIQEA GDVRLSDELE DDNAPIGFET TKSVEIAQLH 18360

SEVEALVEKY TVTAGELTSD FKEVEVEKEW TKTETKTEIE IERIKEIQEA GDVRASSDDS 18420

NYGWEDSKGI QDAGVIATAK IGAQSTVLLK NFGEIGDASE YVYPEGLERY TPPNFSSWTR 18480

VNEFVDVQRA VDIVSQMTLT EKDSPNWDVD SDALPAIPEG AKEIPVGYSA ADIDTNRGVD 18540

YQPGGSSNLA DPIADAEGCK RNTLAFFSGN EVINDGPSSK YGLVEIDDGK VKTLADFDAL 18600

KYGLVEIDDG KVKDLMQAMA DFGPKFPGGN NLEGDTLDGR TGEVYASAVI VSKYPSNLDA 18660

WIPVDGSALS LKYVEVGNED NLNDGLDSYK FQAFYDAIKE QTYTGSFYVK ASLGHPEPWT 18720

VKDLMQAMAD FGPKELPSGP YFVSLYTGEV FKGISPEAHQ SLTTFTRLYP DDNLAFIQAG 18780

ISDEKQLLLA GGGWDGKSLF VSVYSVGTTD YRLYYTPTAE KPLAGLRGIS PEAHQSLTTF 18840

TRQLLLAGGG WDGKDSLSEA IAYAKGGGGG TFGVVMESTH RIANECQNQE LFWALRSQGG 18900

TAVIEEFPSW YEFYQKYVVP NAVTVGNAHF AATRSSGQGT LSLWTRAVTV GNAHFAATRG 18960

GGGGTFGVVM ESTHRGGGGG TFGVVMESTH RGGGGGTFGV VMESTHRIAN ECQNQELFWA 19020

LRSSGQGTLS LWTRYVVPNA VTVGNAHFAA TRYVVPNAVT VGNAHFAATR YVVPNAVTVG 19080

NAHFAATRAS SVSGVITLSD GRTTADSDGN FSFENVRVQD ETWELSDGSY ITKYDWSDFI 19140

NSAKYEEFEV PAGTLVKIWQ IGTLDRAYTQ YTETSVYGML KDGDLVTQQN ELQGKHEGWI 19200

DEAAVQEAKL HYGAYSIKSN LFNSYSENQV LLPASVYGSY KETYGSAAGW DKLADALAAS 19260

SLPEAWWGEN YEPLLNIKGG GGGTFGVVIE STHRIANECQ NQDLFWALRV EPQLSFVAAV 19320

IKYVTSNAVS VGVTHFAGSR AVFETAEGRG GGGGTFGVVI ESTHRYVTSN AVSVGVTHFA 19380

GSRDAEVAPP NDPVDPMAPD SSTKFEGYLP DARGSTGNVL VDVSHVLPSF RVGISWLSTE 19440

KLSITATGGD GNGDSQIYVQ KGAVNWEDGY RDAEVAPPND PVDPMAPDSS TKDSVKEDDY 19500

EDLFNYICAK KFTDTPVLYG PKMLDDAGIY LITDLSSPSE SINRSDGQCS DLLKQQLSFV 19560

MNQWYEKYGA YSVCSPKTLP AIESKKFTDT PVLYGPKMLD DAGIYLITDL SSPSESINRS 19620

DGQCSDLLKA DAAGSHGEAL NEVQAKAKAD AAGSHGEALN EVQAKLEAAE QALSEARVGA 19680

LESQLSTEQD AIKEAAESAG TTHSQQLQEL RDALEAAEAA AKIQEQLKGQ TPLPILVADG 19740

RNNILEGPDV KSHLSVVDGG EDGQNIPLHP LIQPERTIDY WTELVDTVKT STTLPEVCSK 19800

AMLNGAGALK AMLNGAGALK AMLNGAGALK AMLNGAGALK AMLNGAGALK GQTPLPILVA 19860

DGRINLGLNK NNILEGPDVK SHLSVVDGGE DGQNIPLHPL IQPERTFINL GLNKTSLTDY 19920

WGRFNVDETA FTGAWGRIGS LAITDVSLPF FKIQGISNPS GALSSGGLGE PKVQNGAVTW 19980

ESDPNRATTV YGESIKSIYA INSGRELDTQ HIHPPDSYFV SPLTRGFTEI DELWNGVTAE 20040

TNAAQDLRQA QVAHDFWQKF YHQVVELNRK DAELTDAGVK LNTGAVIPVL VRELDTQHIH 20100

PPDSYFVSPL TRLNTGAVIP VLVRLNTGAV IPVLVRQAQV AHDFWQKQAQ VAHDFWQKAI 20160

NDYIDSQLDK KGVQISTNIP KSSPWIMLGG SYPGMRYQSL EYQQSLCYRL FSLALKISIP 20220

IDHEDPSMGT YQNRAINDYI DSQLDKKCSS HDDCSDELAC TDGVCACTAD SAVTCSWEGH 20280

CAGAKLNLQY QASGDAKKSL VDFSAARGDN PSILGLRSAV TCSWEGHCAG AKIGTTIDDI 20340

KCTADSAVTC SWEGHCAGAK CTADSAVTCS WEGHCAGAKC TADSAVTCSW EGHCAGAKCT 20400

ADSAVTCSWE GHCAGAKAFP DVAAQGMNFA VYDKELYNIG DYQADANSGS KIAFASYLEE 20460

YARQGLQDIT LGASIGCTGR YADLENFENY LAPWAKAFPD VAAQGMNFAV YDKAFPDVAA 20520

QGMNFAVYDK ELYNIGDYQA DANSGSKYAD LENFENYLAP WAKYADLENF ENYLAPWAKA 20580

GSSPTDIISG ISDKTDALDS AIKKVEQAID DIIAKSAADG LASAITSKSG DDISTTDALA 20640

LPEPVQALTK SPTDIISGIS DKTDALDSAI KAQNDPNAFG VVAARLGACP PGKETALLGD 20700

KPNAFGVVAA RQNDPNAFGV VAARAATYCP ENIEKIENQS DADGYSSCST LKLTGLTTLT 20760

TLSFAALTKS DKLNVIDFPK VGSIEFTALP QLQSLDFTKL NVIDFPKTVN GGFQIARGVA 20820

AWLFERLSFG SIDLENANIN RSLSFIPGVL YDGSPIGKQE STFAAVERSC FEIGKFVDPL 20880

IGSNNGGNVF AGASLPYGMA KGWTQGGSNA DVVLTDAYVK VGISYISTDR AGNWQNLYKA 20940

QHPFLTIVDP EAQSRSVFSQ NESVAAGLKT TAVLFDEGKE ICLAALGRAL VIVSDSIRTD 21000

TIHGVGQNSF YKASHPIEVP VKASHPIEVP VKIMSILLGG AIPDDLKPLV LFDSVTKTAT 21060

ESEPSLSDIE KTGYVNYNVD TTNLRKHNPL VLFDSVTKTS PFPYDSKKHN PLVLFDSVTK 21120

KHNPLVLFDS VTKKHNPLVL FDSVTKTGYV NYNVDTTNLR APTPPDFSLG YIQSKIEQDG 21180

SESLLTNEYA PLKGYAFIWN MPAQGRTSGW GGNPGGYRYQ LASYLRDYLD EYLVFPPAGV 21240

QPQKIYVTGE SYAGRVDHLP DVPFDVGEMY SGLVPIDKDD KNFQELFGIK KTPLDDFRAD 21300

DVLEVNPLAD PEVVSYFRLD ADAITAQYFG NDAPWYRSDY ASFLYGPYRL VFAPQEEKAT 21360

WDGVDADKIR FQYPGDLFDQ GTTIRFTGDA ATVNSIAARP DSDEIYFGGQ FEKNLEVLSL 21420

TKHVAAYSFG SKAWTALGGG VNGPVHKNLA LLDGKDLTDY LMKSYELPDG QVITIGNERV 21480

APEEHPVLLT EAPINPKQEY DESGPSIVHR QEYDESGPSI VHRVAPEEHP VLLTEAPINP 21540

KVAPEEHPVL LTEAPINPKV APEEHPVLLT EAPINPKAEL PEGYPESSAN PAFRDIQYLE 21600

NYQGQGYSGP AVKFVTVTEE TDPDLFWALR LSLGDSGACK DAEVEPANWG VEGRLGGAQL 21660

FTSRTVSLVE DGSNTPATLS AGTFARSLVD IYRTVSLVED GSNTPATLSA GTFARAYVEM 21720

MQCTDEKEPL VRLEKDLPGT TLSSKYYGYG GGNPLGPAQG IGFANELIAR LEKDLPGTTL 21780

SSKLSEAGHS VLLIEKTPIE SDATSYLNDR GGPMGTYLVS ASERVILSAG TFGTPKAVIT 21840

DIVNQQRLIN QVELSEDKTI ARGGSNNFGI VTRLLLSDAM WYTRERPSAQ LLSGKFDTLG 21900

TSGPTAKLAN AYTWEGGRAV ADRIPLAIHD EVSPVGDTDA LLERAPVVQY ALNRDGYMGY 21960

HGVPQIPIYA YKAIHDEVSP VGDTDALLER AIHDEVSPVG DTDALLERAI HDEVSPVGDT 22020

DALLERDGYM GYHGVPQIPI YAYKLAEESA ALGVKVNPII LTGDMWRVSD NAGLGDWVPN 22080

PDRFPDGLTP LVEDVTKALG GTSTINGMAY TRSQLSDYAA ATVKAEDVQI DVWQKALGGT 22140

STINGMAYTR EIGFTVQEDN TDGKIDFGSA PNIVNAIAED RNSPVWPDGI QQTYEYPNRA 22200

STNMITSNSG AGLVPQDENR IGGSAGTELQ SDKITGEVWP VLMAYGQKSA ISQYGDSFAK 22260

SQSDFESEFS TAKVNAGIGI GPDDLVSFIK GNAMDHFSSI MERYGPTYAA YFLDQNEKAI 22320

TETQYEEAKD LTLDLPDIGL QYAGTVKTVA ALINWRNIWD GTTAQNVKKE DLETSSYSFS 22380

GDGKVDFASL QSAATQSTTY SNAPAVKTCS LVFLFPKKED LETSSYSFSG DGKFDGILGL 22440

GFDTISVNKY GSGSLSGFVS QDTLKWYSVY DLGNGAVGLA KDAYSPHEIY SRIFEQLEGM 22500

SLSKTYEVVG NVYKDQVLKD VALIKAVPGT AQQAAAIKDA GEFDVERGTV VTNDQCGGAS 22560

SVRLHLVTAE EADIKIIYDM PDGSSCKGID VAKPTGRVNG VWTVTHSPFE GLSALKSAMT 22620

LPRVNGVWTV THSPFEGLSA LKVPTVLMSP WVGKSIDQFF NDAKNVAPDD PDHSITGGNQ 22680

QVYSTYHPNA KESTLHLVLR IQDKEGIPPD QQRIQDKEGI PPDQQRIQDK EGIPPDQQRD 22740

VSLVANHIDT VGKTAATVNT WTGGWSDSKA IGTYQNSGLS QYTVRYSEGV HFPARTVANW 22800

LVREVAGDVD NAVNPAWRLG AGVQGFEAYE AANAQGLRLD GGVIEDFAQK NPDLSSTSDT 22860

TDVIRGPDEP YSGQYDEERQ FISVTNPTGA EPVPKFLSEL LEDEYFTKFV NIWLENTDYE 22920

SAANDPHLSK LLEYDIASGT PVYRNNNQGL EALTISPDGK VYAISDQDDT GPWIRDAYQN 22980

DFAARVDPST AVDYNHYSDA ADRSGDVQTL QFAWALQHLS ERTGNQTGQL GTYFNKNINM 23040

LLYGTDDCSG KGMVFSIDAQ GEKNINMLLY GTDDCSGKNP NPDQAFLQVR FWVATGDSSK 23100

AALDALQQSI YLQPKFSDGN GLFYQYERVA VAGYDDTTGG VGPLLAQKAI AIALQSSHRQ 23160

TGSVDGYAYT DANKNDLITY LKSVVENNND GLTAAYRVAP NSGAYLNEAD FRSLPLIVGN 23220

SDQEGKANEQ PTWVYRSDYQ ECADAPGQKF GATGDEYREP SNDPNPPETY SKVALLFSER 23280

LADGSIPTRS ISSDEDSAET EQSDSSDPKV AIIDGLADPW RTMGVGYATN DDSTIRDVPI 23340

MQELNTNTIR DVDPIVIKVE TGVIKPGMVV TFAPANVTTE VKIVVIGHVD SGKDDADLQE 23400

LGAKSSAFAF RKDPSDAIPS IPSIPISYKE AIPFLKEAAE IDSHWERDDY MPFIEVPRDD 23460

YMPFIEVPRA LQGVDELVEK DALHPQFDNF YQEQPKASYG AGVTIQDRDL SVFFTRINDL 23520

LPVYVELLQK AALTNMVNAA KGEITPEQYE KIINEPTAAA IAYGLDKQLT SEEIWQAEEK 23580

LDKPAGDYTI RDYSNNWESG ALKLAPNQMT GSLDATYLKL APNQMTGSLD ATYLKCASDG 23640

SAETCSWEGH CKCASDGSAE TCSWEGHCKC ASDGSAETCS WEGHCKCASD GSAETCSWEG 23700

HCKCASDGSA ETCSWEGHCK LAAISVEPGK ASELGCSSGD LDCLCKVGEC AQMCISNMNA 23760

KGTLLSSNQG SQAADVKNDD DFLNYGISSK APSVITYDEA TKYEAAGITV HKDDYLPFID 23820

MPSEVTQIDA KIPMALDDWP TLSNMIFSGK DNFDTSSVTH RGYQINFLSN SAKDNIQGIT 23880

KPAIRDNIQG ITKPAIGPLG LSPKLQLWDT AGQERAEDYL LNPSPKNFGI GQDIQPKIDA 23940

TTNPGMRQLG LAMLGNKLVI DGLKEVTEIP ATADASRVNV DYTEVPRLAV NMVPFPRYCD 24000

LILGEWRDQI KDVLRIDYIG GGDLFRGSSP NVLYKSANWT PPEGIVRAAS TGSMAEQYTK 24060

AATGTYASST TVYKAENQAV AVGRALVEGS TFAKALYSSA ATGTYASSTT VYKATGTYAS 24120

STTVYKATTV YGESIKAYAD GYVQIVQTYA ASTGSMAEQY TKDLTWSYAA LLTANNRFNV 24180

DETAFTGAWG RGQSAQGASP GVVIASPSKI GADGQSAQGA SPGVVIASPS KIGSLAITDV 24240

SLPFFKIQGI SNPSGALSSG GLGEPKKYTV PSTCGVKPSG ALSSGGLGEP KQAILNNIGA 24300

DGQSAQGASP GVVIASPSKS DPDYFYTWTR SIYAINSGRT GTYASSTTVY KTVGSSCPYC 24360

DSQAPQVRVQ NGAVTWESDP NRVQNGAVTW ESDPNRKPDY FYTWTRYTVP STCGVKSSAA 24420

TGTYASSTTV YKGAVTWESD PNRIVGSISQ LGSWNPSSAT ALSAVQSDVW RDINTVLGSI 24480

HTFDPQNIGA DGQSAQGASP GVVIASPSKA ASTGSMAEQY TKAENQAVAV GRAENQAVAV 24540

GRALVEGSTF AKALVEGSTF AKALYSSAAT GTYASSTTVY KAYADGYVQI VQTYAASTGS 24600

MAEQYTKDLT WSYAALLTAN NRDLTWSYAA LLTANNRIQG ISNPSGALSS GGLGEPKIQG 24660

ISNPSGALSS GGLGEPKNIG ADGQSAQGAS PGVVIASPSK PDYFYTWTRQ AILNNIGADG 24720

QSAQGASPGV VIASPSKQAI LNNIGADGQS AQGASPGVVI ASPSKQAILN NIGADGQSAQ 24780

GASPGVVIAS PSKQAILNNI GADGQSAQGA SPGVVIASPS KQAILNNIGA DGQSAQGASP 24840

GVVIASPSKQ AILNNIGADG QSAQGASPGV VIASPSKQAI LNNIGADGQS AQGASPGVVI 24900

ASPSKQAILN NIGADGQSAQ GASPGVVIAS PSKQAILNNI GADGQSAQGA SPGVVIASPS 24960

KQAILNNIGA DGQSAQGASP GVVIASPSKQ AILNNIGADG QSAQGASPGV VIASPSKQAI 25020

LNNIGADGQS AQGASPGVVI ASPSKQAILN NIGADGQSAQ GASPGVVIAS PSKSAVQSDV 25080

WRSAVQSDVW RSAVQSDVWR SAVQSDVWRS AVQSDVWRSD PDYFYTWTRS DPDYFYTWTR 25140

SDPDYFYTWT RSDPDYFYTW TRSDPDYFYT WTRSDPDYFY TWTRSIYAIN SGRSIYAINS 25200

GRSIYAINSG RTVGSSCPYC DSQAPQVRTV GSSCPYCDSQ APQVRVQNGA VTWESDPNRV 25260

QNGAVTWESD PNRVQNGAVT WESDPNRVQN GAVTWESDPN RVQNGAVTWE SDPNRVQNGA 25320

VTWESDPNRV QNGAVTWESD PNRVQNGAVT WESDPNRVQN GAVTWESDPN RVQNGAVTWE 25380

SDPNRVQNGA VTWESDPNRV QNGAVTWESD PNRVQNGAVT WESDPNRVQN GAVTWESDPN 25440

RKVQNGAVTW ESDPNRKVQN GAVTWESDPN RKVQNGAVTW ESDPNRKASM VWEEAQQVSG 25500

KAVSPSFEDV WSQPRDGAGQ MFIPLNPNAY SPNTLNKDVG GPIEDQNSLQ VGDRFGFDLF 25560

DPTKGPTLLE DFIFRHGGPN FEQLPINQPR HVDGFGIHLF SYLDTQLNRL FYNSLTPAEQ 25620

QFVVDAIRNN VIIQLNRQDL FEAIEAGRSL TPAEQQFVVD AIRSVTSGFV DGIKVGFLAS 25680

VETPASIEAA SELSKTTDVG TFGQKDVHGF ATRIVPEEYV PITKFVTDNG DSKASMVWEE 25740

AQQVSGKASM VWEEAQQVSG KASMVWEEAQ QVSGKASMVW EEAQQVSGKA SMVWEEAQQV 25800

SGKASMVWEE AQQVSGKAVS PSFEDVWSQP RAVSPSFEDV WSQPRAVSPS FEDVWSQPRA 25860

VSPSFEDVWS QPRAVSPSFE DVWSQPRDGA GQMFIPLNPN AYSPNTLNKD GAGQMFIPLN 25920

PNAYSPNTLN KHGGPNFEQL PINQPRHGGP NFEQLPINQP RHGGPNFEQL PINQPRHGGP 25980

NFEQLPINQP RLFSYLDTQL NRNNVIIQLN RNNVIIQLNR NNVIIQLNRS VTSGFVDGIK 26040

SVTSGFVDGI KAAALAELVW SGNRAELVWS GNRASNSLQY VNVQVKDAYS PHEIYSREYL 26100

VANGVQAQAL VPKGIMLDTG RGVQAQALVP KHIVGATAPL WGEQVDDINV SHIVGATAPL 26160

WGEQVDDINV SSMIFEQLEG MSLSKVIPEI DMPSHSSSGW KYNVMANPDA NTPNFNYGGN 26220

GGSWCAPYKT YEVVGNVYKD IEADLQHAET VWGALHAFLV MWEDIALSAD NAHDVPKAAA 26280

LAELVWSGNR AAALAELVWS GNRAAALAEL VWSGNRAAAL AELVWSGNRA SNSLQYVNVQ 26340

VKASNSLQYV NVQVKASNSL QYVNVQVKAS NSLQYVNVQV KDAYSPHEIY SRDAYSPHEI 26400

YSRDAYSPHE IYSRDAYSPH EIYSRDAYSP HEIYSRDAYS PHEIYSRDAY SPHEIYSREY 26460

LVANGVQAQA LVPKEYLVAN GVQAQALVPK EYLVANGVQA QALVPKGIML DTGRIFEQLE 26520

GMSLSKIFEQ LEGMSLSKIF EQLEGMSLSK IFEQLEGMSL SKTYEVVGNV YKYNVMANPD 26580

ANTPNFNYGG NGGSWCAPYK YNVMANPDAN TPNFNYGGNG GSWCAPYKYN VMANPDANTP 26640

NFNYGGNGGS WCAPYKYNVM ANPDANTPNF NYGGNGGSWC APYKATSGGT SAAAPVFAGL 26700

VGMLNDARAW YQESAVSKDF TDITAGSSIG CDGVNPQTGK GFPDVAAHSL TPRPDVAAHS 26760

LTPRPNSALP QVLSNSYGDE EQTVPEYYAK SALPQVLSNS YGDEEQTVPE YYAKSNSYGD 26820

EEQTVPEYYA KSYGDEEQTV PEYYAKYLDQ QITAETKAWY QESAVSKAWY QESAVSKAWY 26880

QESAVSKAWY QESAVSKGFP DVAAHSLTPR GFPDVAAHSL TPRGFPDVAA HSLTPRGFPD 26940

VAAHSLTPRG FPDVAAHSLT PRPDVAAHSL TPRSALPQVL SNSYGDEEQT VPEYYAKYLD 27000

QQITAETKYL DQQITAETKA NEQPTWVYRF FCPTDYLIDV RGTPSVLTEQ GLVKLGVPGN 27060

ELAIEIGSTG DYNARQGTPS VLTEQGLVKS LPLIVGNSDQ EGKTFQGTPS VLTEQGLVKY 27120

PVVQNPVTLA ESSCQSVFNP NIPKNPSAGP GWDQAKPTNG PLAKFQGTPS VLTEQGLVKA 27180

NEQPTWVYRA NEQPTWVYRG TPSVLTEQGL VKNPSAGPGW DQAKPTNGPL AKSLPLIVGN 27240

SDQEGKSLPL IVGNSDQEGK SLPLIVGNSD QEGKARNHGT STVAPQVQAS VYRASVDISN 27300

VDTYSSTEVA NDDSFQQVGK ATFLVWDQQR KASVDISNVD TYSSTEVAND DSFQQVGKNH 27360

GTSTVAPQVQ ASVYRSSTEV ANDDSFQQVG KTLYLTDTDA GVPMIDPRTV YAFDVSEDGS 27420

YLKVASNGYV ITGAGKARNH GTSTVAPQVQ ASVYRARNHG TSTVAPQVQA SVYRATFLVW 27480

DQQRATFLVW DQQRATFLVW DQQRKASVDI SNVDTYSSTE VANDDSFQQV GKTVYAFDVS 27540

EDGSYLKVAS NGYVITGAGK VASNGYVITG AGKIENQSDA DGYSSCSTLK LTGLTTLTTL 27600

SFAALTKSAS SLNSIGDTFK SDKLNVIDFP KSLNSIGDTF KVGSIEFTAL PQLQSLDFTK 27660

TVNGGFQIAR LNVIDFPKGQ LGFWGNKGTY SGDLQLNGVK LNVIDFPKSD KLNVIDFPKS 27720

DKLNVIDFPK TVNGGFQIAR TVNGGFQIAR AVGSDEWTVR LGITYTTYSK MTNDYISALT 27780

KSEMLAEQDK MTNDYISALT KSTITTPWKS VVENNNDGLT AAYRVAPNSG AYLNEADFRY 27840

FYGDNYATLR SGAYLNEADF RTAVGSDEWT VRLGITYTTY SKMTNDYISA LTKMTNDYIS 27900

ALTKMTNDYI SALTKSEMLA EQDKMTNDYI SALTKSEMLA EQDKMTNDYI SALTKSEMLA 27960

EQDKMTNDYI SALTKSVVEN NNDGLTAAYR SVVENNNDGL TAAYRSVVEN NNDGLTAAYR 28020

SVVENNNDGL TAAYRETTMF VLQGFGASMA RLNALQGGRL VQNDFNTLLR QDILGGMVDS 28080

YTDPKTGETT QIHARYGLEA AVPLMYESTG LGLGDMTKVS VADVKIDYIG GGDLFRLVQN 28140

DFNTLLRQDI LGGMVDSYTD PKYGLEAAVP LMYESTGLGL GDMTKALEAY KVNGKAVDFS 28200

GHDEFQGKEP SNDPNPPETY SKFGATGDEY RSDYQECADA PGQKYIARPD IMKSTLPDLS 28260

EVIKVNGKEV GQFKSVDNFH LLTVYAVDFS GHDEFQGKFG ATGDEYRYIA RPDIMKFLDE 28320

ALTYPPPKGI QINDPSINDD SVMIYAPAVR IASAMLDEED EKYFNVKNGD QSPPSALGPL 28380

PSVIERPSIN DDSVMIYAPA VRTDYSVCGE TTIFKTVDDE EGVAAQFKIA SAMLDEEDEK 28440

FLDEALTYPP PKFLDEALTY PPPKGIQIND PSINDDSVMI YAPAVRGIQI NDPSINDDSV 28500

MIYAPAVRIA SAMLDEEDEK IASAMLDEED EKYFNVKIAS AMLDEEDEKY FNVKNGDQSP 28560

PSALGPLPSV IERNGDQSPP SALGPLPSVI ERAGAVAAVV YNNEKHGIPG GGIATGAEGI 28620

KLVLGDAVPE SAAPMGLTPP TKSDKELVSS SAFQSHVKSF EGFPKRLVAH SVATYARIAD 28680

LGKEEYNHPT RAGAVAAVVY NNEKHGIPGG GIATGAEGIK HGIPGGGIAT GAEGIKLVLG 28740

DAVPESAAPM GLTPPTKLVL GDAVPESAAP MGLTPPTKLV LGDAVPESAA PMGLTPPTKS 28800

DKELVSSSAF QSHVKFTDTP VLYGPKKFTD TPVLYGPKML DDAGIYLITD LSSPSESINR 28860

QQLSFVMNQW YEKYGAYSVC SPKSDGQCSD LLKWDVDLYS RLITDLSSPS ESINRDLSSP 28920

SESINRKFTD TPVLYGPKKF TDTPVLYGPK QQLSFVMNQW YEKQQLSFVM NQWYEKCDVA 28980

TTDVYYSGKG GTPDFGPGRS KYTAEGYEAA TKVATIGSAT FARYCASAQE DNATLQALLR 29040

YTAEGYEAAT KYVDAGGFEP SIKSKYTAEG YEAATKVATI GSATFARVAT IGSATFARYV 29100

DAGGFEPSIK DADACNGGGI EYDSPADTPL EFKDNTCNAP IPVSFPVAPT DTKEISFNQA 29160

WLRFAANGNY GSETTAAVIN NFNGRITTAD MDGISSWLPT INGKVIANGN VAGNILVIAK 29220

SDVSDFKEAG LKDADACNGG GIEYDSPADT PLEFKDADAC NGGGIEYDSP ADTPLEFKDA 29280

DACNGGGIEY DSPADTPLEF KFAANGNYGS ETTAAVINNF NGRANNYCSN QVEGPYSLYS 29340

GRVSIWTESY GGRYGPSFTA FFQEQNEKTV YDMAMEAWSK ISYKEPGICE TTPGVKSAGY 29400

APLKPGGCKD QIIECRANNY CSNQVEGPYS LYSGRANNYC SNQVEGPYSL YSGRANNYCS 29460

NQVEGPYSLY SGRISYKEPG ICETTPGVKV SIWTESYGGR AIMGAEEAAK TGGAMWPYRT 29520

LIPDVVGIFA GTPKFVTNMQ AALLKALSEM ILQSEKDYYA SMLQQPKANF EVETPRGITG 29580

TSIARANFEV ETPRDYYASM LQQPKFVTNM QAALLKFVTN MQAALLKTGG AMWPYRTGGA 29640

MWPYRAEDYL LNPSPKLSDL TGDTEYAQLS QKTDDQVSLF ETTIRTDSGF AGLTNVNAAN 29700

GGGRYDNQES FLFAEVLKIT GQEIYRAEDY LLNPSPKTDD QVSLFETTIR AGFAGDDAPR 29760

QEYDESGPSI VHRSYELPDG QVITIGNERV APEEHPVLLT EAPINPKDLT DYLMKIIAPP 29820

ERSYELPDGQ VITIGNERVA PEEHPVLLTE APINPKALLF GAAGSAEDPV VVKNVGFPVV 29880

TVAEDAASSS IKVYATPDQD IEHGRAVEQS LDAIRQGLLT VEDRGPLNEG GLYAERLSGQ 29940

DASAITWKLT GNLGGEDYQD KASPSYLTAT PRALMNGAGA IKDAGYETSI TDYWGRPTVY 30000

GFVPLEYVGS KTAFSDILAK TNTQVPDACT QCFQKMPMPL LVADGRTAFS DILAKAFPDV 30060

AAQGMNFAVY DKELYNIGDY QADANSGSKI AFASYLEEYA RLETIGDTFK QGLQDITLGA 30120

SIGCTGRAFP DVAAQGMNFA VYDKELYNIG DYQADANSGS KQGLQDITLG ASIGCTGRLV 30180

EGAAAGIVVA SPSKQGVLNN IGADGKSSSA YESLTSAVKA SALIAYGNSL ISSDKSVYGI 30240

NNGRPDYFYT WTRPDYFYTW TRSNPDYFYT WTRSNPDYFY TWTRSNPDYF YTWTRSNPDY 30300

FYTWTRSNPD YFYTWTRSNP DYFYTWTRFS VAEILPGAKN VVLDTTALSA NTKVGTIITG 30360

DPLDPPVLKY PAEVFLPGGT YQLGKADKET DIGSAIEKAS AIQLDGIIYR QLSGHVGPLT 30420

SSSSKETDIG SAIEKADKET DIGSAIEKQL SGHVGPLTSS SSKQLSGHVG PLTSSSSKIY 30480

SFFVGGAVPE NLRQTSSEQN PSLEEIQAAQ ATVLPHSPVS NVKSAGEYNT FSPEWPVPLT 30540

KTFDENDTYE IGNKSIDQFF NDAKVPTVLM SPWVGKDGQE ATFHFDRVDW SPSFRAAEVI 30600

NYYTPDHVPV FNAMSIDQFF NDAKNAFITN YPSEQRYDTA TFIDKRIDAT TNPGMRQLGL 30660

AMLGNKNMHD VIGNDGTVPS EFRIDATTNP GMRIDATTNP GMRNAFITNY PSEQRNAFIT 30720

NYPSEQRQLG LAMLGNKAQI TAVNLEARGD GGGGPTFEHL EKSMDNDNTS LLVFGKMGES 30780

VDDFFARAQI TAVNLEARMG ESVDDFFARG IVSGEGEESS DPVKVDNVVA SFKYMQQLLD 30840

QTKVVWQDSV RAQNDPNAFG VVAARDPNAF GVVAARNDPN AFGVVAARAA TYCPENIEKA 30900

QNDPNAFGVV AARAQNDPNA FGVVAARTIF GWDIAEGQKS AGYTPLKVNG VEYGETRSAG 30960

YTPLKVNGVE YGETRSAGYT PLKVNGVEYG ETRGGSILPM QEVALTTRWA SVIDATKKAT 31020

GDVLFNTKHT ADGAWAKGGS ILPMQEVALT TRGGSILPMQ EVALTTRWAS VIDATKDGLE 31080

GSFKWDNLDS AALNTKVEDG NLILTMPKVE DGNLILTMPK VEDGNLILTM PKWDNLDSAA 31140

LNTKWDNLDS AALNTKSAIS QYGDSFAKSQ SDFESEFSTA KVNAGIGIGP DDLVSFIKSA 31200

ISQYGDSFAK SQSDFESEFS TAKGFNIVVA PGLDGRHVDV PLTGEDEITI LAIHDEVSPV 31260

GDTDALLERA PVVQYALNRY LVDQLNPEGK AIHDEVSPVG DTDALLERAI HDEVSPVGDT 31320

DALLERAPVV QYALNRAPVV QYALNRDAEL TDAGVKQAQV AHDFWQKLNT GAVIPVLVRL 31380

GDLSANPIER VLPQVIEATN RIYVTGQSYA GRLGDLSANP IERVLPQVIE ATNRVLPQVI 31440

EATNRNDPVA VFDGSVIPKE AGLVPFQVSP TTKTLGIDIA RGQTPLPILV ADGRTSTTLP 31500

EVCSKNNILE GPDVKGQTPL PILVADGRIN TAAYWKEAIA DVLEHLGEND EDIAVYAPNP 31560

FYKNSILEGP DVKMPMPILV ADGRMPMPIL VADGRNDDDF LNYGISSKSP VTSEYTSVRS 31620

IFEAANEKAI NDYIDSQLDK YLTNSQALAD LPYFAEKGVQ ISTNIPKGVQ ISTNIPKEII 31680

STYSIDGLRS VYQTMTDRYN TDAELYKGGS ELGFRSAADG LASAITSKSG DDISTTDALA 31740

LPEPVQALTK AGSSPTDIIS GISDKTDALD SAIKYDYENV DSDGANKYNL SNGAPAPETV 31800

TNKSMPTSGA VDLVAKCSSH DDCSDELACT DGVCACTADS AVTCSWEGHC AGAKGDNPSI 31860

LGLRCTADSA VTCSWEGHCA GAKDSPNWDV DSDALPAIPE GAKTLADFDA LKTLADFDAL 31920

KINPGPLARL YPDDNLAFIQ AGISDEKLYT GEVFKTDEGK GQEPPAAIVE VQKVAIIDGL 31980

ADPWRSVNIV NYTPSDSYTY SDNSGSWQSV KVTTGGQGAE FTLAKDQTTW SVDGNVVRVT 32040

TGGQGAEFTL AKVTTGGQGA EFTLAKAGQF PISANDGATS TKEAASAALA AGYKQTYTSC 32100

NPLKKTLNYA DALDGENYPQ TPSRVAVAGY DDTTGGVGPL LAQKINPSSG LLEPQTPLAV 32160

SPGSGPRVAV AGYDDTTGGV GPLLAQKTTG AFDESGPPLS QKNALQTMYD TQDKAALDAL 32220

QQSIYLQPKF SDGNGLFYQY ERLGAEVVTA GRIYAVADTQ ERLINQVELS EDKAVITDIV 32280

NQQRAVITDI VNQQRGENIL SAPLITYAPA GPELDEKELG FTAVGGEGKD IQYLENYQGQ 32340

GYSGPAVKIL QYAQGRDYSN NWESGALKDD YMPFIEVPRE AAEIDSHWER TIPIDNDVDY 32400

VVTGYRVYWV DSGPRTGDGV NDAPSLKDGQ EQEILARADA IVAAIRSALI AFEKNINMLL 32460

YGTDDCSGKG MVFSIDAQGE KTGTDQASVG YYKDAVYALD AIYGIDARDN ILPENLDDGL 32520

PSQFVYEKIL VENLQDQTAK ILVENLQDQT AKAEPYVTGS SAASGSNFVA DFAEAGTDGK 32580

QISYWAFTTP AVKFEPPAVY NDELKDAEEE PYDWSNEGRL SDELEDDNAP IGFETTKDQE 32640

MAVAAFRTSD DFASQMDGRC MGCDSTSIDV SRCMGCDSTS IDVSRDASGG DQITEWQDIY 32700

LPPITKGIQD AGVIATAKGV GSDAWTVSES GRGIDGDKGL VVKDLYGNIV MSGGSTLYPG 32760

IADRAGFAGD DAPRQEYDES GPSIVHRSYE LPDGQVITIG NERSYELPDG QVITIGNERL 32820

SGGVAVIKTT AVLFDEGKIG GSAGTELQSD KDLALVDPGL ELSYNTKLVG GSDFGEDEAK 32880

TLSTNEEGYE TSAVRASYGA GVTIQDRSAY VVYDLSNNEI SLANTKVPYL IGANTDEGTS 32940

FAIRLPVEAF QALASSTSET KDAGNAATND PLFPFSRAAL PGTEVLFADS VAKVTSAQYY 33000

VNPKIQAFVI YPENFDKVGA GVNVGELYAF ADKALTQYSV KTTYNVVAQT KTYANLPQAL 33060

VNSGAIKVIP LQGCDADEYG RDNIQGITKP AIRLANAYTW EGGRYQGASQ CPFRTMGVGY 33120

ATNDDSTIRC ASDGSAETCS WEGHCKCASD GSAETCSWEG HCKLILPGEL AK 33172

Claims (6)

1.一步式高效筛选黄曲霉毒素防控菌的方法，其特征在于：测定黄曲霉毒素生防菌试验处理组和对照组指示分子AFT-YJFZ01含量，计算生防菌对指示分子AFT-YJFZ01抑制率，根据抑制率结果，高效筛选黄曲霉毒素防控菌，所述的指示分子AFT-YJFZ01氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述的黄曲霉毒素生防菌试验处理组和对照组通过如下步骤实现：花生仁粉末、黄曲霉产毒菌孢子、系列候选防控菌混合在培养基中培养一定时间，获得试验处理组，其中用培养基代替候选防控菌培养一定时间则获得对照组，

所述的指示分子AFT-YJFZ01含量通过如下步骤实现：

a处理组与对照组培养一定时间后，对培养物充分匀浆，制备成待测溶液，加入到孔底包被有指示分子AFT-YJFZ01的纳米抗体或单克隆抗体的酶标板孔中，反应，洗板；

b加入指示分子AFT-YJFZ01多克隆抗体反应，洗板；

c加入与指示分子AFT-YJFZ01多克隆抗体发生结合反应的辣根过氧化物酶标记抗体，反应，洗板；

d加入显色液反应；加入终止液，酶标仪读取并计算待测溶液中AFT-YJFZ01的含量；

用系列浓度的起标准物质作用的指示分子AFT-YJFZ01纯品溶液，替换待测溶液，用于制作标准曲线，再根据酶标仪读数计算指示分子AFT-YJFZ01含量，

所述的生防菌对指示分子AFT-YJFZ01抑制率，通过如下方式计算：抑制率＝(对照组AFT-YJFZ01含量-试验处理组AFT-YJFZ01含量)/对照组AFT-YJFZ01含量×100％。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的花生品种选自中花6号、鲁花8。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的培养基是液态的沙氏培养基。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的孔底包被有指示分子AFT-YJFZ01的纳米抗体或单克隆抗体的酶标板，其制备方法为：将AFT-YJFZ01的纳米抗体或单克隆抗体溶解在ELISA包被缓冲液中，形成0.2-8.0μg/mL的包被液，再加入至酶标板中，4℃放置过夜或者37℃放置不少于2h后，去除上述酶标板中包被液，再用ELISA常规洗液洗涤酶标板；然后加ELISA常规封闭液，放置室温或37℃封闭不少于1h后，再弃去封闭液，再用ELISA常规洗液洗涤酶标板。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的显色液是指ELISA常规的双氧水与TMB显色液。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的终止液是指ELISA常规的显色终止液2mol/L硫酸水溶液。