KR101701064B1 - 2차 증균과정 생략이 가능한 살모넬라균 단일증균배지 조성물, 그 제조방법 및 그 용도 - Google Patents

2차 증균과정 생략이 가능한 살모넬라균 단일증균배지 조성물, 그 제조방법 및 그 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 크로모제닉 고체배지의 이용 없이도 2차 증균과정 생략이 가능한 살모넬라균 단일 증균 배지 조성물, 그 제조방법 및 그 용도에 관한 것으로, 증균과정을 하루 이내로 단축시키기 위해 개발된 본 발명의 배지는 기존의 2단계 증균법을 대체하여 사용될 수 있다.

Description

2차 증균과정 생략이 가능한 살모넬라균 단일증균배지 조성물, 그 제조방법 및 그 용도{A Salmonella Single Enrichment Medium composition, a method thereof and use of the same}
본 발명은 크로모제닉 고체배지의 이용 없이도 2차 증균과정 생략이 가능한 살모넬라균 단일 증균 배지 조성물, 그 제조방법 및 그 용도에 관한 것이다.
Salmonella spp.로 인한 식중독 사고는 전세계적으로 발생되고 있으며, 미국의 경우 Salmoenlla에 의한 식중독 사고가 매년 약 120만건 발생하고 약 380명이 이 질병으로 인해 사망하는 것으로 보고된다.
일반적으로 식품 내Salmonella의 오염도는 낮은 수준이나, 매우 적은 수의 세균으로도 치명적인 질병을 일으킬 수 있기 때문에 국내외 공인검출법 기준으로 식품 내 Salmonella 검출은 2단계 증균 과정을 통해 균의 회복 (1차 증균) 및 선택적 증균 (2차 증균)이 이루어진다. 그러나, 이러한 방법은 증균에만 2일이 소모되어 개선이 필요한 실정이다. 이에 따라 단일 증균 배지를 개발하여 증균시간을 1일이내로 단축시키는 연구가 이루어져 왔으나, 대부분 단일 증균시 발생하는 선택성의 저하를 크로모제닉 고체 배지와의 결합을 통해 해결하였다. 하지만 크로모제닉 배지는 일반 선택 배지에 비해 단가가 높아 일반 실험실에서 지속적으로 사용하기에 어려운 점이 있다.
[선행 특허 문헌]
대한민국 특허 공개번호 제10-2015-0114313호
본 발명은 상기의 문제점을 해결하고 상기의 필요성에 의하여 안출된 것으로서 본 발명의 목적은 Salmonella 성장에 유리한 환경을 제공하여 경쟁균에 억제되지 않고 증균될 수 있도록 하고 균의 회복을 위해 항생제 사용량을 최소화하는 방식으로 단일 증균배지를 개발하는 것이다.
상기의 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 제1인산 칼륨(Potassium phosphate monobasic), 제2인산 나트륨 이수화물(Sodium phosphate dibasic dihydrate), 염화 나트륨, D-만니톨(mannitol), 효모 추출물, 3' 3'-티오디프로피온산(thiodipropionic acid), 피루브산 나트륨(Sodium pyruvate), 구연산 나트륨 및 노보비오신(Novobiocin)을 유효성분으로 포함하는 살모넬라균 단일 증균 배지 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 조성물은 액체 1리터당 상기 D-만니톨은 1-10g, 상기 효모 추출물은 1-10g, 상기 3, 3'-티오디프로피온산은 0.5-5g, 상기 피루브산 나트륨은 0.5-5g, 상기 구연산 나트륨은 1-25g 포함되는 것이 바람직하고, 상기 조성물은 액체 1리터당 상기 D-만니톨은 5g, 상기 효모 추출물은 6g, 상기 3' 3'-티오디프로피온산은 1g, 상기 피루브산 나트륨은 2g, 상기 구연산 나트륨은 10g 포함되는 것이 더욱 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.
본 발명의 다른 구현예에 있어서, 상기 조성물은 액체 1리터당 상기 노보비오신은 0.001-0.02g 포함되는 것이 바람직하고, 상기 조성물은 액체 1리터당 상기 노보비오신은 0.001-0.005g 포함되는 것이 더욱 바람직하며, 본 발명의 실시예에 서, 상기 조성물은 액체 1리터당 상기 노보비오신은 0.005g 포함되는 것을 특징으로 한다.
또 본 발명은 액체에 제1인산 칼륨(Potassium phosphate monobasic), 제2인산 나트륨 이수화물(Sodium phosphate dibasic dihydrate), 염화 나트륨, D-만니톨(mannitol), 효모 추출물, 3, 3'-티오디프로피온산(thiodipropionic acid), 피루브산 나트륨(Sodium pyruvate), 구연산 나트륨 및 노보비오신(Novobiocin)를 혼합하는 단계를 포함하는 살모넬라균 단일 증균 배지 조성물 제조 방법을 제공한다.
또 본 발명은 상기 본 발명의 배지 조성물에 샘플 유래 검체를 처리하고 배양하여 샘플 유래 검체에서 살모넬라 균을 검출하는 방법을 제공한다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 샘플은 야채, 육류, 또는 유제품인 것이 바람직하고, 상기 샘플은 양상추인 것이 더욱 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.
본 발명의 다른 구현예에 있어서, 상기 살모넬라 균은 Salmonella Enteritiids인 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.
본 발명의 또 다른 구현예에 있어서, 상기 방법은 2차 증균 과정이 생략 가능한 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.
이하 본 발명을 설명한다.
본 발명에서는 Salmonella 성장에 유리한 환경을 제공하여 경쟁균에 억제되지 않고 증균될 수 있도록 Salmonella의 회복에 효과가 있는 것으로 알려진 물질들을 다양하게 첨가하고 균의 회복을 위해 항생제 사용량을 최소화하는 방식으로 단일 증균배지를 개발하였다.
개발된 증균배지의 성능을 Buffered peptone water (BPW) 및 Rappaport-Vassiliadis Soy broth (RVS)를 이용한 2단계 증균, 상업화된 단일증균배지인 Oxoid사의 ONE broth Salmonella (OBS)와의 비교를 통해 검증하였다.
일반선택지에서의 효과를 비교하기 위해 크로모제닉 배지 대신 Xylose-lysine-deoxycholate agar (XLD)를 이용하였다. 개발된 배지의 명칭은 SSE-1 (Salmonella Single Enrichment broth-1)으로 아래에서 칭한다.
본 발명을 통하여 알 수 있는 바와 같이 본 발명은 크로모제닉 고체배지의 이용 없이도 2차 증균 과정 생략이 가능한 살모넬라균 단일 증균 배지를 개발하였으며, 증균과정을 하루 이내로 단축시키기 위해 개발된 본 발명의 배지는 기존의 2단계 증균법을 대체하여 사용될 수 있다.
이하 비한정적인 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다. 단 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 의도로 기재된 것으로서 본 발명의 범위는 하기 실시예에 의하여 제한되는 것으로 해석되지 아니한다.
실시예 1: 배지의 제조
함께 비교할 2단계 증균을 위한 BPW와 RVS및 OBS는 제조자의 매뉴얼대로 준비되었으며, 본 발명의 SSE-1은 기존 BPW 성분 중 peptone을 제외한 buffer 성분을 기반으로 만들어졌다. OBS 및 SSE-1 두 단일 증균배지의 성분은 아래 표와 같다.
본 발명의 배지 제조방법은 멸균 증류수에 베이스 성분을 넣고 열을 가하여 균질화하고, 121℃에서 15분간 멸균 (autoclave)한 후, 50℃ 이하로 식힌 후 novobiocin 첨가하고 균질화하였다.
OBS SSE-1
용매 멸균 증류수 1L 멸균 증류수 1L
베이스 성분 -ONE broth Salmonella base(peptone 5g, yeast extract 5g, Salt buffer mix 10g, Growth promotor mix 10g) 25g (OXOID) - Potassium phosphate monobasic 1.5g (sigma)
- Sodium phosphate dibasic dihydrate 3.5g (sigma)
- Sodium chloride 5.0g (sigma)
- D-mannitol 1-10g (sigma)
- Yeast Extract 1-10g (sigma)
- 3'3'-thiodipropionic acid 0.5-5g (sigma)
- Sodium pyruvate 0.5-5g (sigma)
- Sodium citrate 1-25g (sigma)
선택첨가제 -Novobiocin 12 mg (OXOID) - Novobiocin 0.001-0.02g (OXOID)
표 1은 실험에 사용된 두 단일 증균배지의 성분 비교한 표
본 발명의 실시예에서 사용된 각 성분의 구체적인 양은 아래 표와 같다.
Source 성분 농도 (g/L)
Buffer
(BPW와 동일)		 Potassium phosphate monobasic 1.5
Sodium phosphate dibasic dihydrate 3.5
Sodium chloride 5.0
Growth promoters D-mannitol 5.0
Yeast extract 6.0
Antioxidants 3'3'-thiodipropionic acid 1.0
Sodium pyruvate 2.0
Inhibitors Sodium citrate 10.0
Novobiocin 0.005
본 발명에 사용된 Novobiocin 농도 최적화 실험 결과는 다음과 같다.
Novobiocin 농도 (mg/L)
0 2.5 5 7.5 10 12
(OBS와 동일)
S. Heidberg + + + + + +
S. Infantis + + + - - -
S. Agona + + + + - -
S. Typhimurium + + + + + -
S. Ohio + + + + - -
S. Montevideo + + + - - -
S. Hartford + + + - - -
S. Enteritidis + + + + + +
S. Newport + + + - - -
실시예 2:다양한 Salmonella 혈청형에 대한 순수배양액에서의 단일증균배지의 검증
실제 야채샘플에서 개발된 배지를 검증하기 전 순수배양액에서 먼저 검증을 해보았다. 실험과정은 다음과 같다. 세 가지 증균배지 (BPW, OBS, SSE-1) 10mL에 20 CFU 이하의 낮은 수의 Salmonella 균을 접종하여 37℃(BPW) 또는 42℃(OBS, SSE-1)에서 24시간 증균 시킨다. 탁도를 확인하여 균의 성장여부를 확인하였다.
실시예 3: 야채(양상추)에서의 단일증균배지의 검증실험
개발된 배지를 이용하여 실제 양상추 샘플에서 그 검출감도를 확인해 보았다. Salmonella 검출률이 가장 높은 식품은 닭고기 등의 가금육으로 알려져 있으나, 식중독사고는 가열 처리를 하지 않는 신선야채류에서 더 많이 발생하기 때문에,
본 실험에서는 시중에 유통되는 신선 편의 식품 중 양상추를 구매하여 사용하였다. 일반적으로 양상추에서 Salmonella는 거의 검출되지 않기 때문에, 다양한 Salmonella 혈청형 중 가장 많은 식중독을 유발하는 Salmonella Enteritiids 균주의 인위접종실험을 통해 검증하였으며, 증균 후 검출을 위한 선택배지는 미국 FDA, ISO 및 국내 KFDA에서 공인검출배지로 사용중인 XLD 배지를 사용하였다. S. Enteritidis 균주는 미국 FDA에서 제공받았으며, nalidixic acid 및 novobiocin 내성을 강화시킨 균주로 샘플 내 오염을 통해 나타날 수 있는 위양성 결과를 배제하기 위해 사용되었다. 샘플의 준비 및 검출 프로토콜은 아래와 같다.
하루 동안 증균된 S. Enteritidis을 PBS로 10진 희석하여 ml당 0log 및 1log CFU 수준으로 존재하게 만든다. 양상추 25g에 농도별로 1ml 씩 접종하고 실제 보관상황을 시뮬레이션하기 위해 7℃에서 하루 보관한다. 각 증균배지 (BPW, OBS, SSE-1)을 225ml씩 분주하고 1분간 균질화시킨다. 이후 37℃(BPW) 또는 42℃(OBS, SSE-1)에서 18시간 이상 증균시킨다. BPW로 증균한 샘플의 경우 0.1ml를 취하여 RVS 10ml에 넣고 42℃에서 하루 더 배양한다. 세가지 방법으로 배양된 각각의 증균액들을 백금이로 취하여 XLD에 획선도말하고 37℃에서 24시간 배양한다. 배양이 끝난 후 검정센터를 가진 빨간 집락을 나타내는 Salmonella 의심집락을 백금이로 취하여 nalidixic acid 200ppm, novobiocin 50ppm을 포함하는 XLD 배지에 획선도말하고 37℃에서 24시간 배양하여 접종한 균주여부를 확인한다.
상기 실시예의 통계처리를 위해 SPSS (version 19.0, SPSS Inc., Chicago, IL, USA)를 사용하였다. 각각의 증균배지에서 회복된 균 수의 차이는 t-test를 통해 검정되었다. 야채샘플에서의 검출력 비교는 Fisher's exact test를 통해 검정되었다. P value를 측정하여 값이 0.05보다 적으면 유의차가 있는 것으로 판단하였다.
상기 실시예의 결과는 아래 표에 제시되어 있다.
BPW 사용시 SSE-1 사용시 OBS 사용시
S. Heidberg + + +
S. Infantis + + +
S. Agona + + +
S. Typhimurium + + +
S. Ohio + + +
S. Montevideo + + +
S. Hartford + + +
S. Enteritidis + + +
S. Newport + + +
표 4는 다양한 Salmonella 혈청형을 이용한 세 가지 증균배지의 증균력 확인 결과
상기 결과에서 알 수 있는 바와 같이, 본 발명에서 개발된 SSE-1를 포함한 모든 증균배지에서 다양한 9종류의 Salmonella 혈청형 모두 억제되지 않고 성공적으로 배양되었다. 따라서 SSE-1은 Salmonella 검출을 위한 증균배지로 적합한 것으로 보인다.
또한 아래 표에서 알 수 있는 바와 같이,
2단계 증균 사용시
(BPW-RVS)		 SSE-1사용시 OBS 사용시
양성
검출수		 접종량:
101 CFU/25g		 12/12 11/12 7/12
접종량:
100 CFU/25g		 9/12 8/12 1/12
합계* 21/24 A 19/24 A 8/24 B
표 5는 세 가지 증균법의 검출력을 비교한 표이다.
* 서로 다른 알파벳은 통계적으로 5% 수준에서 유의적인 차이가 있다는 것을 의미
상기 표에서 알 수 있는 바와 같이, 본 발명에서 개발된 SSE-1의 경우 균이 접종된 24개 시료에서 19개의 양성이 검출되어 21개의 양성이 검출된 BPW-RVS를 이용한 기존 2단계 증균법과 통계학적 유의차를 보이지 않았으나 (p > 0.05), 또 하나의 단일증균배지인 OBS의 경우 24개 시료 중 단지 8개의 시료만이 양성으로 확인되어 나머지 2 증균방법과 통계학적 유의차를 보였다 (p < 0.05).
따라서 증균과정을 하루 이내로 단축시키기 위해 개발된 SSE-1은 기존의 2단계 증균법을 대체하여 사용될 수 있을 것으로 보인다.

Claims (17)

  1. 제1인산 칼륨(Potassium phosphate monobasic), 제2인산 나트륨 이수화물(Sodium phosphate dibasic dihydrate), 염화 나트륨, D-만니톨(mannitol), 효모 추출물, 3, 3'-티오디프로피온산(thiodipropionic acid), 피루브산 나트륨(Sodium pyruvate), 구연산 나트륨 및 노보비오신(Novobiocin)을 유효성분으로 포함하는 살모넬라균 단일 증균 배지 조성물.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 조성물은 액체 1리터당 상기 D-만니톨은 1-10g, 상기 효모 추출물은 1-10g, 상기 3, 3'-티오디프로피온산은 0.5-5g, 상기 피루브산 나트륨은 0.5-5g, 상기 구연산 나트륨은 1-25g 포함되는 것을 특징으로 하는 조성물.
  3. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 조성물은 액체 1리터당 상기 D-만니톨은 5g, 상기 효모 추출물은 6g, 상기 3, 3'-티오디프로피온산은 1g, 상기 피루브산 나트륨은 2g, 상기 구연산 나트륨은 10g 포함되는 것을 특징으로 하는 조성물.
  4. 제 1항에 있어서, 상기 조성물은 액체 1리터당 상기 노보비오신은 0.001-0.02g 포함되는 것을 특징으로 하는 조성물.
  5. 제 4항에 있어서, 상기 조성물은 액체 1리터당 상기 노보비오신은 0.001-0.005g 포함되는 것을 특징으로 하는 조성물.
  6. 제 5항에 있어서, 상기 조성물은 액체 1리터당 상기 노보비오신은 0.005g 포함되는 것을 특징으로 하는 조성물.
  7. 액체에 제1인산 칼륨(Potassium phosphate monobasic), 제2인산 나트륨 이수화물(Sodium phosphate dibasic dihydrate), 염화 나트륨, D-만니톨(mannitol), 효모 추출물, 3, 3'-티오디프로피온산(thiodipropionic acid), 피루브산 나트륨(Sodium pyruvate), 구연산 나트륨 및 노보비오신(Novobiocin)를 혼합하는 단계를 포함하는 살모넬라균 단일 증균 배지 조성물 제조 방법.
  8. 제 7항에 있어서, 상기 조성물은 액체 1리터당 상기 D-만니톨은 1-10g, 상기 효모 추출물은 1-10g, 상기 3, 3'-티오디프로피온산은 0.5-5g, 상기 피루브산 나트륨은 0.5-5g, 상기 구연산 나트륨은 1-25g을 포함하는 것을 특징으로 하는 제조방법.
  9. 제 7항 또는 제 8항에 있어서, 상기 조성물은 액체 1리터당 상기 D-만니톨은 5g, 상기 효모 추출물은 6g, 상기 3, 3'-티오디프로피온산은 1g, 상기 피루브산 나트륨은 2g, 상기 구연산 나트륨은 10g 포함하는 것을 특징으로 하는 제조방법.
  10. 제 7항에 있어서, 상기 조성물은 액체 1리터당 상기 노보비오신은 0.001-0.02g 포함하는 것을 특징으로 하는 제조방법.
  11. 제 10항에 있어서, 상기 조성물은 액체 1리터당 상기 노보비오신은 0.001-0.005g 포함하는 것을 특징으로 하는 제조방법.
  12. 제 11항에 있어서, 상기 조성물은 액체 1리터당 상기 노보비오신은 0.005g 포함하는 것을 특징으로 하는 제조방법.
  13. 제 1항의 배지 조성물에 샘플 유래 검체를 처리하고 배양하여 샘플 유래 검체에서 살모넬라 균을 검출하는 방법.
  14. 제 13항에 있어서, 상기 샘플은 야채, 육류, 또는 유제품인 것을 특징으로 하는 방법.
  15. 제 13항에 있어서, 상기 샘플은 양상추인 것을 특징으로 하는 방법.
  16. 제 13항에 있어서, 상기 살모넬라 균은 Salmonella Enteritiids인 것을 특징으로 하는 방법.
  17. 제 13항에 있어서, 상기 방법은 2차 증균 과정이 생략 가능한 것을 특징으로 하는 방법.
KR1020150172451A 2015-12-04 2015-12-04 2차 증균과정 생략이 가능한 살모넬라균 단일증균배지 조성물, 그 제조방법 및 그 용도 KR101701064B1 (ko)

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