KR100319402B1

KR100319402B1 - 살모넬라측정방법

Info

Publication number: KR100319402B1
Application number: KR1019950705341A
Authority: KR
Inventors: 마틴글렌스비에르그; 플레밍한센
Original assignee: 라데가아드 토르벤; 포스 일렉트릭 에이/에스
Priority date: 1993-06-02
Filing date: 1994-05-31
Publication date: 2002-06-22
Also published as: DK63093D0; EP0701624B1; NO318763B1; NO954899L; FI955710A; NO954899D0; ATE157402T1; JP3418399B2; FI955710A0; AU6924694A; KR960702527A; DE69405232T2; EP0701624A1; DE69405232D1; FI111015B; JPH09500522A; WO1994028163A1

Abstract

본 발명은 가공된 식품 및 날 식품 및 사료, 주변환경, 체액 및 부검체 등을 원료로 하는 샘플 중살모넬라를 신속히 측정/검출하는 방법을 제공한다. 이 방법은 농축 단계와 측정 단계로 이루어진다. 농축단계는 선택적 조건을 이용하는데, 특히 선택 물질인 테트라티오네이트 및/또는 노보바이오신을 사용하고 배양 온도를 39 - 43℃로 상승시켜,살모넬라를 조기에 검출할 수 있다. 선택적 조건은 농축 단계에서 가능한 한 빨리 마련됨으로써, 높은 특이성과 높은 감도로 측정을 조기에 수행할 수 있게 한다. 측정 단계는 전통적인 한천 평판 기술과는 전혀 다른 여러가지 분석법으로 된다. 또한 가공된 제품, 즉, 열-처리되거나, 건조되거나, 경화 또는 산성화, 및 그밖의 다른 처리된 제품에 대한살모넬라의 특수한 농축 공정도 제공된다. 일반적으로살모넬라의 측정/검출은 농축 수립시로부터 24시간 이내에 수행될 수 있다.

Description

살모넬라 측정 방법

본 발명은 날식품(raw food) 또는 가공된 식품이나 사료 제품과 같은 샘플로부터살모넬라를 농축(enrichment) 및 검출하는 방법에 관한 것이다.

살모넬라(Salmonella) 속에 속하는 세균종(이하 "살모넬라"라 칭함)에 의한 날 식품 및 가공된 식품의 오염은 식품 및 사료 산업에 있어 중요한 문제점이 되고 있다.살모넬라는 도처에 존재하기 때문에, 오염원은 그 전염 경로도 복잡하고 수도 많다.

모든살모넬라는 사람, 동물, 또는 사람과 동물 모두에 있어서 잠재적인 병원균이다. 인간에 있어서, 대부분의 혈청형은 숙주-특이성을 거의 나타내지 않으며 섭취후살모넬라중독, 위장질환을 일으킬 수 있다.

비록 보통은 며칠 내에 회복될 수 있을 정도로 약하고 자가-제한적이지만,살모넬라감염은 장기로부터 체내의 다른 조직으로 감염이 전이되기 때문에, 유아, 노인 및 병을 앓고 있는 사람에 있어서는 심각한 합병증을 일으킬 수 있어, 위중한 질병으로 이어지거나 심지어는 사망에 이르게 될 수도 있다.

흔히 발생하는 또 다른 문제점은 지연형(타잎 TV, 세포매개형) 과민성뿐 아니라 즉시형(타잎 1) 과민반응을 일으킬 수 있는, 세균 내독소에 대한 면역응답이다.

산업상 식품 오염을 제어하기 위해서는, 가공된 식품과 사료에서 뿐 아니라 날 식품과 사료에서도살모넬라를 검출할 수 있는 신속하고도 신뢰성있는 수단이 강력히 요구되고 있다.살모넬라를 검출하기 위한 이러한 통상적인 분석법은 대체로 예컨대 완충된 펩톤수에서 비선택적인 농축(enrichment) 단계에 이어,살모넬라의 성장을 촉진하는 브로쓰에서 선택적으로살모넬라를 농축시키고 다른 세균들의 성장을 억제하며 이어서살모넬라선택성 및/또는 표지성 한천-배지에 이를 플레이팅시키는 단계로 이루어진다. 이러한 공정은 번거로울 뿐 아니라 추정 근거가 되는 결론을 얻는데 대략 3 - 5일이 소요되어 시간도 많이 걸린다.

식품 중의살모넬라를 신속하게 검출하기 위한 여러가지 방법이 지난 수년간 제안되어 왔다. 이러한 것의 예로는 효소 면역분석법(EIA) (Beumer 외, 1991; Notermans 및 Wemars, 1991; Emswiler-Rose 외, 1991; D'Aoust 및 Sewell, 1988b),면역확산법(D'Aoust 및 Sewell, 1988a; Bailey 외, 1991), 라텍스 응집분석법(D'Aoust 외, 1987), 소수성 그리드막 여과 분석법(Entis, 1986), 선택적 이동성 농축기술(Holbrook 외, 1986), 및 콘덕턴스 기술(Smith 외, 1989)을 들 수 있다. 이러한 신기술들이 종래의 공정보다 신속한(42 - 48시간) 결과를 제공함에도 불구하고, 이 방법들은 식품 산업에서 거의 허용되고 있지 못하는 실정이다. 따라서, 식품 및 사료산업 분야에 있어서살모넬라의 검출을 보다 신속하고 간편하게 행할 수 있는 방법에 대한 수요가 여전히 만족되고 있지 못하다.

따라서,살모넬라를 신속하게 검출할 수 있는 확실한 방법이 요망되고 있다. 이러한 방법은 민감하고, 특이적이며, 신뢰성이 있어야 한다. 예컨대, 샘플 25 g당살모넬라1마리만큼 적은 수의살모넬라를 24시간 내에 검출할 수 있으며, 스탠다드 배양 프로토콜에 비교할 때 거짓 양성 백분율이 10% 미만이고 참 양성 백분율은 80% 이상인 방법이 바람직하다.

본 발명자들은 놀랍게도 완충된살모넬라의 선택 배지 중 날 식품 샘플을 37-43℃에서 19시간이라는 짧은 기간동안 일차 농축(primary enrichment)시키는 것이 최초 샘플 중에 존재하는살모넬라농축 샘플에 수행되는 ELISA를 고도로 특이적이면서, 적어도 날 식품 샘플 중의살모넬라를 검색하는 스탠다드 배양법만큼 높은 감도를 지니게 한다는 것을 발견하였다.

또한 가공된 식품 샘플의 일차 농축(심지어 비-선택적인 배지 중에서도)에 이어, 일정 기간 후에, 약37℃에서 40-43℃로 온도를 상승시키는 것이 19시간 후 농축 샘플에 대해 수행되는 ELISA를 고도로 특이적으로 만들고 적어도 가공된 제품 샘플 중살모넬라를 검출하는 스탠다드 배양법만큼 민감하게 하는데 효과적이라는 것도 밝혀졌다.

농축에 이어 수행되는 검출에 앞서서, 선택적인 후-농축을 수행함으로써 후속적인 분석에서 비-특이적으로 간섭을 일으킬 수도 있는 식품-성분들을 희석시킬 수 있을 것이다.살모넬라가 희석되는 것을 보상하기 위해, 후-농축은 대체로 약 2 내지 6시간 동안 약 40℃ 내지 43℃의 온도 범위에서 수행된다. 더욱 구체적으로는, 후-농축의 기간은 약 2.0-4.5 시간, 바람직하게는 2.5-3.5 시간, 가장 바람직하게는 약 3시간인 것이 좋다. 이러한 선택적 후-농축을 수행할 것인지의 여부는 주로 측정 단계에 사용된 분석법의 특성에 의존한다: 만일 그 분석법이 분석 샘플중 여느 경우라면 간섭 또는 교차반응성이었을 물질에 대해 실질적으로 민감하지 않은 경우라면, 이러한 후-농축을 수행할 필요가 없다.

본 발명은 상술한 발견 및 기타 발견에 기초한 것으로살모넬라가 선택적 농축에 대한 준비가 되는대로 이를 선택적으로 농축시키는 전략을 이용하는 것이다. 이러한 전략 이면의 핵심 사상은 경쟁적인 미생물총을 저해시킴으로써, 측정시 검출될 경쟁적인 미생물총의 능력과 관련하여, 미생물총에 의한살모넬라의 과성장을 저해하는 데 있다. 본 발명에 따른 전략에 의한살모넬라의 과성장 저해 역시 어느 정도살모넬라에 대한 선택적 압력을 가하는 것이라 해도, 본 발명에 따라 이용되는 균형잡힌 선택성은 후술되는 설명으로부터 명료해지는 바와 같이 샘플 중 어떠한살모넬라도 선택적으로 검출해낼 수 있다는 커다란 장점을 제공한다.

달리 설명하면, 본 발명은 통상적인 접근 방식인 측정공정을 전통적인 농축공정에 적응시키는 것이 아니라, 농축공정을 측정공정에 적응시킨다는 개념에 기초한다. 특히, 본 발명의 특성은 다음과 같은 발견에 기초한다:

선택 물질 테트라티오네이트(tetrathionate)와 상승된 인큐베이션 온도를 조합함으로써,살모넬라검출과 관련한 특별히 높은 민감성과 특이성을 특히, 날 제품에서 얻을 수 있으며,

항생제인 노보바이오신(novobiocin)과 상승된 인큐베이션 온도를 조합함으로써, 상응하는 우수한 결과를 특히, 가공된 제품에서 얻을 수 있다.

요약하면, 본 발명은 24시간 이내에살모넬라를 고도로 민감하고 특이적으로 검출해 낼 수 있는 새로운 방법을 제공한다.

본문에서 사용되는 몇가지 용어의 정의를 다음에 설명한다:

한가지 측면에서, 본 발명은 샘플, 특히 날 샘플 중의살모넬라속에 속하는 박테리아를 검출하는 방법에 관한 것으로, 이 방법은 다음에 설명되는 세가지 농축 공정 1) - 3)중 어느 한가지의 농축 공정과 증균 후 농축 배지 중에 존재하는살모넬라를 동정 및/또는 정량화하는 측정 공정으로 이루어지며, 이 측정 공정은 본문에 정의된 전통적인 한천평판 기술과는 다른, 표적 분자의 동정 및/또는 정량화 또는 표적 분자가 관련된 분자 상호작용에 기초한 분석 단계로 이루어진다. 표적 분자 또는 표적 분자가 관련된 분자 상호작용의 동정 및/또는 정량화에 기초한 분석 단계의 예로는: 예컨대 방사능 면역분석(RIA: Radio Immune Assay), 효소 면역 분석(EIA: Enzyme Immune Assay), 효소결합면역흡수 분석(ELISA: Enzyme Linked Immune Sorbent Assay), 형광 항체기술(FA: Fluorescence Antibody technique), 측정 상에서 리포좀, 미셀 또는 리포좀-유사 입자를 이용하는 것으로 되는 면역분석, 면역 고정화와 관련된 분석, 라텍스 응집과 같은 면역 응집과 관련된 분석; 측정 단계가 DNA/DNA-하이브리다이제이션 분석, RNA/RNA-하이브리다이제이션 분석 또는 DNA/RNA-하이브리다이제이션 분석으로 된 분석법; 측정 단계가 폴리머레이즈 연쇄반응(PCR: Polymerase chain reaction) 또는 이와 유사한 생체외 핵산 증식단계로 이루어지는 분석법; 및 측정 단계가 펩티드 핵산을 사용하는 것으로 이루어지는 분석법(PNA; cf. Nielsen P E 외, 1991)과 같이 면역학적 반응이 관여된 분석법을 들 수 있다.

본 발명에 따라 분석 단계의 시간을 제한하는 것이 바람직하다. 일반적으로분석기간은 길어야 7시간, 그러나 그보다 짧은 시간, 예컨대 6, 5, 4, 3, 2, 및 1 시간인 것이 바람직하다.

본 발명 방법의 일부를 구성할 수 있는 기타 흥미로운 측정 단계 유형을 다음에 설명한다:

렉틴 또는 수용체 결합이 관련된 유사한 분석을 이용하는 측정단계;

박테리오파지를 이용하는 측정 단계 (여기서 박테리오파지 Felix 01이 특히 흥미로운 가능성을 제시함);

살모넬라를 함유하는 매질의 전기 저항 또는 임피던스의 변화를 야기시키는 물질의살모넬라에 의한 대사적 전환으로 이루어지는 측정단계로서 여기서살모넬라의 검출은 이 변화를 측정함으로써 수행됨;

한천 매트릭스를 통과하거나 또는 그 위를 이동할 수 있는살모넬라와 능력에 대한 분석으로 이루어지는 측정 단계;

배지로부터 박테리아를 분리하여 필터 상에 유지시키는, 여과 단계를 포함하는 분석으로 이루어지는 측정 단계(여기서, 소수성 그리드 막 필터법(HGMF: hydrophobic grid membrane filter)를 이용하는 분석이 특히 흥미롭다).

방사능측정법을 이용하는 분석으로 된 측정 단계; 및

크로마토그래피 분리에 의한 분석으로 이루어진 측정 단계.

이러한 분석의 특별한 구체예는 본문 명세서 2면에 수록된 참고문헌에 대체로 자세히 기재되어 있다.

이러한 분석의 대다수는 기술 분야에 잘 알려진 것들이다. 실시예 부분에,ELISA 분석법을 이용하는 것이 설명되어 있지만, 이러한 선택은 본 발명을 수행하는 데 있어 그다지 중요한 것이 아님을 이해하여야 할 것이다. 예컨대, 핵산 간의 하이브리다이제이션이 관여된 분석 역시 매우 흥미로운 방법인데, 이러한 분석은 고도의 종 특이성뿐 아니라 균주 특이성에 따라 조정될 수 있기 때문이다. 또한, 이러한 분석은 다른 박테리아나 물질에 의한 간섭에 덜 민감할 수 있기 때문에, 선택적 후-농축에 대한 필요가 적고 따라서 본 발명의 방법을 단순화시킬 수 있다.

상술한 분석법들은 본 발명의 방법에 있어서살모넬라의 측정이 일어나는 "측정 단계"의 일부를 구성함을 이해하여야 한다.

본문에서 "측정"이라 함은 샘플 중살모넬라의 존재를 정량적 또는 정성적으로 평가하는 것을 의미한다. 종종, 정성적 평가가 본 발명에 따른 방법의 목적이 되는데, 이는 때로살모넬라의 존부 여부만을 가리는 일이 중요한 일이될 수 있기 때문이다. 그러나, 어떤 한정적인 오염이 관용되거나 또는 정량적인 평가 자체가 목적인 경우(예컨대 동물이나 인간으로부터의 샘플 중에서살모넬라의 농도를 평가하는 경우)에는 그 측정이 정량적일 수 있다. 후자의 경우에는 대체로 기지량의살모넬라를 함유하는 외부 스탠다드와 비교하는 것이 필요한데, 이 스탠다드는 샘플과 동일한 방식으로 처리된다.

사용된 분석법은살모넬라의 존재 여부를 가리기 위한 여하한 간편한 분석일 수 있다. 그러나, 분석은 예컨대 ISO 6579에 설명된 플레이팅 기술과 같은살모넬라검출을 위한 많은 스탠다드 프로토콜에서 사용되는 바와 같은 "전통적인 한천 평판 기술"은 아니다.

분석은, 본래의 샘플에 함유된 물질과 분석 요소사이의 비-특이적인 상호작용에 의해 간섭받을 수 있다. 이러한 간섭은 거짓 음성 결과 뿐 아니라 거짓 양성 결과를 초래할 수 있다. 이러한 간섭물질에 의해 야기되는 문제점들은 일차 농축 배지 중의 비-미생물성 물질의 초기 농축도가 높고 일차 농축 내내 그렇게 유지될 것인 반면, 미생물(살모넬라와 다른 것들)의 초기 밀도는 보통 다소 낮은 사실에 기인한다. 따라서, 본 발명에 따른 농축 공정은 기존의 물질의 고유한 간섭에는 영향을 미치지 않는 반면, 본 발명에 따른 농축 공정은 교차-반응성 미생물에 의한 간섭은 제거시키거나 크게 감소시킬 것이다.

본문에서 "교차-반응성"이라 함은, 거짓-양성 결과 또는 신호를 이끌어내는 비-살모넬라박테리아에 기인하는 비-살모넬라박테리아 또는 분자들의 독특한 능력을 칭하는 것으로 한다. 따라서, "교차-반응성 미생물"은 교차-반응성을 나타내거나 또는 "교차-반응한다". 교차-반응성은 교차-반응하는 물질/미생물과 분석대상인살모넬라의 사이에 공통적인 특성이 존재하는 결과라 이해될 수 있다. 따라서 교차-반응성은 분석시 물질과 성분들 간의 비-특이적 상호작용과 같은 비-특이적인 현상과는 구별되어야 한다.

분석과는 별도로, 따라서, 측정 단계는 "후-농축"을 포함할 수 있는데, 이 용어는 분석시 여느 때 같으면 간섭을 일으킬 일차 농축 배지 중 물질을 희석시키기 위해 일차 농축물로부터 물질을 선택적인 농축 배지의 용적으로 이동시킴으로써 수행되는 선택적 농축을 의미하는 것이다. 상술한 바와 같이, 후-농축에 대한 필요성은 사용된 분석 유형에 크게 의존하며 상술한 비-특이적 상호작용에 처하는 분석을 사용할 경우 주로 후-농축이 가치 있는 것으로 입증될 것이다.

본문에서 "시그날"이라 함은살모넬라의 선택된 특징의 존재 여부를 테스트하는 분석의 측정가능한 결과를 칭하는것으로 한다. 상기 특징은 DNA-단편, RNA-단편, 항원 결정기, 효소, 수용체 및 기타 거대분자와 같이,살모넬라의 존재여부에 대한 테스트를 받는 샘플 중 다른 미생물과살모넬라를 구별시키는 모든 생물학적 또는 화학적 특성일 수 있다.

본문에서 "컷-오프 값(cut-off value)"이란, 분석으로부터 양성 시그날로서 간주되는 최소한의 시그날을 가리키는 것으로 한다. ELISA-2 기술을 이용하여 수행되는 실험에서, 이 컷-오프값은 WASH로 구성된 실질적으로살모넬라가 없는 샘플을 분석할 때 얻어지는 시그날의 두배로 정의되는 한편, ELISA-1 기술을 이용하는 실험에서의 컷-오프값은살모넬라의 잘 정의된 표준 샘플의 백분율로서 정의된다(상세한 내용은 실시예 란 참조).

따라서, 본문에서 "양성 시그날", 즉, 샘플이살모넬라를 함유한다는 최종 또는 추정적인 결론은, 선택된 컷-오프 값 이상의 시그날을 가리키며, "음성 시그날", 즉 샘플이살모넬라를 함유하지 않는다는 최종 또는 추정적인 결론은, 컷-오프 값 미만의 시그날을 가리키는 것이다.

본문에서 "참-양성" 시그날 또는 결과는 양성 시그날을 결과시키는 일차 농축 배지로부터 배양할 때 확인될 수 있는 양성 시그날 또는 결과로서 정의된다. 배양은 본문의 실시예 5에 설명된 바와 같이 수행될 수 있다.

본문에서 "거짓-양성" 시그날 또는 결과는 측정시 양성 시그날을 결과시키는일차 농축 배지로부터 배양될 때 확인될 수 없는 양성 시그날 또는 결과로서 정의된다. 배양은 예컨대 실시예 5에 설명된 바와 같이 수행될 수 있다. 이에 상응하게, 본문에서 "거짓음성" 시그날 또는 결과라 함은 측정시 음성 시그날을 결과시키는 일차 농축 배지로부터 배양시 확인될수 없는 음성 시그날 또는 결과로서 정의된다.

본문에서 "샘플"이라는 용어는살모넬라가 수확될 수 있을 것으로 여겨지는 가능한 모든살모넬라소스로부터 취해진 여하한 표본도 모두 포함되는 것으로 한다. 따라서, 본 발명의 방법으로 처리될 샘플은 날 제품 및 가공 제품(이하 정의되는 바와 같음)으로부터 비롯될 수 있으며, 그 뿐 아니라, 대변, 위액, 소변, 혈액, 림프, 뇌척수액, 생체조직절편, 및 인간을 포함한 기타 동물로부터 채취된 샘플로부터 유래될 수도 있다. 또 다른 중요한 샘플 그룹은 환경에 기원한 것들 즉: 먼지, 스왑스(swaps), 보푸라기 등이다.

"제품(product)"이라 함은살모넬라의 존재 여부를 가리기 위해 조사되는 모든 종류의 샘플을 의미하는 반면, "가공된 제품(processed product)"이라 함은 예컨대,살모넬라를 준 치사 손상(sublethal damage) (예컨대, 발열, 건조, 경화, 산성화등)으로 이끌 수 있는 모든 종류의 가공(냉동 제외)에 노출된 적이 있으며, 일반적으로 하기 정의되는 바와 같은 원료를 5 중량% 미만 함유하는 식품이나 사료와 같은 제품으로서 정의된다. "날 제품(raw product)" 또는 원료라 함은 따라서, 상술한 가공을 거치지 않은 제품을 말한다. 날 제품은 일반적으로

- 날 고기 및/또는 생선 5 중량% 이상, 및/또는

- 날 계란 5 중량% 이상, 및/또는

- 원유 (raw milk) 5 중량% 이상, 및/또는

- 날 야채 및/또는 과일 5중량% 이상 및/또는

- 예컨대 하수, 및 대변으로부터 선택된 환경적 샘플 5 중량% 이상을 함유한다.

농축 공정 1)에 관해 먼저 설명한다. 이 농축 공정은, pH 5.6 내지 9.3으로 완충시킨살모넬라용 수성 성장 배지로 샘플을 이동시키고, 상기 이동 전 또는 이동과 동시, 또는 이동 후에 테트라티오네이트 및/또는 기타 셀레나이트와 다른 선택 물질을 배지에 첨가하거나 배지 중에 생산시켜, 얻어진 혼합물을 38℃ 이하의 온도에서 샘플 이동 후의 기간 동안 유지시킨 다음(예비-농축기간), 혼합물의 온도를 39-43℃로 상승시켜 온도 상승 후의 기간 동안 이 혼합물을 상승된 온도인 39-43℃에서 유지시키는 (농축 기간) 것으로 이루어진다. 농축 공정 1)은 선택 물질, 특히 테트라티오네이트를 사용한다는데 특징이 있다.

상술한 농축 공정 및 본 발명에 따른 기타 농축 공정에서 사용된 성장 배지는 기초적인 자화가능한 영양원, 미소영양분 및 필수 성장인자를 함유한다. 이 배지는살모넬라의 배양에 적합하게 조정된 삼투압을 가져야 하며 pH 범위는 5.6 내지 9.3으로 맞춰져야 한다. 배지에는 설탕이 전혀 없거나 실질적으로 없는 것이 바람직하며, 또는 배지가 설탕을 함유하는 경우에는, 그의 농도는 적어도 처음 10-12 시간 이내에 설탕이 발효됨으로써 산이 형성됨에 따라 배지의 pH가 상술한 범위를 벗어나지 않도록 완충 능력을 조절할 수 있는 범위여야 한다. 이러한 기준을 만족하는 우수한 배지는 완충된 펩톤수 (BPW: buffered peptone water)이다.

본문에서, "농축(enrichment)"라는 용어는 단순히살모넬라의 증식을 용이하게 하는살모넬라용 수성 성장 배지에서의 배양을 가리키는 반면, "예비-농축(pre-enrichment)"이라 함은 후속적인 농축 동안의 온도보다 낮은 온도에서의 예비 배양을 가리키는 것이다. "일차 농축(primary enrichment)"이란 처음 15-30 시간 동안 일어나는살모넬라용 수성 성장 배지에서의 실질적인 최초 배양을 가리킨다.

농축 공정 1)의 주요 전략은 이 공정의 초기 단계에서 선택 물질을 적용함으로써 가능한한 빨리 비-살모넬라를 억제 조건에 노출시키고, 동시에 선택 물질의 농도를 온도를 포함하는 다른 조건에 적응시킴으로써,살모넬라의 억제는 단지 거의 일어나지 않도록 한 다음,살모넬라가 그 조건에 적응하면, 온도를 상승시킴으로써 선택적인 조건을 보다 엄격하게 만듦으로써살모넬라가 많은 비-살모넬라와 비교할 때 우수한 성장속도를 보이게 할 뿐 아니라, 비-살모넬라는 추후 ELISA 측정시 간섭을 일으킬 수 있는 예컨대 플라겔라의 부진한 발육으로 인해 거짓 양성반응을 내는 경향이 덜 할 것이다. 예비 농축 기간은 10 분 내지 8시간의 범위일 수 있으나, 일반적으로는 ½시간 내지 7시간의 범위이고 흔히 1시간 내지 6½ 시간, 예컨대 2시간 내지 6시간, 특히 3시간 내지 5시간 범위이다. 바람직한 예비-농축 기간은 약 4시간이다.

상술한 농축 공정(및 기타 본문에서 설명된 농축 공정)에 있어서, 농축 개시후 특정 지점에서 성장 배지중 선택 물질을 생산하는 것이 가능하다. 선택 물질의 이러한 생산은 본 발명에 따라 바람직하게는 실질적으로 즉시 일어나는 것이 좋으나, 선택 물질의 농도가 서서히 증가하는 구배형(gradient-like) 공정일 수도 있다. 선택 물질이 테트라티오네이트인 경우, 테트라티오네이트의 생산은 배지 중에 티오설페이트를 유지시키고 후에 요오드를 첨가함으로써 수행되며, 이렇게 해서 테트라티오네이트를 배지 중에서 얻을 수 있다.

본문에서 "선택적 요소(selective principles)"라 함은, 수성 성장 배지 중에서 대부분의 다른 미생물들 (비-살모넬라)의 성장에 비해살모넬라의 성장을 촉진하는 수단을 말하는 것으로, 즉, 선택적 요소는 충분한 양으로살모넬라성장 배지에 첨가될 경우살모넬라의 성장을 대부분의 다른 미생물의 성장보다 덜한 정도로 저해시키는 물질 (선택 물질)일 수 있으며 또는 선택적 요소는살모넬라의 성장을 대부분의 다른 미생물의 성장에 비해 실질적으로 덜 저해시키는 값으로 물리적 변수, 예컨대 온도를 조정하는 것일 수 있다. 선택적 요소는 또한 선택적 요소를 이용하는 농축 후에 수행되는살모넬라의 존재 여부를 검출하기 위한 선택된 분석이 실질적으로 초기 샘플 중 여느 때 같으면 교차-반응하는 미생물 또는 분자의 존재에 의해 실질적으로 영향을 받지 않도록 하는 수단을 가리키기도 한다.

따라서, "선택적 농축"이라 함은 선택적 요소를 이용하는 농축 공정을 가리키며 결과적으로 "비-선택적 농축"이라 함은 선택적 요소를 이용하지 않는 농축 공정이다.

다른 미생물들 역시 당연히 분석 샘플 중에 존재할 것이며 심지어는 조사 대상인살모넬라보다도 더 높은 농도로 존재할 수 있으나 이들 미생물들은 선택된 분석과 간섭을 일으키지 않는데, 이는, 이들의 교차-반응성이 농축 공정 결과 위축되기 때문이다.

"일차 선택적 농축"이라 함은 일차 농축으로부터 최초의 8시간 이내에 선택적 농축으로 전환되는 일차 농축을 의미하는 것으로 한다.

상술한 바에 따라, "농축 브로쓰", "농축 배지", "일차 농축 브로쓰", "일차 농축 배지", "선택적 농축 브로쓰", "선택적 농축 배지", "일차 선택적 농축 브로쓰" 및 "일차 선택적 농축 배지"는 상응하는 농축공정에 사용되는 브로쓰 또는 배지를 가리키는 것으로 한다.

일차 선택적 농축은 분석시살모넬라가 초기 샘플 중에 존재한다면 양성 시그날을 결과시킬 것인살모넬라의 존재를 가리기 위해 측정을 수행하기 위해살모넬라를 충분한 양으로 제공하는데 그의 주요한 목적이 있다. 따라서 농축 공정은살모넬라의 초기 적은 농도를 성공적인 분석을 수행하기 위해 충분히 높은 농도로 농축시킬 수 있는 그의 능력에 대해 평가되어야 한다. 따라서,살모넬라에 대한 농축 공정과살모넬라측정이 결합된 방법의 감도는 사용된 측정법의 감도 뿐 아니라 농축 효율에 의존한다.

본문에서 "감도"라 함은, 초기 샘플 중,살모넬라가 존재할 경우, 이를 검출하는 방법의 능력으로서 정의된다. 어떤 방법이 스탠다드 프로토콜보다 감도가 더 좋다고 하는 것은 다수의 샘플을 무작위적으로 테스트할 때 그 방법이 통계적으로 볼때 스탠다드 프로토콜보다 참 양성 결과를 더 많이 발견할 것임을 의미하는 것이다.

농축 기간은 대체로 예비-농축 기간과 농축 기간의 합계가 10-48시간, 바람직하게는 15-30시간, 특히 17-24 시간이 되도록 채택하는데, 이렇게 함으로써 샘플 중살모넬라가 일반적으로 허용될만한 수준으로 증식할 것이고, 동시에, 농축 공정의 전체 기간이 만족스러울 정도로 단축된다. 본문에서 예비-농축 및 농축 기간이란 문제의 조건 하에서의 전체 시간을 말하며; 비록 일반적으로는 바람직하지는 않지만, 예비-농축 또는 농축 기간은 예컨대 선택 물질의 첨가 또는 발생시 또는 기타 이유로 해서 간섭될 수도 있다.

따라서, 적당한 농도의 테트라티오네이트와 39-43℃ 범위의 온도를 조합하면 한편으론살모넬라가 매우 잘 성장하고 다른 한편으로는 거짓-양성으로 이끌 수 있는 비-살모넬라로부터의 교차-반응성을 실질적으로 억압할 수 있다. 혼합물 중의 테트라티오네이트의 농도는 이론적으로는 약 5-40 mM일 수 있고 이 범위를 벗어날 수도 있지만, 테트라티오네이트의 농도는 일반적으로는 약 7-35 mM, 대개 약 9-30 mM, 바람직하게는 약 11-28 mM, 에컨대 약 13-26 mM, 특히 14-25 mM, 바람직하게는 약 15-23 mM이며 많은 경우 바람직하게는 약 16-22 mM, 특히 약 17-21 mM, 예컨대 약 18-20 mM일 수 있다. 가장 바람직한 테트라티오네이트의 농도는 약 19 mM이다. 상술한 바와 같이, 특정 상황에서 선택될 특정 농도는 특히 온도와 다른 선택 물질의 존재 여부에 의존한다. 테트라티오네이트에 대한 흥미로운 보조성분으로서,프로테우스(Proteus)와 많은 그램-양성 박테리아를 억압하기 위해 노보바이오신을 첨가할 수 있다. 노보바이오신의 최적량은 약 2.5 ㎍/ml이다. 안내 지침으로서, 39-43℃ 범위의 바람직한 온도는 적어도 실질적인 농축 부분 동안의 온도는 일반적으로 40-42℃ 사이가 될 것이며, 특히 40.5 내지 41.5℃, 더욱 바람직하게는 41℃인것이 좋다.

농축 공정 시작시의 배지의 pH는 5.6내지 9.3으로 완충시키지만, 비록 일반적으로 pH를 이 범위 내로 유지하는데 충분한 완충 능력이 존재한다 해도 특별한 경우, 예컨대, 원유제품의 경우와 같이 잠정적으로 산성인 pH의 샘플을 가지고 작업하는 경우, 전체 농축 기간 동안 pH가 이 범위 내로 유지되지 않을 것이다. 상술한 범위 내에서는, pH를 6.7 내지 7.3, 특히 약 7.0으로 유지시키는 것이 바람직하다.

바람직하게는, 샘플을 배지에 첨가하기 전에 테트라티오네이트 또는 다른 선택 물질, 예컨대 노보바이오신이 배지에 존재하는 것이 좋다. 테트라티오네이트의 경우, 이 물질은 일반적으로 배지에 요오드를 첨가함으로써 인 시투(in situ)적으로 생산되기 때문에, 배지에 미리 첨가된 티오설페이트와 반응할 것이라는 것을 유념해야 한다. 그러나, 보통 바람직하지는 않지만, 샘플이 배지에 첨가된후 테트라티오네이트 및/또는 다른 선택 물질이 배지 중에 생산되거나 첨가될 수도 있음을 이해하여야 한다. 이러한 경우, 선택 물질의 첨가 또는 생산은 일반적으로 이동 후 최대 4 시간, 적당하게는 이동 후 최대 2시간, 바람직하게는 이동 후 최대 1 시간, 가장 바람직하게는 최대 10분간 일어나는 것이 좋다.

예컨대 AOAC와 같은 스탠다드 프로토콜을 포함하여, 일반적으로살모넬라농축에 소듐 하이드로겐 셀레나이트와 같은 셀레나이트 (이하, 셀레나이트라 칭함)가 사용되고 있지만, 셀레나이트는 본 발명에서는 바람직하지 않은데, 그 이유는 특히 이것이 거짓 양성을 초래할 문제가 있기 때문이다. 이와 같은 이유로, 농축 배지중에는 셀레나이트가 존재하지 않는 것이 바람직하고, 또는 셀레나이트가 있다 해도 그 농도는 용액 중 최대 0.5% w/v 소듐 하이드로겐 셀레나이트를 함유하는 셀레나이트 농도에 상응할 정도로 제한된다.

살모넬라존재의 검출 여부를 위해 일차 선택적 농축과 후속적인 측정을 조합한 공정의 중요한 한가지 특성은 특이성이다; 이러한 조합법은살모넬라의 존재에 기인한다고 할 수 없는 양성 결과를 일으킬 수 있음을 이해하여야 한다. 따라서, 본 발명에 따른 방법과 같은 방법 역시 거짓-양성 결과를 회피할 수 있는 능력에 대해 검정되어야 한다. 따라서, 고품질의 측정 결과를 얻기 위해 농축 공정 조건을 측정에 맞게 적응시킨다.

본문에서 "특이성"이라는 용어는 어떤 방법이 거짓-양성 결과 또는 시그날의 발생을 피할 수 있는 능력을 가리키는 것으로 한다. 거짓-양성 결과 또는 시그날을 적게 발생시키는 방법은 고도의 특이성을 갖는 방법이라 할 수 있다.

상기와 같은 적응을 보조하기 위해, 일련의 간단하고 재생가능한 테스트가 개발되었다. 이들 테스트 중 두가지는 ATCC와 같은 국립 미생물 기탁기관으로부터 입수 가능한, 쉽게 이용가능한 스탠다드의 순수한 배양체를 사용한다:

테스트 1)은 어떤 방법의살모넬라검출능력을 시험하는 것으로서 상술한 농축 및 측정 공정을 수행함으로써 수행되는데 여기서는 선택적 농축 배지에살모넬라균주를 출발 농도 약 15개 세포/ml의 농도로 접종하고 10%의 무작위적으로 선택된 잘게다진 날고기를 농축기간 개시 무렵 농축 배지에 첨가하여 결과적인 혼합물을 농축기간의 온도로 유지시키는 것으로 되는데, 이 테스트는 검출시, 무작위적으로 선택된살모넬라혈청형 패널을 테스트할 경우 모든 경우의 90% 이상에서 양성 결과가 나을 경우 합격된 것으로 간주한다.

테스트 2)는 어떤 방법에 있어서 거짓 양성반응을 피할 수 있는 능력을 시험하는 것으로 상술한 농축 공정과 측정 공정을 수행함으로써 수행되며, 여기서는 농축 기간 개시 무렵 선택적 농축 배지에 다음 균주, 즉;

시트로박터 프로인디이 (Citrobacter freundii),

에스케리치아 콜라이 (Escherichia coli), 및

엔테로박터 클로아카에 (Enterobacter clacae)

중 어느 하나의 비-살모넬라종 균주를 출발 농도 약 100 마리/ml의 농도로 접종하여, 선택적 농축 배지에는, 접종된 비-살모넬라균주 이외의 미생물이 실질적으로 없도록 하며, 결과적인 혼합물을 농축기간의 온도에서 유지시키는 것으로 되는데, 이 테스트는 분석시 거짓 양성의 백분율이 비-살모넬라종으로부터 무작위적으로 선택된 20개 균주 패널의 테스트시, 각 종의 15% 이하이면 합격한 것으로 간주한다.

특정 셋업이 하나 또는 두가지 모두의 테스트에 합격하지 못할 경우, 테스트 (2)가 너무 많은 거짓 양성을 일으킬 경우 농축 온도 및/또는 선택된 물질의 농도를 증가시키고/또는 예비-농축 시간을 감소시키고, 테스트 (1)에서 거짓 음성을 피하기 위해 선택적 요소 경색을 감소시킴으로써 당업자들은 농축 조건을 검출 조건에 맞게 세밀하게 조정할 수 있는 방법을 이해할 것이다.

테스트 1에서 참 양성의 최소치는 90%인데, 이 수치가 높을 수록, 예컨대92%, 또는 95%일 수록 바람직하며, 97%, 심지어 99.5%, 더욱 바람직하게는 99.9%이면 좋다.

또한, 테스트 2 는 거짓 양성을 15% 이하로 결과시켜야 하며, 바람직하게는 12%, 또는 10%, 더욱 바람직하게는 7%, 또는 5%, 심지어 1% 또는 ½%인 것이 바람직하다.

보다 궁극적인 테스트는 본문에서 정의된 RV 대신 본문에서 정의된 RVS를 사용하여 RVS를 42℃에서 인큐베이션하며 본문에서 정의된 XLD를 플레이팅 배지로서 사용하는 것을 제외하고 스탠다드 프로토콜 NMKL no. 71 (Nordic Committe on Food Analysys법 no. 71, 1991, 제 4판)을 기준으로 하여, 이에 대한 셋업과 보정(calibration)으로 이루어지는데, 측정 결과는 스탠다드 프로토콜과 비교할 때 적어도 80%의 참 양성 결과를 초래하고, 잘게 다진 고기 샘플 100개를 테스트할 때 (테스트3)본문에서 정의된 바와 같은 거짓 양성 결과를 10%이하로 일으키며, 두가지 방법 각각에 의해 테스트될 샘플 부분의 중량이 25g이고, 100개의 샘플은 10개의 다른 소매상으로부터 제공되며, 이들 각각은 10개의 상이한 샘플들을 전달하고 제공된 샘플 중 20개에는 샘플 하나 당 약 15마리의살모넬라타이피뮤리움(Salmonella typhimurium)세포가 접종되어 있으며 샘플 20개에는 샘플 당살모넬라 엔테리티티스(Salmonella enteritites)세포가 약 15마리 접종되어 있는 것이다.

이러한 측정에 있어서, 최소한의 요구사항은 스탠다드 프로토콜과 비교하여 본 발명의 방법에 의한 참 양성이 80%인 것일 수 있지만, 그 목적은 때로 85%,90%, 92%, 95%, 97%, 98%, 99%, 및 심지어 100%, 심지어 그 이상의 양성반응을 얻는 것일 수 있다. 거짓 양성의 수와 관련하여, 최대 허용치는 일반적으로 10%이지만, 그 목적상 더 낮은 백분율, 즉, 8%, 5%, 3%, 2% 및 1%, 심지어 0%인 것이 좋다.

본 발명에 따른 방법의 한가지 장점은 이 방법의 총 검출 시간이 스탠다드 프로토콜보다 짧다는 것이다. 따라서, 농축 공정과 검출 공정을 합해도 일반적으로 56시간 이하, 예컨대 48시간, 40 시간, 34시간, 32 시간, 28시간이며, 더욱 현실적인 구체예에서는 일반적으로 24시간 이내 또는 22시간 또는 20시간이 된다.

상술한 방법은 가공된 제품과 다른 샘플, 예컨대 상기 정의한 바와 같은 날 제품중살모넬라를 검출할 때 바람직하게 이용된다.

농축 공정 2)를 다음에 설명한다. 이 공정은 pH 5.6 내지 9.3으로 완충시킨살모넬라용 수성 성장 배지로 샘플을 이동시키고, 이 성장 배지를 샘플과 함께 39-42.5℃에서 유지시킨 다음, 상기 이동 전 또는 이동과 동시, 또는 이동 후 8시간 이내에 테트라티오네이트 및/또는 기타 셀레나이트와는 다른 선택물질을 배지에 첨가하거나 배지 중에 생산시켜, 상기 이동 후의 기간동안 얻어진 혼합물을 39-42.5℃의 온도에서 유지시키는(농축 기간) 것으로 이루어진다.

이러한 농축 공정의 전략은 온도를 농축 공정 개시 직후부터 주요 선택적 변수로서 사용하고, 테트라티오네이트 및/또는 다른 선택 물질들을 바람직하게는 실질적으로 가능한 한 빨리 적량 첨가하는 것이다. 이 전략과 관련한 상세한 내용, 측정, 및 테스트 1) - 3)과 그의 동위 관계에 대해서는, 상술한 농축 공정 1)의 설명과 특허청구의 범위를 참조하면 된다. 그러나, 농축 공정 2)의 중요한 변경 사항은 노보바이오신을 샘플의 이동 전, 이동과 동시, 또는 이동 후 유일한 선택 물질로서 배지에 첨가하였다는데 있으며, 이 경우 노보바이오신의 양은 ml 당 약 1 내지 100 ㎍, 특히 1-20 ㎍, 특히 ml 당 2-13 ㎍인 것이 좋다. 이 경우, 농축 온도는 바람직하게는 40-42℃ 범위인 것이 좋다.

마지막으로, 농축 공정 3)은 pH 5.6 내지 9.3으로 완충시킨살모넬라용 수성 성장 배지로 샘플을 이동시키고, 상기 이동 전 또는 이동과 동시, 또는 이동 후 3시간 이내에 테트라티오네이트를 배지에 첨가하거나 배지 중에 생산시켜, 얻어진 혼합물을 상기 샘플 이동 후의 기간동안 얻어진 혼합물을 36-39℃의 온도에서 유지시키는 (농축 기간) 것으로 된다. 또한, 이 공정과 관련하여, 공정 1)에 대해 설명된 부분도 어느 정도 부합되나, 중요한 예외는 공정 3)의 경우 온도를 36 - 39℃ 범위에서 유지시킬 때 최상의 결과가 얻어진다는 것과 테트라티오네이트를 샘플 첨가로부터 약 1시간, 바람직하게는 5분 이내에 첨가 또는 발생시켜야 한다는 것이다.

상술한 모든 변경 사항들은주로 날 샘플에 대해 적합하며, 본 발명의 다른 중요한 측면은 특히 가공된 제품 중의살모넬라를 농축 및 측정하는 방법에 관한다. 다음에 상세히 설명될 이러한 측면은 다음 중 어느 하나로 이루어지는 농축 공정을 수행하는 것으로 된다:

a) pH 5.6 내지 9.3으로 완충된, 실질적으로 박테리아 성장-저해 물질을 전혀 함유하지 않는살모넬라용 수성 성장 배지로 샘플을 이동시키고, 얻어진 혼합물을 39.0℃ 이하의 온도에서 적어도 1분간 유지시킨 다음 (예비-농축 기간),

혼합물의 온도를 39.5-43℃ 로 상승시키고 임의로 노보바이오신 및/또는 기타 선택 물질을 첨가하여

이 혼합물을 39.5-43℃의 상승된 온도에서 온도 상승으로부터 일정기간 유지시키거나 (선택적 농축 기간), 또는

b) pH 5.6 내지 9.3으로 완충된살모넬라용 수성 성장 배지로 샘플을 이동시키고, 노보바이오신 및/또는 기타 선택물질을 샘플 이동전, 이동과 동시, 또는 이동 후 배지에 첨가 또는 배지 중에서 생산시킨 다음, 얻어진 혼합물을 39.0℃ 이하의 온도에서 샘플의 이동 또는 노보바이오신 또는 기타 다른 선택물질의 첨가시점으로부터의 두가지 중 보다 나중의 기간 동안 유지시킨 다음 (예비-농축 기간),

혼합물의 온도를 39.5-43℃로 상승시키고 임의로 노보바이오신 또는 기타 선택 물질을 첨가하여

c) pH 5.6 내지 9.3으로 완충된살모넬라용 수성 성장 배지로 샘플을 이동시키고, 노보바이오신을 샘플 이동 전, 이동과 동시, 또는 이동 후 배지에 첨가 또는 배지 중에서 생산시킨 다음, 얻어진 혼합물을 39.0℃ 이하의 온도에서 노보바이오신 또는 기타 선택 물질의 이동 또는 첨가시점으로부터의 두가지 중 보다 나중의 기간 동안 유지시킨 다음 (농축 기간),

증식 수 농축 배지 중에 존재하는살모넬라를 동정 및/또는 정량하기 위한측정을 수행한다.

본 발명의 이러한 측면 이면의 전략은, 이론적으로는 처음 언급한 측면의 전략과 동일하다. 즉,살모넬라가 준비되는 대로 가능한 한 빨리살모넬라를 선택적 요소로 처리시켜야만 하지만, 본 측면은 가공된 샘플 중의 살모넬라를 준치사적(sublethally)으로 손상시켜 이것이 어떠한 명확한 선택성을 요하기 전에 적절히 재활시켜야만 한다는 것을 특별히 고려하고 있다.

본 발명의 이 측면에 따른 농축 공정은 독특하고도 유리한 것으로 생각되는데 이 공정이 완벽하게 적응시킬 수 있는 분석 측정(상기 정의한 바와 같은)과 관련하여서 뿐만 아니라, 통상적인 한천 평판법 및 통상적인 선택적 농축 배지(예컨대 하기 정의되는 바와 같은 RV 및 TTB)와 조합적으로 사용될 수 있는, 그 자신 일반적으로 우수한 농축공정으로서 믿어진다. 그러나, 대부분의 목적에 있어서, 측정은 표적 분자 또는 표적 분자와 관련된 분자 상호작용을 동정 및/또는 정량하는데 기초하며, 본문에서 정의된 한천 평판법과는 상이한 분석 단계로 이루어지는 것이 바람직하며, 특히 날 제품과 관련한 측면에 관해 논의된다.

각각의 농축 공정의 조건은 다음을 측정하도록 적용되는 것이 바람직하다:

- 열처리된살모넬라균주의 세포를 초기 농도 약 1000 세포/ml로 하여 5% 비-유지방 건조 밀크와 함께 수성 성장 배지에 농축 공정 초기에 접종하는 것으로 되는, 농축 공정과 측정 단계로 이루어진 테스트 (테스트4)에 의해 측정시, 무작위적으로 선택된살모넬라혈청형 패널을 테스트할 경우 모든 경우의 90%에서 양성 결과가 나오도록 하고,

- 다음 비-살모넬라종, 즉

시트로박터 프로인디이 (Citrobacter freundii),

에스케리치아 콜라이 (Escherichia coli), 및

엔테로박터 클로아카에 (Enterobacter cloacae)

중의 어느 한 균주를 출발 농도 약 100 세포/ml의 농도로 농축 단계 개시시 수성 성장 배지에 접종시키는 농축 단계 및 측정 단계로 이루어지는 테스트(테스트 5)에 따라 비-살모넬라균주의 무작위적으로 선택된 20개 종의 패널의 각 종에 있어서 25% 이하의 거짓 양성 백분율이 결과될 것이다.

상술한 세포들의 열처리는 0.85% NaCl을 함유하는 51℃의 물 중에서 10분간 수행하여야 한다.

이 경우에 있어서도, 뱃치 및 종류별로 무작위적으로 선택된 5Og의 분유 샘플 총 50개를 테스트할 경우 (테스트 6), 스탠다드 프로토콜에 비해 80% 이상의 참 양성 결과가 나오도록 하고, 본문에서 정의된 바와 같은 거짓-양성 결과는 10% 이하가 나오도록 하는 방식으로, 스탠다드 배양 프로토콜 NMKL no. 71 (Nordic Committee on Food Analysis method no. 71, 1991)을 기준으로 보정되는 방법으로서, 여기서, 상기 각 샘플은 25g씩의 두 부분으로 나뉘며, 각 부분은 청구범위 21 - 25항 중 어느 한 항에 따른 방법으로, 다른 부분은 스탠다드 배양 프로토콜로 처리되고, 25g 부분의 50 세트 중 25 세트는 다음과 같은 방식으로 스파이크(spike)되고:

- 스탠다드 배양 프로토콜로 처리된 25g의 한 부분은 프로토롤의 농축 공정개시 무렵, 약 5 CFU의살모넬라 파나마(Salmonella panama)또는살모넬라 타이피뮤리움(Salmonella typhimurium)을 함유하는 비-유지방 건조 밀크 0.1 - 1g을 프로토콜에 사용된 수성 성장 배지에 첨가함으로써 보강되고,

- 본 발명에 따른 방법으로 처리된 25g의 다른 부분은 농축 공정의 개시 무렵, 약 5 CFU의살모넬라 파나마(Salmonella panama)또는살모넬라 타이피뮤리움(Salmonella typhimurium)을 함유하는 비-유지방 건조 밀크 0.1-1g을 수성 성장 배지에 첨가함으로써 보강하는 방식으로 수행한다.

"CFU" (Colony forming units)는 통상적인 희석 및 평판기술을 이용하여 측정한다.

테스트 4) - 6)에서 목적하는 결과와 관련하여, 특히 날 제품에 대해 상기에서 설명된 바 있는 것과 동일한 고려 사항이 적용되나, 예외적으로, 테스트 5는 일반적으로 상기의 상응하는 테스트 2에 비해 다소 덜 엄격하다는 점이 다르며, 첨부된 특허청구의 범위에서 명료히 나타날 것이다.

변경예 a) 또는 b)에 있어서, 예비-농축 기간은 일반적으로 ½ 시간 이상, 예컨대, 1 - 10시간, 바람직하게는 1 - 8시간, 특히 2 - 6시간, 예컨대 3 - 5시간이며 가장 바람직하게는 3½ - 4½ 시간인 것이 좋다. 특히 바람직한 예비-농축 기간은 약 3 시간이다.

총 농축 기간, 측정 단계의 기간과 분석 특성과 관련하여, 동일한 고려 사항이 적용된다.

상기 모든 측면에서, 샘플을 관련된 제품의 특정 분야의 관련 법규에 따라준비한다. 따라서, 샘플 준비는 공지의 표준 방법에 따라, 연마, 분쇄, 균질화 등으로 이루어질 수 있다.

실시예

재료 및 방법

살모넬라는 가능한 한 낮은 농도, 즉 식품 25g 중 1마리의 정도의 농도에서도 측정되어야 하므로 ELISA 분석에 앞서 샘플을 농축시킬 필요가 있다.

이 실시예에 사용된 농축 공정은 상술한 이론에 따른 선택적 일차 농축(15-30시간), 및 후속적인 분석시 간섭을 일으킬 수도 있는 식품 성분들을 희석하기 위해 측정 단계의 일부로서 몇몇 실시예에서 변형된 M-브로쓰 중 후-농축 공정으로 이루어진다.살모넬라의 희석을 보상하기 위해 후-농축 공정은 일반적으로 약 2 내지 약 6 시간동안 40-43℃의 온도에서 수행된다. M-브로쓰의 변형은 테트라티오네이트 또는 노보바이오신 중 어느 하나를 첨가하는 것으로 이루어진다.

따라서, 총 농축 공정은 총 약 15내지 약 36 시간동안 수행될 수 있다.

다음 배지를 후술하는 실시예에 사용하였다:

API-2OE시스템: Bio Merieux 20100.

BGA: Brilliantgreen agar (Merck 7273/Oxoid CM 329)

BPW: Buffered Peptone Water (Gibco 152 03812/Oxoid

CM501)

Conjugate 1: 효소 β-갈락토시데이즈에 콘쥬게이트된살모넬라

모노클로날 항체 (2㎍/ml).

Conjugate 2: 바이오틴에 콘쥬게이트된살모넬라폴리클로날 항체.

AV-GAL: 1% 소의 혈청 알부민에 2000 배 희석된 β-갈락 토

시데이즈(Zymed)에 콘쥬게이트된 스트렙트아비딘.

H-혈청: 다가 H-혈청 (Difco 2406).

LIA : Lysine Iron Agar (Difco: O849).

MB: M-Broth (Difco 0940)

MBN: 노보바이오신이 보강된 M-Broth(Sigma N 1628, 10

㎍/㎖).

O-혈청: 다가 O-혈청 (Difco 2264).

ONPG 브로쓰: Cowan, 1974에 의해 설명된 바와 같이 제조된 O-

니트로페닐-β-D-갈락토피라노사이드(Sigma N 1127).

입자 sol. 2.:살모넬라공통 플라겔라 항원에 지향된 모노클

로날 항체로 코팅된 Imunospheres (Dynabead^R

(Dynal, Norway의 등록상표), 2.0 mg/ml).

입자 sol. 1.:살모넬라공통 플라겔라 항원에 지향된 모노클

로날 항체로 코팅된 Immunospheres (Dynabead^R

Dynal, Norway의 등록상표, 2.0 mg/ml).

RV 브로쓰: Rappapport-Vassiliadis 브로쓰 (Merck 7700).

RVS 브로쓰: Rappaport-Vassiliadis 브로쓰 (Oxoid CM 866).

RM: Raw 배지: 19 ml/l의 요오드 용액 첨가에 의해

그의 일부가 테트라티오네이트로 전환된 17 g/l

NaS₂O₃(Merck 6516)이 보강된 BPW.

요오드 용액: 6g 요오드 (Merck 4761) + 5g KI (Merck 5043) +

2Oml H₂O.

STOP: 글라이신 완충액, 0.1 M, pH 10.5.

SUB: 0.7% 디메틸포름아미드 중 1mM MgCl₂, 4-메틸룸벨

리페릴-β-갈락토시드, 100 μM.

TSI: Triple-Sugar-Iron (Difco 0265).

TTB: 테트라티오네이트 브로쓰 (Difco 0104).

Wash: PBS (포스페이트 완충염수) + 0.1% Triton-X100, pH

7.4.

XLD: Xylose Lysine 데속시콜레이트 한천(Gibco 152-05600

/Oxoid CM 469).

라이신 브로쓰: 10 ml H₂O 에 용해되어 Decarboxylase Base

Moeller(Difco 0890) 200 ml에 첨가된 2 g L-라이

신 (Merck 5700).

Ion sulphite: 무명씨에 의해 1980년 설명된 바에 따라 제조

된 한천 배지.

MX4: 20 ul/ml 요오드 용액의 첨가에 의해 그의 일부

가 테트라티오네이트로 전환된, 17 g/l Na-S₂O₃

(Merck 6516)이 보강된 MB.

농축된 모든 샘플은 자동분석기 상에서 ELISA(Enzyme Linked Immune Sorbent Assay) 기술을 사용함으로써 측정하였다. 실시예 3 - 8은 자동 ELISA 분석을 위해 Foss Electric사 (Denmark)가 고안한 장치인 EiaFoss^TMAnalyzer를 이용하여 수행한 반면, 실시예 1과 실시예 2는 동일한 장치의 발전된 모델을 이용하여 수행하였다.

ELISA-1:

이 ELISA 분석은살모넬라항원에 지향된 두가지 상이한 모노클로날 항체를 이용하는 "샌드위치-기술"에 기초한 것이다. 항체들은 음성 플라겔라와는 약간만 반응하지만, 열-처리된살모넬라추출물과는 강하게 반응한다. 따라서, 농축 샘플들을 ELISA 수행에 앞서 실시예 1에 상세히 설명된 바와 같이 100℃에서 15분간 열처리한다. 이 열처리는살모넬라와 기타 병원성 박테리아를 사멸/불활성화시킨다. ELISA는 ml당 10⁵마리의 세포를 검출할 수 있다. 농축이 완료된 때의살모넬라의 수가 ml 당 10⁵마리 이상이 되도록 농축 공정을 수행한다.

EiaFoss^TM분석기 상의 자동화 ELISA 분석은 약 75분 정도 소요되지만, 수동으로 수행할 수도 있고 다음과 같이 설명될 수 있다:

- WASH(음성 대조군)가 함유된 테스트 튜브와 500 ul 칼리브레이터(ml 당 약10⁶개의 세포의 농도로 희석된살모넬라타이피뮤리움의 열-처리된 현탁액)를 함유하는 테스트 튜브를 열처리된 샘플 500 ㎕를 함유하는 테스트 튜브들과 함께 샘플 디스크에 위치시킨다.

- 샘플들을 35℃로 가열하고 분석을 시작한다.

- 각 샘플에 90 ㎕ 입자 sol. 1을 첨가하여 12½분간 인큐베이션시킨다. 샘플에 존재하는살모넬라항원은 항체와 반응하여 면역구의 표면에 면역 복합체를 형성할 것이다. 마이크로스피어의 총 표면적은 매우 크고, 이것은 항체와 항원사이의 결합을 신속하고 효율적으로 일어나게 한다.

- 면역구가 자기력에 의해 테스트 튜브의 측면에 체류하는 동안 결합되지 않은 물질을 WASH로 세정해 낸다.

- 이어서 130 ㎕의 콘쥬게이트 1을 첨가하고 12½분간 인큐베이션시킨다. 콘쥬게이트된 항체는 면역구-항원 복합체에 결합한다. 이것은 필링 (filling)으로서살모넬라항원과의 "샌드위치"를 만들어낸다.

- 결합되지 않은 표지된 항체를 WASH로 세정해낸다.

- 200 ㎕의 SUB를 첨가하여 l2½분간 인큐베이션시킨다. 입자에 결합된 효소들은 기질을 a.o. 4-메틸룸벨리페릴, 형광 검색기에 의해 측정된 형광화합물 (365 nm 여기, 45Onm방출)로 나눌 것이다.

- 효소 반응은 200 ㎕ STOP 첨가에 의해 중지시킨다. 4-메틸룸벨리페릴의 농도를 검출기에 의해 측정하면 농도는 샘플 중살모넬라항원의 양과 비례한다. 개개의 샘플에 대한 형광 시그날을 25% 칼리브레이터 시그날로 정의된 컷-오프값과비교한다. 컷-오프 값과 같거나 더 높은 시그날을 갖는 샘플은 양성인 것으로 고려된다. 컷-오프 값 미만의 시그날을 갖는 샘플들은 음성인 것으로 간주한다.

ELISA-2:

이 ELISA 분석 역시 "샌드위치-기술"에 기초하며,살모넬라항원에 대한 두가지 상이한 항체(하나는 모노클로날, 다른 하나는 폴리클로날)를 이용한다. 이 항체들 역시 자연적인 플라겔라와는 약간만 반응하지만, 열-처리된살모넬라추출물과는 강력하게 반응한다. 따라서, ELISA를 수행하기에 앞서 실시예 1에 상세히 설명된 바와 같이 100℃에서 15분간 농축 샘플을 열처리시킨다. 이 열처리에 의해살모넬라및 기타 병원성 박테리아가 사멸/불활성화된다. ELISA는 ml 당 10⁶마리의 세포를 검출할 수 있다.

ELISA 분석은 다음과 같이 설명될 수 있다:

- WASH(음성 대조군)가 함유된 테스트 튜브와 500 ㎕ 양성 대조군(㎖ 당 약 10⁶개의 세포 현탁액 중의 플라겔린 농도에 상응하는 농도로 희석된살모넬라타이피뮤리움 플라겔린의 정제된 용액)을 함유하는 테스트튜브를 열처리된 샘플 500 ㎕를 함유하는 테스트 튜브들과 함께 샘플 디스크에 위치시킨다.

63 ㎕/ml 콘쥬게이트 2도 함유하는 60 ㎕ 입자 sol. 2를 각 샘플에 첨가하여 25분간 인큐베이션시킨다. 샘플에 존재하는살모넬라항원은 항체와 반응하여 면역구 표면에 면역 복합체를 형성할 것이다. 바이오틴-콘쥬게이트된 항체는 동시에 면역구-항원 복합체에 결합한다. 이로 인해 필링으로서살모넬라항원과의 "샌드위치"가 생산된다. 마이크로스피어의 총 면적은 매우 크기 때문에, 항체와 항원사이와 결합을 신속하고 효율적으로 일어날 수 있다.

- 결합되지 않은 물질을 WASH로 세정하는 한편 면역구는 테스트 튜브의 측면에 자기력에 의해 체류된다.

- 이어서 100 ㎕의 AV-GAL을 첨가하고 20분간 인큐베이션시킨다. AV-GAL은 면역구-항원-항체 복합체에 결합한다.

- 결합되지 않은 AV-GAL을 WASH로 세정해낸다.

- 230 ㎕의 SUB를 첨가하여 8분간 인큐베이션시킨다. 입자에 결합된 효소들은 기질을 a.o. 4-메틸룸벨리페릴, 형광 검색기예 의해 측정된 형광화합물 (365 nm 여기, 45Onm 방출)로 나눌 것이다.

- 효소 반응은 230 ㎕ STOP 첨가에 의해 중지시킨다. 4-메틸룸벨리페릴의 농도를 검출기에 의해 측정하면 농도는 샘플 중살모넬라항원의 양과 비례한다. 개개의 샘플에 대한 형광 시그날을 음성 대조군 시그날의 두배로 정의된 컷-오프값과 비교한다. 컷-오프 값과 같거나 더 높은 시그날을 갖는 샘플은 양성인 것으로 간주한다. 컷-오프 값 미만의 시그날을 갖는 샘플들은 음성인 것으로 간주한다.

상술한 ELISA에 사용된 항체들은 당업자에게 잘 알려진 방법에 의해 제공될 수 있다.

살모넬라에 대한 폴리클로날 항체는 예컨대 토끼를 정제된 플라겔라로 면역시킨 다음 표준화된 면역화 공정으로 처리함으로써 생산할 수 있다. 토끼로부터 채혈하여 혈청을 분리한 다음 역시 표준 기술에 따라 정제한다. 항체들을 교차-반응성시트로박터 프로인디이(Citrobacter freundii)로부터 정제된 플라겔라를 이용하여 폴리클로날 항체로 이루어진 항-혈청을 흡착시킴으로써 추가로 정제한다.

모노클로날 항체는 면역원으로서살모넬라플라겔린을 이용하여 표준 모노클로날 항체 기술에 따라 생산할 수 있다 (모노클로날 항체에 관한 정보는 예컨대 Kohler & Millstein, 1975 참조).

실시예 1

잘게 다진 고기의 스파이크된 샘플 중살모넬라의 일차 선택적 농축 및 측정.

살모넬라가 없는 잘게 다진 고기 샘플 1g씩 두 부분을 RM 10 ml씩이 함유된 두개의 테스트 튜브로 옮겼다. 하룻밤 배양(37℃)된살모넬라를 0.85% NaCl 용액 중에 1O⁵배로 희석하여 최종살모넬라를 약 3 ×10³세포/ml로 하였다. 이 세포 현탁액 50 ㎕을 상술한 테스트 튜브 중하나에 첨가하여 평균 초기 세포 농도를 ml 당 15개 세포로 한다. 두가지 테스트 튜브 모두 41℃에서 24시간 인큐베이션시켰다.

농축에 이어, 테스트 튜브를 끓는 물에서 15분간 가열하였다. 냉각후, 열-처리된 현탁액을 ELISA-2 분석시켰다.

표 1

총 34개의 다진 고기 샘플들을 상술한 바와 같이 테스트하였다 (테이블 1 중에 오염 유형을 표시하였다). 스파이크된 샘플 34개 모두는 ELISA-2 분석에서 양성 반응을 나타내었으며 오염되지 않은 고기 샘플 중 어느 것도 양성을 나타내지 않았다.

따라서, 날 음식 샘플로부터살모넬라를 농축하기 위한 본 발명의 방법은 약 15 마리 세포/ml의 농도로부터 ELISA-2의 컷오프 값인 약 10⁶마리 세포/ml의 수준으로살모넬라를 특이적으로 농축함을 보여준다.

실시예 2

실시예 1 방법의 온도 의존성

일차 선택적 농축을 37℃ 및 43℃에서도 수행한 것을 제외하고 실시예 1에 설명된 것과 유사한 방식으로 25개의 잘게 다진 고기 샘플을 처리하였다. 고기 샘플의 오염 계획은 다음 표 2에 나타낸 바와 같다.

표 2

결과는 다음 표 3에 나타낸 바와 같다:

표 3

따라서, 상술한 결과로부터 명확히 알 수 있는 바와 같이, 최적온도는 약 41 ℃이다.

이 방법의 온도 의존성을 좀 더 조사하기 위해, 잘게 다진 고기 샘플 9가지를 39℃, 40℃, 41℃ 및 42℃에서 상술한 바와 같이 테스트하였다. 접종 계획은 표 4에 나타내었다:

표 4

이 테스트의 결과를 다음 표 5에 나타내었다:

표 5

분명히 알 수 있는 바와 같이, 실시예 1의 방법은 39-42℃의 전체 온도 범위에서 민감하고 매우 특이적이었다.

실시예 3

날 제품 및 가공된 제품으로부터의살모넬라의 일차 선택적 농축의 선택성.

25가지 상이한살모넬라균주와 11가지 상이한 비-살모넬라균주들을 MB 중 비-선택적 조건 하에서 농축시키고(37℃, 18시간), 100℃에서 15분간 열처리 한다음 10,000배 희석으로 10배 단계적으로 희석하였다. 11개의 비-살모넬라균주들은살모넬라와 밀접한 관계에 있는 100개의 균주로부터 선택하였으며 이들 모두는 (실험 초기에서) ELISA-l에서는 약한 정도에서 강한 정도에 이르기까지 교차-반응성을 보인 반면 나머지 89개의 균주들은 그렇지 않았다. 희석된 현탁액을 ELISA-1 테스트시켰다. 결과는 다음 표 6에 나타낸 바와 같다:

표 6

살모넬라와 비-ㅍ의 동 균주들 역시 특히 날 제품의 농축에 적합한 일차 선택적 농축에 이어 ELISA-1로 처리하였다:

1.5 ug/ml의 노보바이오신과 열-처리된(100℃에서 15분간) 잘게 다진 고기 1g이 보강된 10 ml RM을 함유하는 테스트 튜브에 ml 당 약 10³개의 세포를 첨가하였다. 이어서 테스트 튜브를 41℃에서 19시간 동안 인큐베이션시켰다. 이어서 0.5 ml의 농축된 현탁액을 10ml의 MBN으로 옮긴 다음 42℃에서 3시간 인큐베이션시켰다. MBN을 열처리하고, 희석하여 이 실시예에서 상술한 바와 같이 ELISA-1 테스트하였다.

표 7

표 6 및 표 7로부터 명확히 알 수 있는 바와 같이, 본 발명에 따른 농축은 비-선택적으로 농축될 경우 교차-반응하는 비-살모넬라균주 11개 중 10개의 교차-반응성을 제거할 수 있다. 또한,살모넬라는 선택적 일차 농축 공정에 의해 훨씬 낮은 정도로 영향을 받았음을 알 수 있다.

살모넬라와 비-살모넬라의 동일한 균주들을 가공된 제품의 농축에 특히 접합한 일차 선택적 농축 후 ELISA-1로 처리하였다:

ml 당 약 30 개의 세포를 2.5 ㎍/ml 노보바이오신이 보강된 BPW 10ml를 함유하는 테스트 튜브에 첨가하였다. 테스트 튜브를 37℃에서 4시간 동안 인큐베이션시켰다. 그 직후, 테스트 튜브를 41℃에서 15시간 더 인큐베이션시켰다. 이어서, 0.5 ml의 농축된 현탁액을 10 ml의 MBN에 옮긴 다음 42℃에서 3시간동안 인큐베이션시켰다. 이 실시예에서 상술한 바와 같이 MBN을 열-처리하고, 회석한 다음 ELISA-1 테스트하였다.

표 8

따라서, 표 6 및 표 8로부터 명확히 알 수 있는 바와 같이, 본 발명에 따른 농축에 의해 비-선택적으로 농축될 경우 교차-반응한 비-살모넬라균주 11가지 중 9가지를 제거할 수 있다. 그러나, 살모넬라는 일차 선택적 농축에 의해 훨씬 낮은 정도로만 영향을 받았다.

실시예 4

날 제품에 있어서살모넬라의 일차 선택적 농축 및 측정과 표준 배양 공정과의 비교.

RV를 41.5℃가 아니라 42.5℃에서 인큐베이션시킨 것을 제외하고 Nordic Committee on Food Analysis (NMKL no. 71)에 의해 제안된 농축 공정을 이용하는 표준 배양 프로토콜에 의해 총 54개의 원료 샘플(예컨대, 브로일러, 잘게 다진 고기, 난백 및 난황)을 살모넬라의 존재 여부를 조사하였다:

25g의 샘플을 225 ml의 멸균 스토마커 백에 놓고 손으로 15 - 20초 간 균질화시켰다. 백을 37 ±1℃에서 18 - 24시간 동안 인큐베이션 시켰다. 0.1ml를 취하여 RV 브로쓰 10 ml에 옮기고 42.5 ±0.2℃에서 20 - 24시간 동안 물 배쓰에서 인큐베이션시켰다. 농축된 RV 브로쓰로부터 한 루프 정도를 BGA 상에 스트리킹하였다. 한천 플레이트를 37 ±1℃에서 인큐베이션시켜 18 - 24시간 후에 검사하고 48시간 후에 재검토하였다. 각각의 플레이트로부터 4 내지 6개의 심증이 가는 콜로니들을 TSI, 아황산철 한천, 라이신 브로쓰, ONPG 브로쓰에 접종하고 마지막으로 다가 O- 및 H-혈청과의 응집에 의해 혈청학적으로 확인 하였다. 여전히 의심스러운 분리물들을 API-2OE 시스템을 이용하여 더 동정하였다.

54개의 샘플을 본 발명의 공정을 이용하여 유사하게 테스트하였다:

상술한 표준 배양법을 이용하여 25g의 샘플을 혼합 및 균질화시켰다. 날 제품을 노보바이오신 1.5 ㎍/ml이 보강된 RM 225 ml와 혼합 하였다. RM과 날 샘플을 물 배쓰 중에서 41.5 ±0.2℃에서 19-24시간 동안 인큐베이션시켰다. 샘플들을 MBN 중에서 3시간 동안 후-농축시키고 상기 실시예 3에 설명된 바와 같이 ELISA-1 기술을 이용하여 테스트하였다. RM으로부터 0.1 ml를 취하여 RV 브로쓰 10 ml에 옮기고 물 배쓰 중, 42.5 ±0.2℃에서 20 - 24시간 동안 인큐베이션시킴으로써 양성 샘플들을 확인하였다. RV 브로쓰로부터 한 루프를 BGA 상에 스트리킹 시키고 이를 37 ± 1℃에서 18 - 24시간 동안 인큐베이션시켰다. 의심이 가는 콜로니들(각 디쉬로부터 1 내지 3개가 형성됨)들을 TSI와 LIA에 접종시켜 다가 O- 및 H-혈청을 이용하여 혈청학적으로 확인하였다. 여전히 의심스러운 분리물들을 API-2OE 시스템을 이용함으로써 더욱 동정하였다. 상술한 공정으로 ELISA-1 양성 샘플을 확인할 수 없을 경우에는 선택적 농축 브로쓰로서 TTB를 이용하여살모넬라를 분리시킨다. RM으로부터, 1ml를 취하여 10ml TTB에 옳기고 42.5℃에서 18 - 24시간 동안 인큐베이션시킨 다음 BGA와 XLD 상에서 준배양시킨다. 의심이 가는 콜로니들을 상술한 바와 같이 시험하였다. 결과는 다음 표 9에 나타내었다:

표 9

따라서, 본 발명에 따른 조합법은 살모넬라를 검출하는데 있어서 표준 배양법만큼 민감하다. 본 발명에 따른 방법을 이용하여서는 거짓 양성이 관찰되지 않았는데, 이는 일차 선택적 농축법이 고도로 특이적임을 가리키는 것이다.

실시예 5

자연적으로 오염된 고기 및 뼈 가루 및 건조된 혈액 알부민에 있어서 M1법을 이용한살모넬라의 일차 선택적 농축 및 측정,

고기 및 뼈가루 샘플 45개와 건조된 혈액 알부민 샘플 15개의 총 60개의 샘플에 대해 다음과 같이살모넬라의 존재여부를 조사하였다:

M1:

각각의 샘플로부터 10g을 취하여 BPW 160 ml에 옮겼다. BPW와 샘플을 37℃에서 4시간 동안 인큐베이션시켰다. 이어서 온도를 41℃로 조정하고 15시간 동안 계속 인큐베이션시켰다. 각각의 농축 브로쓰로부터 0.5ml 씩을 채취하여 10ml의 MBN으로 옮기고 42℃에서 3시간 동안 인큐베이션시켰다. 이어서 MBN을 가열하고 끓는물에서 15분간 가열하고 ELISA-1 분석을 수행하기 전에 수돗물로 냉각시켰다. ELISA 양성 샘플들을 일차 농축 브로쓰 (BPW)로부터 0.1 ml를 취하여 10ml의 RV 브로쓰와 10ml의 TTB로 옮겨 확인하였다. RV와 TTB를 함유하는 튜브들을 43℃에서 20 - 24시간 동안 인큐베이션시켰다. RV와 TTB로부터 한 로프를 BGA 및 XLD 상에 스트리킹시키고 이를 37℃에서 18 - 24시간 동안 인큐베이션시켰다. 의심이가는 콜로니들을 TSI와 LIA에 접종시켜 다가 O- 및 H-혈청으로 혈청학적으로 확인하였다. 여전히 의심스러운 분리물들은 API-2OE 시스템을 이용하여 더욱 동정하였다.

또한, 스탠다드 배양 프로토콜을 이용함으로써 샘플들을 조사하였다:

스탠다드 프로토콜:

각 샘플로부터 10g을 취하여 160ml의 BPW에 옮기고 이를 37℃에서 18-24시간 동안 인큐베이션시켰다. 이어서 농축 브로쓰로부터 0.1 ml 및 1.0ml를 취하여 10ml의 RV 브로쓰와 1.0 내지 10ml의 TTB에 각각 옮겼다. RV와 TTB를 함유하는 튜브들을 43℃에서 20-24시간 동안 인큐베이션시켰다. RV 및 TTB로부터 한 루프를 BGA와 XLD 상에 스트리킹시켜 이를 37℃에서 18 - 24시간 인큐베이션시켰다. 의심이 가는 콜로니들을 TSI 및 LIA에 접종시켜 다가 O- 및 H-혈청을 이용하여 혈청학적으로 확인하였다. 여전히 의심스로운 분리물들을 API-20E 시스템을 이용하여 추가로 동정하였다.

결과를 표 10에 나타내었다.

표 10

상기 표로부터 명확히 드러나는 바와 같이, 가공된 제품의 조사된 샘플 중살모넬라를 검출하는데 있어서 M1 법이 스탠다드 배양 프로토콜보다 더 효과적이다. M1의 경우 거짓 양성이 관찰되지 않았다는 것은 주목할만한 일이다.

따라서, 온도 상승에 의해 도입된 선택성은 전통적인 평판 기술(즉, 확인 배양 프로토콜)을 사용할 때 뿐 아니라 ELISA 기술을 사용하는 경우에도살모넬라검출 능력을 개선시킨다.

실시예 6

실시예 5의 M1-법의 온도 의존성

일차 선택적 농축도 40℃ 및 42℃에서 수행하고, RV 대신 RVS를 42℃에서 사용하고 TTB역시 42℃에서 인큐베이션시킨 것을 제외하고, 실시예 5에서의 M1과 유사한 방식으로 63개의 가공된 식품 및 사료 샘플들을 테스트하였다.

테스트된 샘플 중 18개는살모넬라를 미리 분리시킨 사료였다. 데친 채소 샘플 9개, 코코아 샘플 7개, 애완동물 먹이 샘플 5개, 갑각류 샘플 4개, 조제된 음식 샘플 9개, 수프 샘플 9개 및 건조시킨 코코넛 샘플 2개로 이루어져 있는 나머지 45개의 샘플들은 미리 조사하지 않았다. 결과를 표 11에 나타내었다.

표 11

따라서 M1농축법은 40 - 42℃의 온도범위에서, 가공된 제품 중살모넬라를 검출하는 것과 관련하여서는 일관되게 효율적이다. 실시예 5에서와 같이, 거짓 양성은 관찰되지 않았다.

실시예 7

자연적으로 오염된 고기 및 뼈 가루 및 건조된 혈액 알부민에 있어서 M2 및 M3 법을 이용한살모넬라의 일차 선택적 농축 및 측정.

공급자가살모넬라에 의해 오염된 것으로 보고한 샘플 몇가지를 포함하여 총 89개의 사료 샘플을 다음과 같이살모넬라의 존재 여부에 대해 조사하였다:

M2:

각각의 샘플로부터 10g을 취하여 노보바이오신 2.5 ug/ml가 보강된 BPW 160 ml에 옮겨 37℃에서 4시간 동안 인큐베이션시켰다. 이어서 온도를 41℃로 조정하고 15시간 동안 계속 인큐베이션시켰다. 각각의 농축 브로쓰로부터 0.5ml 씩을 채취하여 10ml의 MX4로 옮기고 41℃에서 4시간 동안 인큐베이션시켰다. 이어서 MX4를 끓는 물에서 15분간 가열하고 ELISA-1 분석을 수행하기 전에 수돗물로 냉각시켰다. ELISA 양성 샘플들을 일차 농축 브로쓰 (BPW)로부터 0.1 ml를 취하여 10ml의 RV 브로쓰로 옮기고 1.0 ml를 10ml의 TTB로 옮겨 확인하였다. RVS와 TTB를 함유하는 튜브들을 각각 42℃와 43℃에서 20-24시간 동안 인큐베이션시켰다. RVS와 TTB로부터 한 루프를 BGA 및 XLD 상에 스트리킹시키고 이를 37℃에서 18-24시간 동안 인큐베이션시켰다. 의심이 가는 콜로니들을 TSI와 LIA에 접종시켜 다가 O- 및 H-혈청으로 혈청학적으로 확인하였다. 여전히 의심스러운 분리물들은 API-2OE 시스템을 이용하여 더욱 동정하였다.

M3:

인큐베이션 온도를 41℃ 대신 43℃로 상승시킨 것을 제외하고 동일한 샘플의 다른 뱃치에 대해 M2에서와 유사한 방식으로 테스트를 수행하였다.

마지막으로 샘플들을 표준 배양 프로토콜을 이용하여 조사하였다:

각각의 샘플로부터 10g을 취하여 BPW 160 ml에 옮기고 37℃에서 18-24시간 동안 인큐베이션시켰다. 이어서 농축 브로쓰 (BPW)로부터 0.1 ml 및 1.0 ml를 취하여 10ml의 RVS 브로쓰와 1.0 내지 10ml의 TTB로 각각옮겼다. RVS와 TTB를 함유하는 튜브들을 각각 42℃ 및 43℃에서 20-24시간 동안 인큐베이션시켰다. RVS와 TTB로부터 한 루프를 BGA 및 XLD 상에 스트리킹시키고 이를 37℃에서 18 - 24시간 동안 인큐베이션시켰다. 의심이 가는 콜로니들을 TSI와 LIA에 접종시켜 다가 O- 및 H-혈청으로 혈청학적으로 확인하였다. 여전히 의심스러운 분리물들은 API-20E 시스템을 이용하여 더욱 동정하였다.

결과를 표 12에 나타내었다:

표 12

방법 M2는 표준 프로토콜보다 50% 더 많은 샘플에서 살모렐라를 검출한다. 온도를 41℃(M2)가 아니라 43℃(M3)로 증가시킴으로써 양성 샘플의 수는 표준 프로토콜에 비교할 만한 수준으로 감소된다. 그러나, 2개의 거짓-양성 샘플들이 M2를 이용할 때 검출된 반면 M3의 경우에는 오직 1개의 거짓-양성만이 검출되었다. 따라서, 인큐베이션 온도를 증가시키면 선택성은 증가하나 민감도는 감소한다.

실시예 8

스파이크된 향신료 샘플에 있어서살모넬라의 일차 선택적 농축 및 검출.

총 향신료 샘플 8개 (후추, 카레, 파프리카, 겨자분말, 탄두리(tandoori))를 다음과 같이 조사하였다:

각각의 향신료-샘플 6.25g씩 두 부분을 2.5 ㎍/ml의 노보바이오신이 보강된 BPW 200ml를 각각 함유하는 두개의 플라스크로 옮겼다. 이 중 한 부분에 약 5 CFU(콜로니 형성 단위: colony forming units)의살모넬라 파나마(Salmonella panama)로 오염된 분유를 함유하는 캡슐을 넣었다 (캡슐은 National Institute of PublicHealth and Environmental Protection, Bildhoven, The Netherlands로부터 수득하였다). 모든 플라스크들을 37℃에서 4시간 인큐베이션시킨 후 인큐베이션은 41℃에서 15시간 계속하였다. 이어서 1 ml를 MBN 10ml에 옮기고 42℃에서 3시간 동안 인큐베이션시킨 다음 끓는 물에서 50분간 열처리하였다. 냉각 후 샘플들을 ELISA-1로 시험하였다. 일차 농축 브로쓰(BPW)로부터 0.1 ml를 취하여 10ml의 RVS 브로쓰로 옮김으로써 모든 샘플(ELISA-양성 및 음성)들을 검토하였다. 튜브들을 42℃에서 20-24시간 동안 인큐베이션시켰다. 한 루프를 BGA와 XLD 상에 스트리킹시켜 37℃에서 18 - 24시간 동안 인큐베이션시켰다. 의심이 가는 콜로니들을 TSI 및 LIA에 접종시켜 다가 O-혈청 및 H-혈청을 이용하여 혈청학적으로 확인하였다. 여전히 의심스러운 분리물들은 API-2OE 시스템을 이용하여 더욱 동정하였다.

결과를 다음 표 13에 나타내었다:

표 13

결론적으로, 이 방법은 8개의 스파이크된 향신료 샘플 중 7개에서살모넬라 파나마(Salmonella panama)를 검출한다. 나머지 향신료 샘플에서는 ELISA에 의해서도 확인 공정에 의해서도살모넬라를 검출할 수 없었다. 그러나, 이것이 곧 캡슐에살모넬라가 없다는 것을 가리키는 것이라고 생각할수 없다는 것은 아니다. 비-접종샘플 중 하나(12.5%)는 ELISA에 의해 거짓-양성 결과를 나타내었다.

참고문헌

Claims

1) pH 5.6 내지 9.3으로 완충시킨 살모넬라용 수성 성장 배지로 샘플을 이동시키고, 상기 이동 전 또는 이동과 동시, 또는 이동 후에 테트라티오네이트 및/또는 기타 셀레나이트와 다른 선택 물질을 배지에 첨가하거나 배지 중에 생산시켜, 얻어진 혼합물을 38℃ 이하의 온도에서 샘플 이동 후 10분 내지 8시간의 기간 동안 유지시킨 다음(예비-농축 기간), 혼합물의 온도를 39 - 43℃로 상승시켜 온도 상승 후의 기간 동안 이 혼합물을 상승된 온도인 39 - 43℃에서 유지시키고 (농축 기간), 여기서, 예비-농축 기간과 길이의 합은 8 내지 48 시간이며, 또는

2) pH 5.6 내지 9.3으로 완충시킨살모넬라용 수성 성장 배지로 샘플을 이동시키고, 이 성장 배지를 샘플과 함께 39-42.5℃에서 유지시킨 다음, 상기 이동 전 또는 이동과 동시, 또는 이동 후 8 시간 이내에 테트라티오네이트 및/또는 기타 셀레나이트와 다른 선택 물질을 배지에 첨가하거나 배지 중에 생산시켜, 상기 이동 후 10 내지 48 시간의 기간동안 얻어진 혼합물을 39 - 42.5℃의 온도에서 유지시키는 (농축 기간)

것 중 어느 하나로 이루어진 농축 공정, 및

이어서, 표적 분자의 동정 및/또는 정량화 또는 표적 분자와 관련된 분자 상호작용에 기초하며 전통적인 한천 평판 기술과는 다른 분석 단계로 이루어지는, 증식 후 농축 배지 중에 존재하는살모넬라를 동정 및/또는 정당화하기 위한 측정을 수행하는 것으로 되는, 샘플 중살모넬라속에 속하는 박테리아의 측정 방법으로서,

여기서, 농축 공정의 조건은

선택적 농축 배지에살모넬라균주를 출발 농도 약 15 세포/ml로 접종하고 10%의 무작위적으로 선택된 잘게 다진 날고기를 농축기간 개시 무렵 농축 배지에 첨가하여 결과적인 혼합물을 농축 기간의 온도로 유지시키는, 농축 공정 및 측정으로 이루어지는 테스트(테스트 1)에 의해, 무작위적으로 선택된살모넬라혈청형의 패널을 테스트할 경우, 모든 경우의 90% 이상에서 양성 결과가 나오도록 하고,

선택적 농축 배지에 농축 단계 개시 무렵 다음 비-살모넬라종, 즉,

시트로박터 프로인디이 (Citrobacter freundii),

에스케리치아 콜라이 (Escherichia coli), 및

엔테로박터 클로아카에 (Enterobacter cloacae)

중의 어느 한가지 균주를 출발 농도 약 100 세포/ml의 농도로 접종하고, 상기 접종된 비-살모넬라균주 외의 다른 미생물들은 상기 선택적 농축 배지 중에 존재하지 않도록 하여, 결과적인 혼합물을 농축기간의 온도에서 유지시키는, 농축 공정 및 측정으로 된 테스트 (테스트 2)에 의해 비-살모넬라종으로부터 무작위적으로 선택된 20개 균주의 패널을 테스트할 때 거짓 양성 백분율이 각 종의 15% 이내가 되도록,

측정단계에 적응시키는 것으로 되는, 샘플 중살모넬라속에 속하는 박테리아의 측정방법.

제 1 항에 있어서, 농축 기간 중 실질적인 기간 동안의 온도는 40 내지 42℃, 바람직하게는 40.5 내지 41.5℃ 범위인 방법.

제 1항 또는 2항에 있어서, 테트라티오네이트 및/또는 셀레나이트와 상이한 기타 선택 물질을 샘플 이동 후 4시간 이내, 예컨대 2시간 이내, 또는, 1시간 이내, 예컨대 10분 이내에 배지에 첨가하거나 배지 중에 생산시키는 방법.

제 1항에 있어서, 선택항목 2)에서, 샘플 이동 전, 이동과 동시 또는 이동 후에 배지에 첨가되거나 배지 중에 생산되는 유일한 선택 물질이 노보바이오신인 방법.

제 4항에 있어서, 결과적인 혼합물 중 노보바이오신의 농도가 ml 당 약 1 내지 100 ㎍, 예컨대 ml 당 약 1 -20 및 2 - 13 ㎍ 범위인 방법.

제 l항에 있어서, 선택항목 1)에서, 예비-농축 기간의 길이가 ½ - 7시간, 예컨대 1 - 6½ 시간, 2-6시간, 및 3-5시간, 바람직하게는 약 4시간인 방법.

제 1항에 있어서, 농축 기간과 측정 단계의 합의 길이가 56 시간 이하, 예컨대 48 시간, 40 시간, 34 시간, 32 시간, 28 시간, 24 시간, 22 시간 및 20 시간 이하인 방법.

제 1항에 있어서, 농축 기간의 길이, 또는 선택항목 1)과 관련하여, 예비-농축 기간과 농축 기간의 길이의 합이, 15-30 시간, 예컨대 17-24 시간인 방법.

pH 5.6 내지 9.3으로 완충시킨살모넬라용 수성 성장 배지로 샘플을 이동시키고, 상기 이동 전 또는 이동과 동시, 또는 이동 후 3 시간 이내에 테트라티오네이트를 배지에 첨가하거나 배지 중에 생산시켜, 얻어진 혼합물을 상기 샘플 이동 후 15-30 시간의 기간동안 얻어진 혼합물을 36 - 39℃의 온도에서 유지시키는 (농축 기간) 농축 공정 및,

이어서, 표적 분자의 동정 및/또는 정량화 또는 표적 분자와 관련된 분자 상호작용에 기초하며 본문에 기재된 전통적인 한천 평판 기술과는 다른 분석 단계로 이루어지는, 증식 후 농축 배지 중에 존재하는 살모넬라를 동정 및/또는 정량화하기 위한 측정을 7 시간 이하의 기간 동안 수행하는 것으로 되는, 샘플 중 살모넬라 속에 속하는 박테리아의 측정 방법으로서,

여기서, 농축 공정과 측정 단계의 길이의 합은 40 시간 이하이고, 농축 공정의 조건은 제 1항에서 정의된 테스트 1에 의해, 무작위적으로 선택된 살모넬라 혈청형의 페널을 테스트할 경우, 모든 경우의 90% 이상에서 양성 결과가 나오도록 하고, 제 1항에서 정의된 테스트 2에 의해, 비-살모넬라 종으로부터 무작위적으로 선택된 2O개 균주 패널을 테스트할 경우, 거짓 양성 백분율이 각 종의 15% 이내가 되도록, 측정단계에 적응시키는 것으로 되는, 샘플 중살모넬라속에 속하는 박테리아의 측정방법.

제9항에 있어서, 농축 기간과 측정 단계의 길이의 합이 34 시간 이하, 예컨대 32 시간, 28 시간, 24 시간, 22 시간, 및 20 시간 이하인 방법.

제 9항에 있어서, 농축 기간이 17-24 시간인 방법.

제 9항에 있어서, 실질적인 농축 기간 동안의 온도가 36 내지 39℃ 범위인 방법.

제9항에 있어서, 테트라티오네이트가 샘플 이동 후 1시간 이내, 예컨대 5분 이내에 배지에 첨가되거나 또는 배지 중에 생산되는 방법.

제 9항에 있어서, 잘게 다진 고기 샘플 100개를 테스트할 경우 측정 결과가(테스트3: 여기서, 테스트 될 샘플의 중량은 25g이고, 100개의 샘플은 각각 10개의 상이한 샘플들을 전달하는 10가지 상이한 소매제품으로부터 제공되고, 샘플 중 2O개에는 샘플 당살모넬라 타이피뮤리움(Salmonella typhimurium)세포가 15개 접종되어 있고 샘플중 다른 20개에는 샘플 당살모넬라 엔테리티티스(Salmonella enterititis)세포가 약 15개 접종되어 있음) 스텐다드 프로토콜과 비교할 때 참 양성 결과를 80% 이상 결과시키고, 거짓 양성 결과를 10% 이하로 결과시키는 방식으로, Merck 7700 Rappaport-Vassiliadis 브로쓰 (RV) 대신 Oxoid CM 866 Rappaport-Vassiliadis 브로쓰 (RVS)를 사용하고, RVS를 42℃에서 인큐베이션하고, Gibco 152-05600/Oxoid CM 469 자일로서 라이신 데속시콜레이트 한천 (XLD) 역시 평판 배지로서 사용하는 것을 제외한, 스탠다드 프로토콜 NMKL no. 71 (Nordic Committee on Food Analysis method no. 71, 1991, 제 4판, 17쇄)을 표준으로 하여 보정되는 것이 특징인 방법.

제 9항에 있어서, 샘플이 가공된 제품과 상이한 것이 특징인 방법.

제 l4항 또는 15항에 있어서, 측정이 테스트 3의 스탠다드 프로토콜과 비교하여 85% 이상 참 양성 결과, 예컨대 90% 이상, 92% 이상, 95% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 및 100% 이상 참 양성 결과를 결과시키는 것이 특징인 방법.

제 16항에 있어서, 측정이 테스트 3에서 스텐다드 프로토콜과 비교하여 101% 이상 참 양성 결과를 결과시키는 방법.

제 14항에 있어서, 측정이 테스트 3에서 거짓 양성 결과를 8% 이하, 예컨대 5% 이하, 3% 이하, 2% 이하, 및 1% 이하의 거짓 양성 결과를 결과시키는 방법.

제 18항에 있어서, 측정에 의한 테스트 3에서의 거짓 양성 결과가 0인 방법.

제 9항에 있어서, 테스트 1의 모든 경우에 있어서, 측정이 92% 이상의 참 양성 결과, 예컨대 95% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 99.5% 이상 및 99.9% 이상의 참 양성 결과를 결과시키는 방법.

제 9항에 있어서, 테스트 2의 모든 경우에 있어서, 측정이 12% 이상의 거짓 양성 결과, 예컨대 10% 이하, 7% 이하, 5% 이하, 3% 이하, 2% 이하, 1% 이하 및 ½ % 이하의 거짓 양성 결과를 결과시키는 방법.

제 9항에 있어서, 얻어진 혼합물 중의 테트라티오네이트의 농도가 5-40 mM, 예컨대 7-35 mM, 9-30 mM, 11-28 mM, 13-26 mM, 14-25mM, 15-23mM, 16-22mM, 17-21mM, 및 18-20mM의 범위인 방법.

a) pH 5.6 내지 9.3으로 완충되고, 박테리아 성장-저해 물질을 실제로 함유하지 않는, 살모넬라용 수성 성장 배지로 샘플을 이동시키고, 얻어진 혼합물을 39.0℃ 이하의 온도에서 1분 이상 유지시킨 다음 (예비-농축 기간),

혼합물의 온도를 39.5 - 43℃로 상승시키고 노보바이오신 및/또는 셀레나이트와 상이한 기타 선택 물질을 임의로 첨가하여

이 혼합물을 상승된 온도인 39.5-43℃에서 온도 상승 후의 기간 동안 유지시키거나(예비 농축 기간), 또는

b) pH 5.6 내지 9.3으로 완충시킨살모넬라용 수성 성장 배지로 샘플을 이동시키고, 상기 이동 전 또는 이동과 동시, 또는 이동 후에 테트라티오네이트 및/또는 기타 셀레나이트와 다른 선택 물질을 배지에 첨가하여, 얻어진 혼합물을 상기 샘플 이동 후 또는 노보바이오신이나 기타 셀레나이트와 다른 선택 물질의 첨가 시점부터의 기간 중 더 오랜 기간동안 적어도 ½ 시간 동안, 39.0℃의 온도에서 유지시킨 다음, (예비 농축기간)

상기 혼합물의 온도를 39.5-43℃로 증가시키고 노보바이모신 또는 셀레나이트와 다른 기타 선택 물질을 임의로 첨가하여,

이 혼합물을 상승된 온도인 39.5-43℃에서 온도 상승 후의 기간 동안 유지시키는 (선택적 예비 농축 기간)

것 중 어느 하나로 이루어진 농축 공정, 및

이어서, 증식 후 농축 배지 중에 존재하는살모넬라를 동정 및/또는 정량화하기 위한 측정을 수행하는 것으로서, 예비-농축 기간과 선택적 농축 기간의 길이의 합이 10-48 시간이 되는, 샘플 중살모넬라속에 속하는 박테리아의 측정 방법.

제 23항에 있어서, 예비-농축 기간의 길이가 ½ 시간 이상, 예컨대, 1-10 시간, 1-8 시간, 2-6 시간, 3-5 시간, 및 3½- 4½ 시간이고 바람직하게는 약 4시간인 방법.

제 23항에 있어서, 농축 공정 기간과 측정 단계 기간의 합이 56 시간 이하,예컨대 48 시간 이하, 40 시간 이하, 34 시간 이하, 32 시간 이하, 28 시간 이하, 24 시간 이하, 22 시간 이하, 및 20 시간 이하인 방법.

제23항에 있어서, 예비-농축 기간과 선택적 농축 기나의 합이 15-30시간, 예컨대 17-24 시간인 방법.

pH 5.6 내지 9.3으로 완충시킨살모넬라용 수성 성장 배지로 샘플을 이동시키고, 상기 이동 전 또는 이동과 동시, 또는 이동 후에 노보바이오신을 배지에 첨가하여, 얻어진 혼합물을 상기 샘플 이동 후 또는 노보바이오신이나 기타 셀레나이트와 다른 임의 선택 물질의 첨가 시점 부터의 기간 중 더 오랜 기간동안 적어도 15-30시간 동안 39.0℃의 온도에서 유지시킨 다음(농축 기간),

이어서, 증식 후 농축 배지 중에 존재하는살모넬라를 동정 및/또는 정량화하기 위한 측정을 7시간 이하 동안 수행하며,

농축 기간과 측정 단계의 길이의 합은 40 시간 이하인 것으로 되는, 샘플 중살모넬라속에 속하는 박테리아의 측정 방법.

제 27항에 있어서, 농축 단계와 측정 단계의 길이의 합이 32 시간 이하, 예컨대 28 시간, 24 시간, 22 시간, 및 20 시간 이하인 방법.

제 27항 또는 28항에 있어서, 농축 기간이 17-24 시간인 방법.

제27항에 있어서, 측정이 표적 분자의 동정 및/또는 정량화 또는 표적 분자가 관여하는 분자 상호작용에 기초한 것으로서, 한천 평판법과 상이한 분석 단계로 이루어지는 방법.

제 27항에 있어서, 농축 공정의 조건이

- 수성 성장 배지에 열-처리된살모넬라균주 세포를 출발 농도 약 열-처리된 세포 1000개/ml로 접종하고, 농축 공정 개시 무렵 배지에 5% 비-유지방 건조 밀크를 첨가하는, 농축 공정 및 측정으로 이루어지는 테스트 (테스트4)에 의해, 무작위적으로 선택된살모넬라혈청형의 패널을 테스트할 경우, 모든 경우의 90% 이상에서 양성 결과가 나오도록 하고,

- 수성 성장 배지에 농축 공정 개시 무렵 다음 비-살모넬라종, 즉,

시트로박터 프로인디이 (Citrobacter freundii),

에스케리치아 콜라이 (Escherichia coli),및

엔테로박터 클로아카에 (Enterobacter cloacas)

중의 어느 한가지 균주를 출발 농도 약 100 세포/ml의 농도로 접종하는, 농축 공정 및 측정으로 된 테스트 (테스트5)에 의해 비-살모넬라종으로부터 무작위적으로 선택된 20개 균주의 패널을 테스트할 때 거짓 양성 백분율이 각 종의 25% 이내가 되도록, 측정단계에 적응시키는 것으로 되는 방법.

제 27항에 있어서, 뱃치 및 종류별로 무작위적으로 선택된 5Og의 분유 샘플 총 5O개를 테스트할 경우(테스트6), 스탠다드 프로토콜에 비해 80% 이상의 참 양성 결과가 나오도록 하고, 거짓-양성 결과는 10% 이하가 나오도록 하는 방식으로, 스탠다드 배양 프로토콜 NMKL no. 71 (Nordic Committee on Food Analysis method no. 71, 1991)을 기준으로 보정되는 방법으로서, 여기서, 상기 각 샘플은 25g씩의 두 부분로 나뉘며, 각 부분은 청구범위 21 - 25항 중 어느 한 항에 따른 방법으로, 다른 부분은 스탠다드 배양 프로토콜로 처리되고, 25g 부분의 50 세트 중 25 세트는 다음과 같은 방식으로 스파이크되고:

- 스탠다드 배양 프로토콜로 처리된 25g의 한 부분은 프로토콜의 농축 공정 개시 무렵, 약 5 CFU의살모넬라파나마(Salmonella panama) 또는살모넬라 타이피뮤리움(Salmonella typhimurium)을 함유하는 비-유지방 건조 밀크 0.1 - 1g을 프로토콜에 사용된 수성 성장 배지에 첨가함으로써 보강되고,

- 본 발명의 특허청구 범위 제 21항 내지 25항 중 어느 한 항에 따른 방법으로 처리된 25g의 다른 부분은 농축 공정의 개시 무렵, 약 5 CFU의살모넬라 파나마(Salmonella panama)또는 살모넬라타이피뮤리움(Salmonella typhimurium)을 함유하는 비-유지방 건조 밀크 0.1 - 1g을 수성 성장 배지에 첨가함으로써 보강되는 방법.

제 32항에 있어서, 테스트 6의 스탠다드 프로토콜에 비해 측정 결과, 85% 이상, 예컨대 90%, 92%, 95%, 97%, 98%, 99% 및 100%의 참 양성 결과가 얻어지는 방법.

제 33항에 있어서, 테스트 6의 스탠다드 프로토콜에 비해 측정 결과, 101% 이상의 참 양성 결과가 얻어지는 방법.

제 32항에 있어서, 테스트 6의 스탠다드 프로토콜에 비해 측정 결과, 거짓 양성 결과가 8% 이하, 예컨대 5%, 3%, 2% 및 1%로 얻어지는 방법.

제 35항에 있어서, 테스트 6의 측정에 의한 거짓 양성 결과가 0인 방법.

제 27항에 있어서, 측정 결과가 테스트 4의 모든 경우에 있어서 92% 이상의 참 양성 결과, 예컨대 95%, 97%, 98%, 99%, 99.5% 및 99.9%의 참 양성 결과가 얻어지는 방법.

제 27항에 있어서, 측정 결과, 테스트 5에서 거짓 양성 결과가 20% 이하, 예컨대 15%, 10%, 6%, 3%, 2%, 1%, ½ %로 얻어지는 방법.

제 27항에 있어서, 샘플이 가공 제품인 방법.

제 27항에 있어서, 측정 단계가 면역학적 반응을 포함하는 방법.

제 40항에 있어서,

면역 분석, 예컨대, 라디오 면역 분석 (RIA: Radio Immune Assay (RIA), 효소 면역 분석 (EIA: Enzyme Immune Assay), 효소 결합 면역 흡착 분석 (ELISA: Enzyme Linked Immune Sorbent Assay), 형광 항체 기술 (FA: Fluorescence Antibody technique), 및 검출상 중 리포좀, 미셀 또는 리포좀-유사입자를 이용하는 것으로 되는 면역 분석;

면역 고정화를 이용한 분석;

라텍스 응집과 같은 면역 응집을 이용한 분석;

DNA/DNA-하이브리다이제이션 분석;

RNA/RNA-하이브리다이제이션 분석: 및

DNA/RNA-하이브리다이제이선 분석

중에서 선택되는 분석을 포함하는 방법.

제 l항에 있어서, 측정 단계가 폴리머레이즈 연쇄 반응 (PCR: Polymerase chain reaction)을 포함하는 방법.

제 l항에 있어서, 측정 단계가 펩티드 핵산 (PNA: peptide nucleic acids)을 사용하는 방법.

제 1항에 있어서, 측정 단계가 렉틴을 사용하는 방법.

제 l항에 있어서, 측정 단계가 박테리오파지 Felix 01과 같은 박테리오파지를 사용하는 방법.

제 1항에 있어서, 측정 단계가살모넬라를 함유하는 배지의 전기 저항 또는 임피던스를 변화시키는 결과를 야기시키는,살모넬라에 의한 어떤 물질의 대사적 전환으로 이루어지고살모넬라의 검출은 이 변화를 측정하는 것에 의해 완수되는 방법.

제 1항에 있어서, 측정 단계가살모넬라가 한천 매트릭스 상 또는 한천 매트릭스를 통하여 이동하는 능력을 분석하는 것으로 되는 방법.

제 1항에 있어서, 측정 단계가 소수성 그리드 막 필터법 (HGMF: hydrophobic grid membrane filter method)을 이용하는 분석과 같이, 박테리아를 배지로부터 분리하여 필터 상에서 유지시키는, 여과 단계를 포함하는 분석을 포함하는 방법.

제 1항에 있어서, 측정 단계가 방사능측정법을 이용하는 분석으로 된 방법.

제 1항에 있어서, 측정 단계가 크로마토그래피 분리를 이용하는 분석으로 된방법.

제 1항에 있어서, 측정 단계가 선택적 후-농축을 이용하는 방법.

제 5l항에 있어서, 선택적 후-농축 기간이 2-6 시간, 예컨대 2.0-4.5 시간, 2.5-3.5 시간, 바람직하게는 약 3 시간인 방법.

제 1항에 있어서,살모넬라용 수성 성장 배지가 최대 0.5%w/v 소듐 하이드로겐 셀레나이트 용액, 바람직하게는 셀레나이트 농도가 0% w/v에 해당하는 농도로 셀레나이트를 갖는 방법.

제 9항에 있어서, 측정 단계가 폴리머레이즈 연쇄 반응 (PCR)을 포함하는 방법.

제 9항에있어서, 측정 단계가 펩티드 핵산(PNA)을 사용하는 방법.

제 9항에 있어서, 측정 단계가 렉틴을 사용하는 방법.

제 9항에 있어서, 측정 단계가 박테리오파지 Felix 01과 같은 박테리오파지를 사용하는 방법.

제 9항에 있어서, 측정 단계가살모넬라를 함유하는 배지의 전기 저항 또는 임피던스를 변화시키는 결과를 야기시키는,살모넬라에 의한 어떤 물질의 대사적 전환으로 이루어지고살모넬라의 검출은 이 변화를 측정하는 것에 의해 완수되는 방법.

제 9항에 있어서, 측정 단계가살모넬라가 한천 매트릭스 상 또는 한천 매트릭스를 통하여 이동하는 능력을 분석하는 것으로 되는 방법.

제 9항에 있어서, 측정 단계가 소수성 그리드 막 필터법 (HGMF: hydrophobic grid membrane filter method)을 이용하는 분석과 같이, 박테리아를 배지로부터 분리하여 필터 상에서 유지시키는, 여과 단계를 포함하는 분석을 포함하는 방법.

제9항에 있어서, 측정 단계가 방사능 측정법을 이용하는 분석으로 된 방법.

제 9항에 있어서, 측정 단계가 크로마토그래피 분리를 이용하는 분석으로 된 방법.

제 9항에 있어서, 측정 단계가 선택적 후-농축을 이용하는 방법.

제 63항에 있어서, 선택적 후-농축 기간이 2-6 시간, 예컨대 2.0-4.5 시간, 2.5-3.5 시간, 바람직하게는 약 3 시간인 방법.

제 9항에 있어서,살모넬라용 수성 성장 배지가 최대 0.5%w/v 소듐 하이드로겐 셀레나이트 용액, 바람직하게는 셀레나이트 농도가 0% w/v에 해당하는 농도로 셀레나이트를 갖는 방법.

제 23항에 있어서, 측정 단계가 폴리머레이즈 연쇄 반응 (PCR)을 포함하는 방법.

제23항에있어서, 측정 단계가 펩티드 핵산(PNA)을 사용하는 방법.

제 23항에 있어서, 측정 단계가 렉틴을 사용하는 방법.

제23항에 있어서, 측정 단계가 박테리오파지 Felix 01과 같은 박테리오파지를 사용하는 방법.

제 23항에 있어서, 측정 단계가살모넬라를 함유하는 배지의 전기 저항 또는 임피던스를 변화시키는 결과를 야기시키는,살모넬라에 의한 어떤 물질의 대사적 전환으로 이루어지고살모넬라의 검출은 이 변화를 측정하는 것에 의해 완수되는방법.

제 23항에 있어서, 측정 단계가살모넬라가 한천 매트릭스 상 또는 한천 매트릭스를 통하여 이동하는 능력을 분석하는 것으로 되는 방법.

제 23항에 있어서, 측정 단계가 소수성 그리드 막 필터법 (HGMF: hydrophobic grid membrane filter method)을 이용하는 분석과 같이, 박테리아를 배지로부터 분리하여 필터 상에서 유지시키는, 여과 단계를 포함하는 분석을 포함하는 방법.

제 23항에 있어서, 측정 단계가 방사능 측정법을 이용하는 분석으로 된 방법.

제 23항에 있어서, 측정 단계가 크로마토그래피 분리를 이용하는 분석으로 된 방법.

제 23항에 있어서, 측정 단계가 선택적 후-농축을 이용하는 방법.

제 75항에 있어서, 선택적 후-농축 기간이 2-6 시간, 예컨대 2.0-4.5 시간, 2.5-3.5 시간, 바람직하게는 약 3 시간인 방법.

제23항에 있어서,살모넬라용 수성 성장 배지가 최대 0.5%w/v 소듐 하이드로겐 셀레나이트 용액, 바람직하게는 셀레나이트 농도가 0% w/v에 해당하는 농도로 셀레나이트를 갖는 방법.

제 27항에 있어서, 측정 단계가 폴리머레이즈 연쇄 반응 (PCR)을 포함하는 방법.

제 27항에 있어서, 측정 단계가 펩티드 핵산(PNA)을 사용하는 방법.

제 27항에 있어서, 측정 단계가 렉틴을 사용하는 방법.

제 27항에 있어서, 측정 단계가 박테리오파지 Felix 01과 같은 박테리오파지를 사용하는 방법.

제 27항에 있어서, 측정 단계가살모넬라를 함유하는 배지의 전기 저항 또는 임피던스를 변화시키는 결과를 야기시키는,살모넬라에 의한 어떤 물질의 대사적 전환으로 이루어지고살모넬라의 검출은 이 변화를 측정하는 것에 의해 완수되는 방법.

제 27항에 있어서, 측정 단계가살모넬라가 한천 매트릭스 상 또는 한천 매트릭스를 통하여 이동하는 능력을 분석하는 것으로 되는 방법.

제 27항에 있어서, 측정 단계가 소수성 그리드 막 필터법 (HGMF: hydrophobic grid membrane filter method)을 이용하는 분석과 같이, 박테리아를 배지로부터 분리하여 필터 상에서 유지시키는, 여과 단계를 포함하는 분석을 포함하는 방법.

제 27항에 있어서, 측정 단계가 방사능측정법을 이용하는 분석으로 된 방법.

제27항에 있어서, 측정 단계가 크로마토그래피 분리를 이용하는 분석으로 된 방법.

제 27항에 있어서, 측정 단계가 선택적 후-농축을 이용하는 방법.

제 87항에 있어서, 선택적 후-농축 기간이 2-6 시간, 예컨대 2.0-4.5 시간, 2.5-3.5 시간, 바람직하게는 약 3 시간인 방법.

제27항에 있어서,살모넬라용 수성 성장 배지가 최대 0.5%w/v 소듐 하이드로겐 셀레나이트 용액, 바람직하게는 셀레나이트 농도가 0% w/v에 해당하는 농도로셀레나이트를 갖는 방법.