JP3418399B2 - サルモネラの測定方法 - Google Patents
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- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
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Description
【発明の詳細な説明】
発明の分野
この発明は、サンプル、例えば未加工もしくは加工食
品または飼料製品のサンプルからサルモネラを強化・測
定する方法に関する。
品または飼料製品のサンプルからサルモネラを強化・測
定する方法に関する。
一般的な背景
未加工および加工食品のサルモネラ属（以下サルモネ
ラと称す）に属する細菌種による汚染は、食品および飼
料産業における主要な問題である。サルモネラは偏在性
であるので、複雑な伝達経路を有する汚染源が非常に多
い。
ラと称す）に属する細菌種による汚染は、食品および飼
料産業における主要な問題である。サルモネラは偏在性
であるので、複雑な伝達経路を有する汚染源が非常に多
い。
全てのサルモネラは、潜在的に、ヒト、動物もしくは
その両方にとって病原性である。ほとんどの血清型は、
宿主特異性をあまり示さず、接種後、ヒトにおいて、サ
ルモネラ症、胃腸疾患を引き起こすであろう。
その両方にとって病原性である。ほとんどの血清型は、
宿主特異性をあまり示さず、接種後、ヒトにおいて、サ
ルモネラ症、胃腸疾患を引き起こすであろう。
サルモネラの感染は、通常軽く、自己制御式で２〜３
日以内に回復するけれども、その感染は腸管から体の他
の組織に広がるので、幼児、年配の人および潜在的な疾
患を持つ人の間では、重い合併症を引き起こし、重篤な
疾患もしくは死に至るかもしれない。
日以内に回復するけれども、その感染は腸管から体の他
の組織に広がるので、幼児、年配の人および潜在的な疾
患を持つ人の間では、重い合併症を引き起こし、重篤な
疾患もしくは死に至るかもしれない。
別のよくある問題は、即時型（タイプ１）並びに遅延
型（タイプIV、細胞仲介タイプ）過敏症の過敏症反応を
起こすかもしれない細菌内毒素に対する免疫学的応答で
ある。
型（タイプIV、細胞仲介タイプ）過敏症の過敏症反応を
起こすかもしれない細菌内毒素に対する免疫学的応答で
ある。
産業上の食品の汚染を制御するために、未加工並びに
加工食品および飼料におけるサルモネラを検出する迅速
かつ信頼性のある手段が非常に必要とされている。その
ような食品をサルモネラに関して分析する従来の方法
は、伝統的に、例えば緩衝化されたペプトン水での非選
択的強化と、それに続くサルモネラの増殖を促進しかつ
他の細菌の増殖を阻害するブイヨン（broth）での選択
的強化と、その後のサルモネラ選択および／または指示
寒天培地上での培養の工程を含んでいる。そのような方
法は、扱いにくくかつ時間がかかり、通常、推定的結果
を得るのに３〜５日必要である。
加工食品および飼料におけるサルモネラを検出する迅速
かつ信頼性のある手段が非常に必要とされている。その
ような食品をサルモネラに関して分析する従来の方法
は、伝統的に、例えば緩衝化されたペプトン水での非選
択的強化と、それに続くサルモネラの増殖を促進しかつ
他の細菌の増殖を阻害するブイヨン（broth）での選択
的強化と、その後のサルモネラ選択および／または指示
寒天培地上での培養の工程を含んでいる。そのような方
法は、扱いにくくかつ時間がかかり、通常、推定的結果
を得るのに３〜５日必要である。
何年もの間に、食品中のサルモネラを早く検出するた
めのいくつかの方法論が提案されてきた。これらの例に
は、酵素免疫検定法（EIA）（Beumer et al.,1991:Note
rmansとWernars,1991:Emswiler−Rose et al.,1991:D'A
oustとSewell,1988b）、免疫拡散法（D'AoustとSewell,
1988a:Bailey et al.,1991）、ラテックス凝集検定法
（D'Aoust et al.,1987）、疎水性グリッド膜濾過検定
法（hydrophobic grid membrane filtration assay）
（Entis,1986）、選択的機動強化法（selective motili
ty enrichment technique）（Holbrook et al.,198
6）、および伝導法（conductance techniques）（Smith
et al.,1989）がある。これらの新規な技術は、伝統的
な方法よりも迅速な結果（42〜48時間）を提供するとい
う事実にもかかわらず、それらは、食品産業においてほ
んのすこし受け入れられただけであった。このことは、
食品および飼料中のサルモネラの検出をさらに早くかつ
簡単にする方法が産業上必要であることを反映してい
る。
めのいくつかの方法論が提案されてきた。これらの例に
は、酵素免疫検定法（EIA）（Beumer et al.,1991:Note
rmansとWernars,1991:Emswiler−Rose et al.,1991:D'A
oustとSewell,1988b）、免疫拡散法（D'AoustとSewell,
1988a:Bailey et al.,1991）、ラテックス凝集検定法
（D'Aoust et al.,1987）、疎水性グリッド膜濾過検定
法（hydrophobic grid membrane filtration assay）
（Entis,1986）、選択的機動強化法（selective motili
ty enrichment technique）（Holbrook et al.,198
6）、および伝導法（conductance techniques）（Smith
et al.,1989）がある。これらの新規な技術は、伝統的
な方法よりも迅速な結果（42〜48時間）を提供するとい
う事実にもかかわらず、それらは、食品産業においてほ
んのすこし受け入れられただけであった。このことは、
食品および飼料中のサルモネラの検出をさらに早くかつ
簡単にする方法が産業上必要であることを反映してい
る。
このように、サルモネラを速く検出する方法が明確に
必要である。そのような方法は、感度が高く、特異的で
かつ信頼性があるべきである。例えば、24時間以内に１
サルモネラ/25gサンプルと同じくらい少量を検出するこ
とができ、偽陽性のパーセンテージが10％より低く、か
つ真正陽性のパーセンテージが標準培養プロトコールと
比較して少なくとも80％である方法が、望ましいであろ
う。
必要である。そのような方法は、感度が高く、特異的で
かつ信頼性があるべきである。例えば、24時間以内に１
サルモネラ/25gサンプルと同じくらい少量を検出するこ
とができ、偽陽性のパーセンテージが10％より低く、か
つ真正陽性のパーセンテージが標準培養プロトコールと
比較して少なくとも80％である方法が、望ましいであろ
う。
発明の概要
発明者らは、19時間と同じくらい短い時間37℃〜43℃
で緩衝化されたサルモネラ選択培地中で未加工食品のサ
ンプルを一次強化することが、強化されたサンプルに関
して行われるELISAが非常に特異的でかつ未加工製品の
サンプル中のサルモネラを検出する標準培養法と少なく
とも同じくらい感度が高いことを保証する方法で最初の
サンプル中に存在するサルモネラを強化する有効な手段
であることを、驚くべきことに見い出した。
で緩衝化されたサルモネラ選択培地中で未加工食品のサ
ンプルを一次強化することが、強化されたサンプルに関
して行われるELISAが非常に特異的でかつ未加工製品の
サンプル中のサルモネラを検出する標準培養法と少なく
とも同じくらい感度が高いことを保証する方法で最初の
サンプル中に存在するサルモネラを強化する有効な手段
であることを、驚くべきことに見い出した。
さらに、加工食製品のサンプルを一次強化し（非選択
培地でもよい）、その一定時間後に約37℃から40℃〜43
℃に温度を上昇させることが、19時間後に強化されたサ
ンプルに関して行われるELISAが非常に特異的でかつ加
工製品のサンプル中のサルモネラを検出する標準培養法
と少なくとも同じくらい感度が高いことを保証する方法
で最初のサンプル中に存在するサルモネラを強化する有
効な手段であることを、見い出した。
培地でもよい）、その一定時間後に約37℃から40℃〜43
℃に温度を上昇させることが、19時間後に強化されたサ
ンプルに関して行われるELISAが非常に特異的でかつ加
工製品のサンプル中のサルモネラを検出する標準培養法
と少なくとも同じくらい感度が高いことを保証する方法
で最初のサンプル中に存在するサルモネラを強化する有
効な手段であることを、見い出した。
強化後に行われる測定は、次の分析で非特異的に干渉
する可能性のある食品成分を希釈するために、選択的後
強化（post−enrichment）によって先行されることがで
きる。サルモネラの希釈を補償するために、後強化は、
通常約40℃〜43℃の範囲の温度で約２〜約６時間の間行
われる。より特別には、後強化の継続時間は、約2.0〜
4.5時間の範囲、好ましくは2.5〜3.5時間の範囲が有利
であり、最も好ましくは、後強化の継続時間は、約３時
間である。そのような選択的後強化は、主に測定工程で
用いる検定法の特徴に依存して行われるべきである。検
定法が、検定されるサンプル中の干渉もしくは交差反応
物質に対して実質的に反応しない場合場合には、そのよ
うな後強化を行う必要はない。
する可能性のある食品成分を希釈するために、選択的後
強化（post−enrichment）によって先行されることがで
きる。サルモネラの希釈を補償するために、後強化は、
通常約40℃〜43℃の範囲の温度で約２〜約６時間の間行
われる。より特別には、後強化の継続時間は、約2.0〜
4.5時間の範囲、好ましくは2.5〜3.5時間の範囲が有利
であり、最も好ましくは、後強化の継続時間は、約３時
間である。そのような選択的後強化は、主に測定工程で
用いる検定法の特徴に依存して行われるべきである。検
定法が、検定されるサンプル中の干渉もしくは交差反応
物質に対して実質的に反応しない場合場合には、そのよ
うな後強化を行う必要はない。
この発明は、上述および他の発見に基づき、選択的強
化のために細胞の準備が整うとすぐにサルモネラが選択
的強化にかけられる戦略を利用している。この背景にあ
る主な観点は、競合ミクロフローラ（competing microf
lora）を阻害し、ミクロフローラによるサルモネラの異
常増殖と測定中に検出される競合ミクロフローラの能力
を防ぐことである。この発明の戦略によってサルモネラ
の異常増殖を防ぐことが、ある程度サルモネラに選択圧
をかけたとしても、以下の記載および資料から明らかな
ように、サンプル中のあらゆるサルモネラの成功した検
出を得ることに関して、この発明によって利用される平
衡選択性は、サルモネラに非常に好ましいものである。
化のために細胞の準備が整うとすぐにサルモネラが選択
的強化にかけられる戦略を利用している。この背景にあ
る主な観点は、競合ミクロフローラ（competing microf
lora）を阻害し、ミクロフローラによるサルモネラの異
常増殖と測定中に検出される競合ミクロフローラの能力
を防ぐことである。この発明の戦略によってサルモネラ
の異常増殖を防ぐことが、ある程度サルモネラに選択圧
をかけたとしても、以下の記載および資料から明らかな
ように、サンプル中のあらゆるサルモネラの成功した検
出を得ることに関して、この発明によって利用される平
衡選択性は、サルモネラに非常に好ましいものである。
別の方法で表現すると、この発明は主として、測定手
順を伝統的な強化手順に適合させること（従来のアプロ
ーチである）よりもむしろ、強化手順を測定手順に適合
させるという考えに基づいている。この発明の特別な特
徴は、 特に未加工製品において、選択物質テトラチオネートを
高められたインキュベーション温度と組み合わせること
によって、サルモネラの検出に関する特に高い感度と特
異性が得られること、および 特に加工製品において、抗生物質ノボビオシンの使用を
高められたインキュベーション温度と組み合わせること
によって、対応して優れた結果が得られること を発見したことに基づいている。
順を伝統的な強化手順に適合させること（従来のアプロ
ーチである）よりもむしろ、強化手順を測定手順に適合
させるという考えに基づいている。この発明の特別な特
徴は、 特に未加工製品において、選択物質テトラチオネートを
高められたインキュベーション温度と組み合わせること
によって、サルモネラの検出に関する特に高い感度と特
異性が得られること、および 特に加工製品において、抗生物質ノボビオシンの使用を
高められたインキュベーション温度と組み合わせること
によって、対応して優れた結果が得られること を発見したことに基づいている。
概要として、この発明は、非常に高い感度と特異性を
有し、24時間以内にサルモネラを検出することができる
新規な方法を提供する。
有し、24時間以内にサルモネラを検出することができる
新規な方法を提供する。
発明の詳細な開示
以下に、この明細書で使用する多数の用語の定義を与
える： １つの観点では、この発明は、サンプル、特に未加工
サンプル中のサルモネラ属に属する細菌の測定方法に関
し、その方法は、以下に説明する３つの強化手順１）〜
３）のうちの１つと、増殖後に強化培地中に存在するサ
ルモネラを同定および／または定量するための測定とか
らなり、その測定は、標的分子または標的分子を伴う分
子相互作用の同定および／または定量に基づき、かつこ
の明細書で定義される伝統的な寒天培養法（agar plati
ng techniques）とは異なる検定工程からなる。標的分
子または標的分子を伴う分子相互作用の同定および／ま
たは定量に基づく検定法の例には、免疫検定法｛例え
ば、放射線免疫検定法（RIA）、酵素免疫検定法（EI
A）、酵素結合イムノソルベント検定法（ELISA）、蛍光
抗体法（FA）、測定段階でリポソーム、ミセルもしくは
リポソーム様粒子を用いることからなる免疫検定法、免
疫固定化を伴う検定法、ラテックス凝集のような免疫凝
集を伴う検定法｝のような免疫学的反応を伴う検定法；
測定工程がDNA/DNAハイブリッド形成検定法、RNA/RNAハ
イブリッド形成検定法もしくはDNA/RNAハイブリッド形
成検定法からなる検定法；測定工程がポリメラーゼ連鎖
反応（PCR）もしくは類似の試験管内核酸増殖法からな
る検定法；および測定工程がペプチド核酸を用いること
からなる検定法（PNA;Nielsen P E et al.,1991参照）
がある。
える： １つの観点では、この発明は、サンプル、特に未加工
サンプル中のサルモネラ属に属する細菌の測定方法に関
し、その方法は、以下に説明する３つの強化手順１）〜
３）のうちの１つと、増殖後に強化培地中に存在するサ
ルモネラを同定および／または定量するための測定とか
らなり、その測定は、標的分子または標的分子を伴う分
子相互作用の同定および／または定量に基づき、かつこ
の明細書で定義される伝統的な寒天培養法（agar plati
ng techniques）とは異なる検定工程からなる。標的分
子または標的分子を伴う分子相互作用の同定および／ま
たは定量に基づく検定法の例には、免疫検定法｛例え
ば、放射線免疫検定法（RIA）、酵素免疫検定法（EI
A）、酵素結合イムノソルベント検定法（ELISA）、蛍光
抗体法（FA）、測定段階でリポソーム、ミセルもしくは
リポソーム様粒子を用いることからなる免疫検定法、免
疫固定化を伴う検定法、ラテックス凝集のような免疫凝
集を伴う検定法｝のような免疫学的反応を伴う検定法；
測定工程がDNA/DNAハイブリッド形成検定法、RNA/RNAハ
イブリッド形成検定法もしくはDNA/RNAハイブリッド形
成検定法からなる検定法；測定工程がポリメラーゼ連鎖
反応（PCR）もしくは類似の試験管内核酸増殖法からな
る検定法；および測定工程がペプチド核酸を用いること
からなる検定法（PNA;Nielsen P E et al.,1991参照）
がある。
この発明によれば、検定工程の持続時間を制限するの
が有利である。通常、検定の持続時間は、長くてもせい
ぜい７時間であるべきであるが、持続時間は長くてもせ
いぜい６、５、４、３、２および１時間のようにより短
いのが好ましい。
が有利である。通常、検定の持続時間は、長くてもせい
ぜい７時間であるべきであるが、持続時間は長くてもせ
いぜい６、５、４、３、２および１時間のようにより短
いのが好ましい。
この発明の方法の一部である他の興味深いタイプの測
定法を以下に列挙する： レクチンの使用または受容体結合を伴う類似の検定法
からなる測定法； バクテリオファージ（バクテリオファージフェリック
ス01は、特に興味深い可能性がある）の使用からなる測
定法； サルモネラを含む培地の電気抵抗またはインピーダン
スの変化を起こす物質のサルモネラによる代謝変換から
なり、サルモネラの検出が、この変化を測定することに
よって達せられる測定法； 寒天マトリックス上もしくは寒天マトリックスを介し
て移動するサルモネラの能力に関する検定法からなる測
定法； 細菌が培地から分離され、フィルター上に保持される
濾過工程を伴う検定法からなる測定法｛ここでは、疎水
性グリッド膜フィルター法（HGMF）が特に興味深い｝； 放射分析法を伴う検定法からなる測定法； クロマトグラフィーによる分離を伴う検定法からなる
測定法。
定法を以下に列挙する： レクチンの使用または受容体結合を伴う類似の検定法
からなる測定法； バクテリオファージ（バクテリオファージフェリック
ス01は、特に興味深い可能性がある）の使用からなる測
定法； サルモネラを含む培地の電気抵抗またはインピーダン
スの変化を起こす物質のサルモネラによる代謝変換から
なり、サルモネラの検出が、この変化を測定することに
よって達せられる測定法； 寒天マトリックス上もしくは寒天マトリックスを介し
て移動するサルモネラの能力に関する検定法からなる測
定法； 細菌が培地から分離され、フィルター上に保持される
濾過工程を伴う検定法からなる測定法｛ここでは、疎水
性グリッド膜フィルター法（HGMF）が特に興味深い｝； 放射分析法を伴う検定法からなる測定法； クロマトグラフィーによる分離を伴う検定法からなる
測定法。
このような検定法の特別な具体例は、この明細書の第
２頁に列挙されている文献に多数記載されている。
２頁に列挙されている文献に多数記載されている。
このような検定法の多くは、その分野では公知であ
る。実施例の項ではELISA検定の使用を記載するが、そ
の選択は、この発明を行うのに重要なものではないと理
解されるであろう。例えば、核酸間のハイブリッド形成
を伴う検定法もまた、非常に高い種特異性並びに株特異
性に適合させることができるので、非常に興味深い候補
となる検定法である。さらに、そのような検定法は、他
の細菌または物質からの干渉に対する感度がより低いの
で、選択的後強化を行う必要性を減少させ、それによっ
てこの発明の方法を簡単にする。
る。実施例の項ではELISA検定の使用を記載するが、そ
の選択は、この発明を行うのに重要なものではないと理
解されるであろう。例えば、核酸間のハイブリッド形成
を伴う検定法もまた、非常に高い種特異性並びに株特異
性に適合させることができるので、非常に興味深い候補
となる検定法である。さらに、そのような検定法は、他
の細菌または物質からの干渉に対する感度がより低いの
で、選択的後強化を行う必要性を減少させ、それによっ
てこの発明の方法を簡単にする。
上述の検定法は、この明細書でサルモネラの測定が起
こる方法の段階を意味する「測定工程」の一部を構成す
ることが理解されるであろう。
こる方法の段階を意味する「測定工程」の一部を構成す
ることが理解されるであろう。
用語「測定」は、サンプル中のサルモネラの存在の定
量的または定性的評価を意味する。しばしば、定性的評
価がこの発明の方法の目的である。それは、重要なこと
が、しばしばサルモネラの存在もしくは欠如を単に確認
することだからである。しかしながら、いくらかの制限
された汚染が許容されているか、または定量的評価自体
に興味がある状況下（例えば、動物もしくはヒトからの
サンプル中のサルモネラのレベルを評価するとき）で
は、測定は、定量的であることができる。後者の場合に
は、通常、サルモネラの公知量を含む外部標準と比較す
ることが必要であり、その標準は、サンプルと平行した
方法で処理される。
量的または定性的評価を意味する。しばしば、定性的評
価がこの発明の方法の目的である。それは、重要なこと
が、しばしばサルモネラの存在もしくは欠如を単に確認
することだからである。しかしながら、いくらかの制限
された汚染が許容されているか、または定量的評価自体
に興味がある状況下（例えば、動物もしくはヒトからの
サンプル中のサルモネラのレベルを評価するとき）で
は、測定は、定量的であることができる。後者の場合に
は、通常、サルモネラの公知量を含む外部標準と比較す
ることが必要であり、その標準は、サンプルと平行した
方法で処理される。
使用する検定法は、サルモネラの存在を測定するため
の何れの便利な検定法でもよい。しかしながら、検定法
は、サルモネラを検出するための多くの標準プロトコー
ルで用いられるような「伝統的な寒天培養法」（例え
ば、ISO6579に記載の培養法）ではない。
の何れの便利な検定法でもよい。しかしながら、検定法
は、サルモネラを検出するための多くの標準プロトコー
ルで用いられるような「伝統的な寒天培養法」（例え
ば、ISO6579に記載の培養法）ではない。
検定法は、最初のサンプル中に含まれる物質と検定の
ための成分との間の非特異的相互作用から生じる干渉を
受けるかもしれない。そのような干渉は、偽陽性の結果
並びに偽陰性の結果を生じるであろう。
ための成分との間の非特異的相互作用から生じる干渉を
受けるかもしれない。そのような干渉は、偽陽性の結果
並びに偽陰性の結果を生じるであろう。
そのような干渉物質によって引き起こされる問題は、
一次強化培地中の非微生物学的材料の最初の濃度が高
く、一次強化の間残存するが、微生物（サルモネラとそ
れ以外のものの両方）の最初の密度は通常かなり低いと
いう事実から生じることが、理解されるであろう。従っ
て、この発明の強化手順は、すでに存在する物質の固有
の干渉に対する効果はないが、この発明の強化手順は、
交差反応する微生物からの干渉を除去もしくは非常に減
少させるであろう。
一次強化培地中の非微生物学的材料の最初の濃度が高
く、一次強化の間残存するが、微生物（サルモネラとそ
れ以外のものの両方）の最初の密度は通常かなり低いと
いう事実から生じることが、理解されるであろう。従っ
て、この発明の強化手順は、すでに存在する物質の固有
の干渉に対する効果はないが、この発明の強化手順は、
交差反応する微生物からの干渉を除去もしくは非常に減
少させるであろう。
この明細書で用いるとき、用語「交差反応性」は、偽
陽性の結果もしくはシグナルを引き出す非サルモネラ菌
もしくは非サルモネラ菌から生じる分子の特徴的な能力
のことをいう。従って、「交差反応微生物」は、交差反
応性を示すか、または「交差反応する」。交差反応性
は、交差反応する物質／微生物と検定されるサルモネラ
との間に共通の特徴が存在する結果であると理解される
であろう。従って、交差反応性は、物質と検定のための
成分との間の非特異的相互作用のような非特異的現象と
区別されるべきである。
陽性の結果もしくはシグナルを引き出す非サルモネラ菌
もしくは非サルモネラ菌から生じる分子の特徴的な能力
のことをいう。従って、「交差反応微生物」は、交差反
応性を示すか、または「交差反応する」。交差反応性
は、交差反応する物質／微生物と検定されるサルモネラ
との間に共通の特徴が存在する結果であると理解される
であろう。従って、交差反応性は、物質と検定のための
成分との間の非特異的相互作用のような非特異的現象と
区別されるべきである。
従って、検定法とは別に、測定工程は、後強化を含む
ことができる。用語「後強化」は、検定中に干渉するか
もしれない一次強化培地中の物質を希釈するために、一
次強化からの材料を多量の選択的強化培地に移すことに
よって行われる選択的強化を意味する。上述のように、
後強化の必要性は、用いる検定法のタイプに非常に依存
し、主に上述の非特異的相互作用を受ける検定法を用い
るとき、後強化は価値があると証明されるであろう。
ことができる。用語「後強化」は、検定中に干渉するか
もしれない一次強化培地中の物質を希釈するために、一
次強化からの材料を多量の選択的強化培地に移すことに
よって行われる選択的強化を意味する。上述のように、
後強化の必要性は、用いる検定法のタイプに非常に依存
し、主に上述の非特異的相互作用を受ける検定法を用い
るとき、後強化は価値があると証明されるであろう。
この明細書では、用語「シグナル」は、サルモネラの
選択された特徴の存在をテストするための検定法におけ
る測定可能な出力のことをいう。前記特徴は、例えばDN
Aフラグメント、RNAフラグメント、抗原測定基、酵素、
受容体および他の高分子のような、サルモネラの存在に
関して検定されるサンプルにおいてサルモネラを他の微
生物と区別する生物学的特徴もしくは化学的特徴の何れ
であってもよい。
選択された特徴の存在をテストするための検定法におけ
る測定可能な出力のことをいう。前記特徴は、例えばDN
Aフラグメント、RNAフラグメント、抗原測定基、酵素、
受容体および他の高分子のような、サルモネラの存在に
関して検定されるサンプルにおいてサルモネラを他の微
生物と区別する生物学的特徴もしくは化学的特徴の何れ
であってもよい。
この明細書において、用語「カット−オフ値」は、陽
性のシグナルとしてみなされる検定法からの最小のシグ
ナルのことをいう。ELISA−２法を用いて行われる実験
においては、このカット−オフ値は、洗浄液からなる実
質的にサルモネラを含まないサンプルを検定するときに
得られるシグナルの２倍のシグナルとして定義される
が、ELISA−１法を用いる実験におけるカット−オフ値
は、サルモネラの十分に定義された標準サンプルのパー
センテージとして定義される（詳細には、サンプルの項
参照）。
性のシグナルとしてみなされる検定法からの最小のシグ
ナルのことをいう。ELISA−２法を用いて行われる実験
においては、このカット−オフ値は、洗浄液からなる実
質的にサルモネラを含まないサンプルを検定するときに
得られるシグナルの２倍のシグナルとして定義される
が、ELISA−１法を用いる実験におけるカット−オフ値
は、サルモネラの十分に定義された標準サンプルのパー
センテージとして定義される（詳細には、サンプルの項
参照）。
従って、この明細書では、用語「陽性のシグナル」
（即ちサンプルがサルモネラを含んでいると決める最終
もしくは推定の結果）は、選択されたカット−オフ値以
上のシグナルを意味し、用語「陰性のシグナル」（即ち
サンプルがサルモネラを含んでいないと決める最終もし
くは推定の結果）は、そのカット−オフ値以下のシグナ
ルを意味する。
（即ちサンプルがサルモネラを含んでいると決める最終
もしくは推定の結果）は、選択されたカット−オフ値以
上のシグナルを意味し、用語「陰性のシグナル」（即ち
サンプルがサルモネラを含んでいないと決める最終もし
くは推定の結果）は、そのカット−オフ値以下のシグナ
ルを意味する。
「真性陽性」のシグナルもしくは結果は、この明細書
では、陽性のシグナルを生じる一次強化の培地から培養
するときに確認することができる陽性のシグナルもしく
は結果として定義される。培養は、この明細書の実施例
５に記載したように行うことができる。
では、陽性のシグナルを生じる一次強化の培地から培養
するときに確認することができる陽性のシグナルもしく
は結果として定義される。培養は、この明細書の実施例
５に記載したように行うことができる。
「偽陽性」のシグナルもしくは結果は、この明細書で
は、測定中に陽性のシグナルを生じる一次強化の培地か
ら培養するときに確認することができない陽性のシグナ
ルもしくは結果として定義される。培養は、例えばこの
明細書の実施例５に記載したように行うことができる。
相応して、「偽陰性」のシグナルもしくは結果は、測定
中に陰性のシグナルを生じる一次強化の培地から培養す
るときに陰性として確認することができない陰性のシグ
ナルもしくは結果として定義される。
は、測定中に陽性のシグナルを生じる一次強化の培地か
ら培養するときに確認することができない陽性のシグナ
ルもしくは結果として定義される。培養は、例えばこの
明細書の実施例５に記載したように行うことができる。
相応して、「偽陰性」のシグナルもしくは結果は、測定
中に陰性のシグナルを生じる一次強化の培地から培養す
るときに陰性として確認することができない陰性のシグ
ナルもしくは結果として定義される。
この明細書で用いられる用語「サンプル」は、サルモ
ネラを保有していると疑われるあらゆる可能な源から採
取されるあらゆる試料のことを意味する。このように、
この発明の方法に付されるサンプルは、未加工および加
工製品（以下に定義される）のような源のみならず、糞
便、胃液、尿、血液、リンパ液、髄液、バイオプシー、
およびヒトを含む動物から採取される他のサンプルから
も生じることができる。サンプルの別の重要なグループ
は、環境起源（ほこり、交換品（swaps）、綿毛など）
のものである。
ネラを保有していると疑われるあらゆる可能な源から採
取されるあらゆる試料のことを意味する。このように、
この発明の方法に付されるサンプルは、未加工および加
工製品（以下に定義される）のような源のみならず、糞
便、胃液、尿、血液、リンパ液、髄液、バイオプシー、
およびヒトを含む動物から採取される他のサンプルから
も生じることができる。サンプルの別の重要なグループ
は、環境起源（ほこり、交換品（swaps）、綿毛など）
のものである。
用語「製品」は、サルモネラの存在に関して調査され
る全ての種類のサンプルを意味するが、用語「加工製
品」は、サルモネラのほとんど致死量に近い損傷に導く
（例えば加熱、乾燥、キュアリング、酸性化）あらゆる
種類の加工（凍結を除く）に暴露され、かつ典型的に以
下で定義される未加工の材料を５重量％より少ない量で
含む製品（例えば食品または飼料）として定義される。
従って、用語「未加工製品」または未加工材料は、上述
の加工に付されなかった製品のことである。典型的に、
未加工製品は、 −少なくとも５重量％の未加工の肉および／または魚、
および／または −少なくとも５重量％の未加工の卵、および／または −少なくとも５重量％の未加工のミルク、および／また
は −少なくとも５重量％の未加工の野菜および／または果
物、および／または −少なくとも５重量％の選択された環境サンプル（例え
ば、下水汚物および糞便） を含有する。
る全ての種類のサンプルを意味するが、用語「加工製
品」は、サルモネラのほとんど致死量に近い損傷に導く
（例えば加熱、乾燥、キュアリング、酸性化）あらゆる
種類の加工（凍結を除く）に暴露され、かつ典型的に以
下で定義される未加工の材料を５重量％より少ない量で
含む製品（例えば食品または飼料）として定義される。
従って、用語「未加工製品」または未加工材料は、上述
の加工に付されなかった製品のことである。典型的に、
未加工製品は、 −少なくとも５重量％の未加工の肉および／または魚、
および／または −少なくとも５重量％の未加工の卵、および／または −少なくとも５重量％の未加工のミルク、および／また
は −少なくとも５重量％の未加工の野菜および／または果
物、および／または −少なくとも５重量％の選択された環境サンプル（例え
ば、下水汚物および糞便） を含有する。
強化手順１）は、最初に論じられるであろう。この強
化手順は、サンプルを、pH5.6〜9.3に緩衝化されている
サルモネラ用の水性増殖培地に移し、移す前、移すのと
同時にまたは移した後テトラチオネートおよび／または
別の選択物質を培地に加えるかまたは培地に発生させ、
サンプルを移した後一定時間高くてもせいぜい38℃の温
度で生じた混合物を保持し（前強化時間）、次いでその
混合物の温度を39〜43℃に上昇させ、温度の上昇後一定
時間39〜43℃の上昇温度で混合物を保持する（強化時
間）ことからなる。強化手順１）は、選択物質、特にテ
トラチオネートを利用することに特徴がある。
化手順は、サンプルを、pH5.6〜9.3に緩衝化されている
サルモネラ用の水性増殖培地に移し、移す前、移すのと
同時にまたは移した後テトラチオネートおよび／または
別の選択物質を培地に加えるかまたは培地に発生させ、
サンプルを移した後一定時間高くてもせいぜい38℃の温
度で生じた混合物を保持し（前強化時間）、次いでその
混合物の温度を39〜43℃に上昇させ、温度の上昇後一定
時間39〜43℃の上昇温度で混合物を保持する（強化時
間）ことからなる。強化手順１）は、選択物質、特にテ
トラチオネートを利用することに特徴がある。
上記の強化手順およびこの発明の他の強化手順に用い
る増殖培地は、基礎的な同化可能な栄養源、微量栄養素
および必須の成長因子を含む培地である。培地は、サル
モネラの培養に適合した浸透圧を有するべきであり、か
つpH5.6〜9.3の範囲に緩衝化されるべきである。培地
は、糖を含まないかまたは実質的に含まないのが好まし
く、培地が糖を含む場合には、それらの濃度は、培地の
pHが少なくとも最初の10〜12時間以内に糖の発酵の結果
として起こる酸形成のために上述の範囲の外にでないよ
うに、培地の緩衝力に適合させるのが好ましい。これら
の基準を満たす優れた培地は、緩衝化ペプトン水（BP
W）である。
る増殖培地は、基礎的な同化可能な栄養源、微量栄養素
および必須の成長因子を含む培地である。培地は、サル
モネラの培養に適合した浸透圧を有するべきであり、か
つpH5.6〜9.3の範囲に緩衝化されるべきである。培地
は、糖を含まないかまたは実質的に含まないのが好まし
く、培地が糖を含む場合には、それらの濃度は、培地の
pHが少なくとも最初の10〜12時間以内に糖の発酵の結果
として起こる酸形成のために上述の範囲の外にでないよ
うに、培地の緩衝力に適合させるのが好ましい。これら
の基準を満たす優れた培地は、緩衝化ペプトン水（BP
W）である。
この明細書では、用語「強化」は、単に、サルモネラ
の増殖を促進するサルモネラ用の水性増殖培地での培養
を意味する。一方、「前強化」は、その後の強化中の温
度よりも低い温度での先行する培養を意味する。「一次
強化」は、最初の15〜30時間以内に行うサルモネラ用の
水性増殖培地での実質的に最初の培養である。
の増殖を促進するサルモネラ用の水性増殖培地での培養
を意味する。一方、「前強化」は、その後の強化中の温
度よりも低い温度での先行する培養を意味する。「一次
強化」は、最初の15〜30時間以内に行うサルモネラ用の
水性増殖培地での実質的に最初の培養である。
強化手順１）の主な戦略は、その手順の初期の段階で
選択物質を適用し、それによってできるだけ速く非サル
モネラを阻害条件下に暴露し、同時にサルモネラの阻害
がほとんど起こらないように選択物質の濃度と温度を含
む他の条件を適合させ、次いでサルモネラがその条件に
適合したとき、温度を上昇させることによって厳しい選
択条件を作ることであり、それによってサルモネラは多
くの非サルモネラに比べて良好な成長速度を示し、加え
て非サルモネラは、例えば後のELISA測定において干渉
するかもしれない例えば鞭毛の発育がより少ないため
に、偽陽性を生じさせることがより少ないであろう。前
強化時間は、10分〜８時間の範囲の長さを有することが
できるが、通常は30分〜７時間であり、しばしば２時間
〜６時間、特に３時間〜５時間のように、１時間〜６時
間30分の範囲である。
選択物質を適用し、それによってできるだけ速く非サル
モネラを阻害条件下に暴露し、同時にサルモネラの阻害
がほとんど起こらないように選択物質の濃度と温度を含
む他の条件を適合させ、次いでサルモネラがその条件に
適合したとき、温度を上昇させることによって厳しい選
択条件を作ることであり、それによってサルモネラは多
くの非サルモネラに比べて良好な成長速度を示し、加え
て非サルモネラは、例えば後のELISA測定において干渉
するかもしれない例えば鞭毛の発育がより少ないため
に、偽陽性を生じさせることがより少ないであろう。前
強化時間は、10分〜８時間の範囲の長さを有することが
できるが、通常は30分〜７時間であり、しばしば２時間
〜６時間、特に３時間〜５時間のように、１時間〜６時
間30分の範囲である。
上記強化手順（およびこの明細書に記載される他の強
化手順）においては、強化が始まった後のある時点で増
殖培地中に選択物質を発生させることが可能である。こ
の発明によれば、そのような選択物質の発生は、実質的
に瞬間であるのが好ましいが、選択物質の濃度がゆっく
り上昇するグラジエント様に進行させてもよい。選択物
質がテトラチオネートのとき、テトラチオネートの発生
は、培地中にチオ硫酸塩を保持し、その後よう素を加え
ることによって行われ、それによって培地中にテトラチ
オネートが得られる。
化手順）においては、強化が始まった後のある時点で増
殖培地中に選択物質を発生させることが可能である。こ
の発明によれば、そのような選択物質の発生は、実質的
に瞬間であるのが好ましいが、選択物質の濃度がゆっく
り上昇するグラジエント様に進行させてもよい。選択物
質がテトラチオネートのとき、テトラチオネートの発生
は、培地中にチオ硫酸塩を保持し、その後よう素を加え
ることによって行われ、それによって培地中にテトラチ
オネートが得られる。
この明細書で用いるとき、「選択原理（selective pr
inciple）」は、水性増殖培地中のほとんどの他の微生
物（非サルモネラ）の増殖に比例してサルモネラの増殖
を促進することを意味する。即ち、選択原理は、十分な
量でサルモネラ増殖培地に加えられるとき、ほとんどの
他の微生物よりも実質的に低い程度でサルモネラの増殖
を阻害する物質であることができ、または選択原理は、
物理的なパラメーター（例えば温度）をほとんどの他の
微生物よりも実質的に低い程度でサルモネラの増殖を阻
害する値に調整することであることができる。さらに、
選択原理は、選択原理を用いる強化後に行われるサルモ
ネラの存在を検出するための選択された検定法が、最初
のサンプル中の交差反応する微生物もしくは分子の存在
によって影響を受けないことを保証する手段を意味す
る。
inciple）」は、水性増殖培地中のほとんどの他の微生
物（非サルモネラ）の増殖に比例してサルモネラの増殖
を促進することを意味する。即ち、選択原理は、十分な
量でサルモネラ増殖培地に加えられるとき、ほとんどの
他の微生物よりも実質的に低い程度でサルモネラの増殖
を阻害する物質であることができ、または選択原理は、
物理的なパラメーター（例えば温度）をほとんどの他の
微生物よりも実質的に低い程度でサルモネラの増殖を阻
害する値に調整することであることができる。さらに、
選択原理は、選択原理を用いる強化後に行われるサルモ
ネラの存在を検出するための選択された検定法が、最初
のサンプル中の交差反応する微生物もしくは分子の存在
によって影響を受けないことを保証する手段を意味す
る。
従って、「選択的強化」は、選択原理を用いる強化手
順を意味し、結果として「非選択的強化」は、選択原理
を用いない強化手順である。
順を意味し、結果として「非選択的強化」は、選択原理
を用いない強化手順である。
他の微生物は、検定されるサンプル中に非常に多く、
まさにテストされるサルモネラよりも高い濃度で存在す
るかもしれないが、これらの微生物は、その交差反応性
が強化手順の結果として弱められるので、選択される検
定法と干渉しないことが理解されるであろう。
まさにテストされるサルモネラよりも高い濃度で存在す
るかもしれないが、これらの微生物は、その交差反応性
が強化手順の結果として弱められるので、選択される検
定法と干渉しないことが理解されるであろう。
「一次選択的強化」は、一次強化の最初の８時間以内に
選択的強化に変えられる一次強化のことを意味する。
選択的強化に変えられる一次強化のことを意味する。
上記の説明に従って、用語「強化ブイヨン」、「強化
培地」「一次強化ブイヨン」、「一次強化培地」、「選
択的強化ブイヨン」、「選択的強化培地」、「一次選択
的強化ブイヨン」および「一次選択的強化培地」は、対
応する強化のために使用するブイヨンまたは培地を意味
する。
培地」「一次強化ブイヨン」、「一次強化培地」、「選
択的強化ブイヨン」、「選択的強化培地」、「一次選択
的強化ブイヨン」および「一次選択的強化培地」は、対
応する強化のために使用するブイヨンまたは培地を意味
する。
一次選択的強化の主な目的は、サルモネラが最初のサ
ンプル中に存在したならば検定で陽性のシグナルを生じ
るサルモネラの存在に関する測定を行うために、十分な
量のサルモネラを提供することであることが、理解され
るであろう。従って、強化手順は、好結果が得られる検
定を行うために、最初の低い濃度のサルモネラを、最終
の十分に高い濃度のサルモネラに強化する能力に関して
評価されるべきである。従って、サルモネラの強化手順
と測定とからなる組み合わされた方法の感度は、強化の
効率と使用する測定法の感度とに依存する。
ンプル中に存在したならば検定で陽性のシグナルを生じ
るサルモネラの存在に関する測定を行うために、十分な
量のサルモネラを提供することであることが、理解され
るであろう。従って、強化手順は、好結果が得られる検
定を行うために、最初の低い濃度のサルモネラを、最終
の十分に高い濃度のサルモネラに強化する能力に関して
評価されるべきである。従って、サルモネラの強化手順
と測定とからなる組み合わされた方法の感度は、強化の
効率と使用する測定法の感度とに依存する。
この明細書で用いる用語「感度」は、もし存在するな
らば、最初のサンプル中におけるサルモネラを検出する
方法の能力として定義される。方法が、標準プロトコー
ルよりも良好な感度を有していると決められる場合に
は、そのことは、その方法が、統計的に、大多数のラン
ダムなサンプルをテストするときに標準プロトコールよ
りも多くの真正陽性の結果を認めることを意味してい
る。
らば、最初のサンプル中におけるサルモネラを検出する
方法の能力として定義される。方法が、標準プロトコー
ルよりも良好な感度を有していると決められる場合に
は、そのことは、その方法が、統計的に、大多数のラン
ダムなサンプルをテストするときに標準プロトコールよ
りも多くの真正陽性の結果を認めることを意味してい
る。
強化時間の持続時間は、通常、前強化時間と強化時間
の合計が10〜48時間、好ましくは15〜30時間、特に17〜
24時間の範囲内となるように適合され、それによってサ
ンプル中のあらゆるサルモネラは通常、許容されるレベ
ルに増殖し、一方同時に、強化手順の総持続時間は、十
分に短い。前強化と強化時間がこの明細書で論じられる
ときはいつでも、述べられる時間は、問題の条件下での
総時間であり；通常好ましくないが、前強化または強化
時間は、例えば選択物質を加えるかまたは発生させると
き、あるいは他の理由によって中断させることができる
と理解されるであろう。
の合計が10〜48時間、好ましくは15〜30時間、特に17〜
24時間の範囲内となるように適合され、それによってサ
ンプル中のあらゆるサルモネラは通常、許容されるレベ
ルに増殖し、一方同時に、強化手順の総持続時間は、十
分に短い。前強化と強化時間がこの明細書で論じられる
ときはいつでも、述べられる時間は、問題の条件下での
総時間であり；通常好ましくないが、前強化または強化
時間は、例えば選択物質を加えるかまたは発生させると
き、あるいは他の理由によって中断させることができる
と理解されるであろう。
このように、適切な濃度のテトラチオネートと39〜43
℃の範囲の温度との組み合わせにより、一方ではサルモ
ネラの優れた増殖を得ることが可能となり、他方では偽
陽性に導く非サルモネラからの交差反応を非常に実質的
に抑制することができる。混合物中のテトラチオネート
の濃度は、原則的に約５〜40mMの範囲もしくはその範囲
のちょうど外側であるが、テトラチオネートの濃度は、
通常約７〜35mMの範囲、たいていは約９〜30mMの範囲、
好ましくは約11〜28mMの範囲｛例えば、約13〜26mM（例
えば約14〜25mM）の範囲、好ましくは約15〜23mMの範
囲、多くの場合好ましくは約16〜22mMの範囲｝、特に約
17〜21mMの範囲（例えば約18〜20mM）であろう。テトラ
チオネートの最も好ましい濃度は、約19mMである。上記
のように、特別な状況下で選択される特定の濃度は、特
に、温度と他の選択物質の存在とに依存するであろう。
テトラチオネートに対する興味深い補足物として、プロ
テウス属の腸内細菌（Proteus）およびグラム陽性菌を
抑制するために、ノボビオシンを加えることができる。
ノボビオシンの最適量は、約2.5μg/mlである。ガイド
ラインとして、39〜43℃の範囲内における好ましい温度
は、強化時間の少なくとも実質的な部分の間、通常40〜
42℃であり、特に40.5〜41.5℃の範囲、最も好ましくは
41℃であろう。
℃の範囲の温度との組み合わせにより、一方ではサルモ
ネラの優れた増殖を得ることが可能となり、他方では偽
陽性に導く非サルモネラからの交差反応を非常に実質的
に抑制することができる。混合物中のテトラチオネート
の濃度は、原則的に約５〜40mMの範囲もしくはその範囲
のちょうど外側であるが、テトラチオネートの濃度は、
通常約７〜35mMの範囲、たいていは約９〜30mMの範囲、
好ましくは約11〜28mMの範囲｛例えば、約13〜26mM（例
えば約14〜25mM）の範囲、好ましくは約15〜23mMの範
囲、多くの場合好ましくは約16〜22mMの範囲｝、特に約
17〜21mMの範囲（例えば約18〜20mM）であろう。テトラ
チオネートの最も好ましい濃度は、約19mMである。上記
のように、特別な状況下で選択される特定の濃度は、特
に、温度と他の選択物質の存在とに依存するであろう。
テトラチオネートに対する興味深い補足物として、プロ
テウス属の腸内細菌（Proteus）およびグラム陽性菌を
抑制するために、ノボビオシンを加えることができる。
ノボビオシンの最適量は、約2.5μg/mlである。ガイド
ラインとして、39〜43℃の範囲内における好ましい温度
は、強化時間の少なくとも実質的な部分の間、通常40〜
42℃であり、特に40.5〜41.5℃の範囲、最も好ましくは
41℃であろう。
培地は、強化手順の最初にpH5.6〜9.3に緩衝化される
が、特別な場合（例えば未加工のミルク製品のような潜
在的に酸性のpHをもつサンプルを取り扱うとき）には、
pHは、一般的にはpHをその範囲に維持するのに十分な緩
衝能力があるのが好ましいが、全強化手順中この範囲に
とどまらないことを除外することはできない。上記範囲
内では、pHを6.7〜7.3の副範囲、特にちょうど約7.0に
保持するのが好ましい。
が、特別な場合（例えば未加工のミルク製品のような潜
在的に酸性のpHをもつサンプルを取り扱うとき）には、
pHは、一般的にはpHをその範囲に維持するのに十分な緩
衝能力があるのが好ましいが、全強化手順中この範囲に
とどまらないことを除外することはできない。上記範囲
内では、pHを6.7〜7.3の副範囲、特にちょうど約7.0に
保持するのが好ましい。
テトラチオネートおよびノボビオシンのような他の選
択物質は、培地にサンプルを加える前に培地中に存在し
ているのが好ましい。テトラチオネートの場合には、こ
の物質が通常、培地によう素を加え、それによってよう
素が予め培地に加えられているチオ硫酸塩と反応するる
ことによって発生部位（in situ）で産生されること
は、注目すべきことである。しかしながら、通常は好ま
しくないが、テトラチオネートおよび／または別の選択
物質は、培地にサンプルを添加した後同時に、培地に加
えられるかまたは培地に発生させてもよい。そのような
場合には、選択物質の添加または発生は、通常、移送後
長くてせいぜい４時間、適切には移送後長くてせいぜい
２時間、好ましくは移送後長くてせいぜい１時間、最も
好ましくは移送後長くてせいぜい10分で行われるでろ
う。
択物質は、培地にサンプルを加える前に培地中に存在し
ているのが好ましい。テトラチオネートの場合には、こ
の物質が通常、培地によう素を加え、それによってよう
素が予め培地に加えられているチオ硫酸塩と反応するる
ことによって発生部位（in situ）で産生されること
は、注目すべきことである。しかしながら、通常は好ま
しくないが、テトラチオネートおよび／または別の選択
物質は、培地にサンプルを添加した後同時に、培地に加
えられるかまたは培地に発生させてもよい。そのような
場合には、選択物質の添加または発生は、通常、移送後
長くてせいぜい４時間、適切には移送後長くてせいぜい
２時間、好ましくは移送後長くてせいぜい１時間、最も
好ましくは移送後長くてせいぜい10分で行われるでろ
う。
亜セレン酸水素ナトリウムのような亜セレン酸塩（以
下亜セレン酸塩と称す）は、標準プロトコール（例えば
AOAC）を含むサルモネラの強化に通常用いられる選択物
質であるけれども、亜セレン酸塩は、特に偽陽性の問題
をまねく傾向にあるので、この明細書では好ましい選択
物質ではない。この理由のために、強化培地には亜セレ
ン酸塩が存在しないか、または亜セレン酸塩の存在が多
くてもせいぜい0.5％w/vの亜セレン酸水素ナトリウムを
含む溶液中の亜セレン酸塩の濃度に対応する濃度に制限
されるのが好ましい。
下亜セレン酸塩と称す）は、標準プロトコール（例えば
AOAC）を含むサルモネラの強化に通常用いられる選択物
質であるけれども、亜セレン酸塩は、特に偽陽性の問題
をまねく傾向にあるので、この明細書では好ましい選択
物質ではない。この理由のために、強化培地には亜セレ
ン酸塩が存在しないか、または亜セレン酸塩の存在が多
くてもせいぜい0.5％w/vの亜セレン酸水素ナトリウムを
含む溶液中の亜セレン酸塩の濃度に対応する濃度に制限
されるのが好ましい。
組み合わされた一次選択的強化とその後のサルモネラ
の存在の測定の重要な特徴は、特異性である；そのよう
な組み合わせの方法は、サルモネラの存在によるとする
ことができない陽性の結果を生じるかもしれないことが
理解されるであろう。従って、この発明の方法のような
方法はまた、偽陽性の結果を防止する能力に関して評価
されるべきである。このように、強化手順の条件は、質
の高い測定が得られるように、測定に適合される。
の存在の測定の重要な特徴は、特異性である；そのよう
な組み合わせの方法は、サルモネラの存在によるとする
ことができない陽性の結果を生じるかもしれないことが
理解されるであろう。従って、この発明の方法のような
方法はまた、偽陽性の結果を防止する能力に関して評価
されるべきである。このように、強化手順の条件は、質
の高い測定が得られるように、測定に適合される。
この明細書で用いるとき、用語「特異性」は、方法に
おける偽陽性の結果もしくはシグナルを生じることを防
止する能力のことをいう。偽陽性の結果もしくはシグナ
ルを生じる数が少ない方法が、高い特異性を有する方法
であることが理解されるであろう。
おける偽陽性の結果もしくはシグナルを生じることを防
止する能力のことをいう。偽陽性の結果もしくはシグナ
ルを生じる数が少ない方法が、高い特異性を有する方法
であることが理解されるであろう。
適合を助けるために、一連の簡単かつ再現可能なテス
トが開発されている。これらのテストのうちの２つは、
容易に入手することができる標準純粋培養物を使用す
る。標準純粋培養物は、ATCCのような国定の試験（nati
onal collections）から入手することができる。
トが開発されている。これらのテストのうちの２つは、
容易に入手することができる標準純粋培養物を使用す
る。標準純粋培養物は、ATCCのような国定の試験（nati
onal collections）から入手することができる。
テスト１）は、方法におけるサルモネラを検出する能
力に関するテストであり、上述の強化および測定手順
（選択的強化培地に約15細胞/mlの開始濃度までサルモ
ネラの菌株を接種し、10％のランダムに選択された未加
工のひき肉を強化時間の最初に強化培地に加え、生じた
混合物を強化時間中一つの温度もしくは複数の温度に保
持する）を行うことにより行われる。そのテストは、測
定において、一団のランダムに選択されたサルモネラの
血清型をテストしたときに全ケースの少なくとも90％に
陽性の結果を生じるならば、合格と考えられる。
力に関するテストであり、上述の強化および測定手順
（選択的強化培地に約15細胞/mlの開始濃度までサルモ
ネラの菌株を接種し、10％のランダムに選択された未加
工のひき肉を強化時間の最初に強化培地に加え、生じた
混合物を強化時間中一つの温度もしくは複数の温度に保
持する）を行うことにより行われる。そのテストは、測
定において、一団のランダムに選択されたサルモネラの
血清型をテストしたときに全ケースの少なくとも90％に
陽性の結果を生じるならば、合格と考えられる。
テスト２）は、方法における偽陽性を防止する能力に
関するテストであり、上述の強化手順および測定｛選択
的強化培地（選択的強化培地は接種された非サルモネラ
株以外の微生物を実質的に含まないものである）に約10
0細胞/mlの開始濃度まで非サルモネラ種である、シトロ
バクター フレンジ（Citrobacter freundii）、エシエ
リヒアコリ（Escherichia coli）およびエンテロバクタ
ー クロアカエ（Enterobacter cloacae）のうちの１つ
の菌株を強化時間の最初に接種し、生じた混合物を、強
化時間中一つの温度もしくは複数の温度に保持する｝を
行うことにより行われる。そのテストは、検定における
偽陽性のパーセンテージが、非サルモネラ種からランダ
ムに選択された20株の一団をテストしたときに各々の種
のなかで多くてせいぜい15％であるとき、合格と考えら
れる。
関するテストであり、上述の強化手順および測定｛選択
的強化培地（選択的強化培地は接種された非サルモネラ
株以外の微生物を実質的に含まないものである）に約10
0細胞/mlの開始濃度まで非サルモネラ種である、シトロ
バクター フレンジ（Citrobacter freundii）、エシエ
リヒアコリ（Escherichia coli）およびエンテロバクタ
ー クロアカエ（Enterobacter cloacae）のうちの１つ
の菌株を強化時間の最初に接種し、生じた混合物を、強
化時間中一つの温度もしくは複数の温度に保持する｝を
行うことにより行われる。そのテストは、検定における
偽陽性のパーセンテージが、非サルモネラ種からランダ
ムに選択された20株の一団をテストしたときに各々の種
のなかで多くてせいぜい15％であるとき、合格と考えら
れる。
ある特別な条件が１つまたは両方のテストに合格しな
い場合には、当業者は、例えばテスト２）が非常に多く
の偽陽性を生じる場合には強化温度および／または選択
物質の濃度を上昇させることによって、および／または
前強化時間を減少させることによって、また例えばテス
ト１）における偽陰性を防止するためには選択原理の厳
重さを弱めることによって、強化条件を測定条件にうま
く適合させる方法を理解することが、わかるであろう。
い場合には、当業者は、例えばテスト２）が非常に多く
の偽陽性を生じる場合には強化温度および／または選択
物質の濃度を上昇させることによって、および／または
前強化時間を減少させることによって、また例えばテス
ト１）における偽陰性を防止するためには選択原理の厳
重さを弱めることによって、強化条件を測定条件にうま
く適合させる方法を理解することが、わかるであろう。
テスト１における真正陽性の最小は90％であるが、こ
の数は、より高い（例えば、テスト１において92％、ま
たは95％、またはよりよくは97％、またはまさに99.5％
に至るまで、またはよりよくは99.9％）のが好ましい。
の数は、より高い（例えば、テスト１において92％、ま
たは95％、またはよりよくは97％、またはまさに99.5％
に至るまで、またはよりよくは99.9％）のが好ましい。
加えて、テスト２は、偽陽性が15％を越えない、好ま
しくは12％もしくは10％、またはより好ましくは７％も
しくは５％を越えないべきであり、まさに１％もしくは
1/2％より低いべきである。
しくは12％もしくは10％、またはより好ましくは７％も
しくは５％を越えないべきであり、まさに１％もしくは
1/2％より低いべきである。
より根本的なテストは、測定が、標準プロトコールと
比べて少なくとも80％のこの明細書で定義した真正陽性
の結果を生じかつ100個のひき肉のサンプルをテスト
（テスト３）したときに多くてせいぜい10％のこの明細
書で定義した偽陽性の結果を生じ、２つの方法の各々に
よってテストされるサンプル部分の重さが25gであり、1
00個のサンプルが、10の異なるサンプルを配達する10の
異なる小売店から提供され、提供されたサンプルのうち
の20に、サンプル当たり約15のサルモネラ チフィムリ
ウム（Salmonella typhimurium）細胞を接種し、かつ提
供されたサンプルのうちの20に、サンプル当たり約15の
サルモネラ エンテリティティス（Salmonella enterit
itis）細胞を接種するような方法で、この明細書で定義
したRVSがこの明細書で定義したRVの代りに用いられ、
かつRVSが42℃でインキュベートされ、またこの明細書
で定義したXLDがプレーティング培地として用いられる
ことを除いて、標準プロトコールNMKL no.71（Nordic C
ommittee on Food Analysis method no.71,1991,第４
版）に対する方法の較正と条件とからなる。
比べて少なくとも80％のこの明細書で定義した真正陽性
の結果を生じかつ100個のひき肉のサンプルをテスト
（テスト３）したときに多くてせいぜい10％のこの明細
書で定義した偽陽性の結果を生じ、２つの方法の各々に
よってテストされるサンプル部分の重さが25gであり、1
00個のサンプルが、10の異なるサンプルを配達する10の
異なる小売店から提供され、提供されたサンプルのうち
の20に、サンプル当たり約15のサルモネラ チフィムリ
ウム（Salmonella typhimurium）細胞を接種し、かつ提
供されたサンプルのうちの20に、サンプル当たり約15の
サルモネラ エンテリティティス（Salmonella enterit
itis）細胞を接種するような方法で、この明細書で定義
したRVSがこの明細書で定義したRVの代りに用いられ、
かつRVSが42℃でインキュベートされ、またこの明細書
で定義したXLDがプレーティング培地として用いられる
ことを除いて、標準プロトコールNMKL no.71（Nordic C
ommittee on Food Analysis method no.71,1991,第４
版）に対する方法の較正と条件とからなる。
そのような較正において、最小の要件は、標準プロト
コールに比べて、この発明の方法によって80％の真正陽
性が得られることであるが、目標はしばしば、より高い
（例えば85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％お
よびまさに100％、あるいはそれ以上の真正陽性）であ
ろう。偽陽性の数に関して、最大の許容されるレベルは
通常10％であるが、目標は、より低いパーセンテージ
（例えば８％、５％、３％、２％および１％、またはま
さに０％）であろう。
コールに比べて、この発明の方法によって80％の真正陽
性が得られることであるが、目標はしばしば、より高い
（例えば85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％お
よびまさに100％、あるいはそれ以上の真正陽性）であ
ろう。偽陽性の数に関して、最大の許容されるレベルは
通常10％であるが、目標は、より低いパーセンテージ
（例えば８％、５％、３％、２％および１％、またはま
さに０％）であろう。
この発明の方法の利点の一つは、標準プロトコールと
比較して、総検出時間が短いことである。従って、強化
手順と測定工程の合計時間は、通常長くてせいぜい56時
間（例えば、長くてせいぜい48時間、40時間、34時間、
32時間、28時間）であるが、より現実的な具体例では、
通常24時間以内またはまさに22もしくは20時間以内に結
果を生じるであろう。
比較して、総検出時間が短いことである。従って、強化
手順と測定工程の合計時間は、通常長くてせいぜい56時
間（例えば、長くてせいぜい48時間、40時間、34時間、
32時間、28時間）であるが、より現実的な具体例では、
通常24時間以内またはまさに22もしくは20時間以内に結
果を生じるであろう。
上記の方法は、加工製品とは異なるサンプル（即ち、
上記で定義した未加工製品）中のサルモネラを測定する
ときに用いるのが好ましい。
上記で定義した未加工製品）中のサルモネラを測定する
ときに用いるのが好ましい。
強化手順２）について記載する。この手順は、サンプ
ルをpH5.6〜9.3に緩衝化されているサルモネラ用の水性
増殖培地に移し、サンプルが加えられた増殖培地を39〜
42.5℃の温度で保持し、移送前、移送と同時にまたは移
送後長くてせいぜい８時間でテトラチオネートおよび／
または別の選択物質を培地に加えるかまたは培地に発生
させ、生じた混合物を移送から一定時間の間39〜42.5℃
の温度で保持する（強化時間）ことを含んでいる。
ルをpH5.6〜9.3に緩衝化されているサルモネラ用の水性
増殖培地に移し、サンプルが加えられた増殖培地を39〜
42.5℃の温度で保持し、移送前、移送と同時にまたは移
送後長くてせいぜい８時間でテトラチオネートおよび／
または別の選択物質を培地に加えるかまたは培地に発生
させ、生じた混合物を移送から一定時間の間39〜42.5℃
の温度で保持する（強化時間）ことを含んでいる。
この強化手順の戦略は、主な選択パラメーターとし
て、強化手順の最初から適切な温度を用い、テトラチオ
ネートおよび／または別の選択物質が好ましくは事実上
できるだけ早く適合した量で適用されることである。こ
の戦略、その測定との調整およびテスト１）〜３）に関
する詳細については、強化手順１）についての上記ディ
スカッションと請求の範囲が参照される。しかしなが
ら、強化手順２）の重要な変形は、サンプルを移す前、
移すのと同時にまたは移した後、唯一の選択物質として
ノボビオシンが培地に加えられることであり、この場合
のノボビオシンの量は、約１〜100μg/ml、特に１〜20
μg/ml、とりわけ２〜13μg/mlの範囲である。この場合
には、強化温度は、40〜42℃の範囲が好ましい。
て、強化手順の最初から適切な温度を用い、テトラチオ
ネートおよび／または別の選択物質が好ましくは事実上
できるだけ早く適合した量で適用されることである。こ
の戦略、その測定との調整およびテスト１）〜３）に関
する詳細については、強化手順１）についての上記ディ
スカッションと請求の範囲が参照される。しかしなが
ら、強化手順２）の重要な変形は、サンプルを移す前、
移すのと同時にまたは移した後、唯一の選択物質として
ノボビオシンが培地に加えられることであり、この場合
のノボビオシンの量は、約１〜100μg/ml、特に１〜20
μg/ml、とりわけ２〜13μg/mlの範囲である。この場合
には、強化温度は、40〜42℃の範囲が好ましい。
最後に、強化手順３）は、サンプルをpH5.6〜9.3に緩
衝化されているサルモネラ用の水性増殖培地に移し、移
送前、移送と同時にまたは移送後長くてせいぜい３時間
でテトラチオネートを培地に加えるかまたは培地に発生
させ、生じた混合物をサンプルの移送後一定時間の間約
36.0〜39.0℃の温度で保持する（強化時間）ことからな
る。また、この手順に関して、手順１）に関する上記の
ディスカッションは、手順３）が36〜39℃の範囲に温度
を保持するときに最良の結果を生じ、かつテトラチオネ
ートがサンプルの添加から約１時間以内、好ましくは５
分以内に加えられるかまたは発生させられるべきである
ことを重要な例外として、適切な程度関連している。
衝化されているサルモネラ用の水性増殖培地に移し、移
送前、移送と同時にまたは移送後長くてせいぜい３時間
でテトラチオネートを培地に加えるかまたは培地に発生
させ、生じた混合物をサンプルの移送後一定時間の間約
36.0〜39.0℃の温度で保持する（強化時間）ことからな
る。また、この手順に関して、手順１）に関する上記の
ディスカッションは、手順３）が36〜39℃の範囲に温度
を保持するときに最良の結果を生じ、かつテトラチオネ
ートがサンプルの添加から約１時間以内、好ましくは５
分以内に加えられるかまたは発生させられるべきである
ことを重要な例外として、適切な程度関連している。
上記の全変形は、未加工サンプルに関して非常に適切
であるが、この発明の別の主要な観点は、特に加工製品
におけるサルモネラを強化しかつ測定する方法に関して
いる。この観点は、以下で論じられるが、ａ）サンプル
を、pH5.6〜9.3に緩衝化されかつ細菌の増殖を阻害する
物質を実質的に含まないサルモネラ用の水性増殖培地に
移し、生じた混合物を少なくとも１分間高くてせいぜい
39.0℃の温度で保持し（前強化時間）、次いで 混合物の温度を39.5〜43℃に上昇させ、任意にノボビオ
シンおよび／または別の選択物質を加え、 混合物を、温度を上昇させてから一定時間の間39.5〜43
℃の上昇温度で保持する（選択的強化時間）か、または ｂ）サンプルを、pH5.6〜9.3に緩衝化されているサルモ
ネラ用の水性増殖培地に移し、移す前、移すのと同時に
または移した後ノボビオシンおよび／または別の選択物
質を培地に加え、生じた混合物を、移送もしくはノボビ
オシンおよび／または別の選択物質の添加のうちどちら
か遅いほうから一定時間の間高くてせいぜい39.0℃の温
度で保持し（前強化時間）、次いで 混合物の温度を39.5〜43℃に上昇させ、任意にノボビオ
シンおよび／または別の選択物質を加え、 混合物を、温度を上昇させてから一定時間の間39.5〜43
℃の上昇温度で保持する（選択的強化時間）か、または ｃ）サンプルを、pH5.6〜9.3に緩衝化されているサルモ
ネラ用の水性増殖培地に移し、移す前、移すのと同時に
または移した後ノボビオシンを培地に加え、生じた混合
物を、移送もしくはノボビオシンまたは別の選択物質の
添加のうちどちらか遅いほうから一定時間の間高くてせ
いぜい39.0℃の温度で保持する（強化時間）かの何れか
からなる強化手順を行い、 次いで、増殖後に強化培地に存在するサルモネラを同定
および／または定量するために測定を行うことからなっ
ている。
であるが、この発明の別の主要な観点は、特に加工製品
におけるサルモネラを強化しかつ測定する方法に関して
いる。この観点は、以下で論じられるが、ａ）サンプル
を、pH5.6〜9.3に緩衝化されかつ細菌の増殖を阻害する
物質を実質的に含まないサルモネラ用の水性増殖培地に
移し、生じた混合物を少なくとも１分間高くてせいぜい
39.0℃の温度で保持し（前強化時間）、次いで 混合物の温度を39.5〜43℃に上昇させ、任意にノボビオ
シンおよび／または別の選択物質を加え、 混合物を、温度を上昇させてから一定時間の間39.5〜43
℃の上昇温度で保持する（選択的強化時間）か、または ｂ）サンプルを、pH5.6〜9.3に緩衝化されているサルモ
ネラ用の水性増殖培地に移し、移す前、移すのと同時に
または移した後ノボビオシンおよび／または別の選択物
質を培地に加え、生じた混合物を、移送もしくはノボビ
オシンおよび／または別の選択物質の添加のうちどちら
か遅いほうから一定時間の間高くてせいぜい39.0℃の温
度で保持し（前強化時間）、次いで 混合物の温度を39.5〜43℃に上昇させ、任意にノボビオ
シンおよび／または別の選択物質を加え、 混合物を、温度を上昇させてから一定時間の間39.5〜43
℃の上昇温度で保持する（選択的強化時間）か、または ｃ）サンプルを、pH5.6〜9.3に緩衝化されているサルモ
ネラ用の水性増殖培地に移し、移す前、移すのと同時に
または移した後ノボビオシンを培地に加え、生じた混合
物を、移送もしくはノボビオシンまたは別の選択物質の
添加のうちどちらか遅いほうから一定時間の間高くてせ
いぜい39.0℃の温度で保持する（強化時間）かの何れか
からなる強化手順を行い、 次いで、増殖後に強化培地に存在するサルモネラを同定
および／または定量するために測定を行うことからなっ
ている。
この発明のこの観点の背景にある戦略は、原則的に、
最初に述べた観点の背景にある戦略と同じである。即
ち、この発明のこの観点の背景にある戦略は、サルモネ
ラの準備が整うとすぐにサンプルが選択原理にかけられ
ることであるが、この観点は、加工サンプル中のサルモ
ネラが、ほとんど致死量に近い損傷を受け、何れかの明
白な選択性にかけられる前に適切に蘇生されることを、
特別に考慮している。
最初に述べた観点の背景にある戦略と同じである。即
ち、この発明のこの観点の背景にある戦略は、サルモネ
ラの準備が整うとすぐにサンプルが選択原理にかけられ
ることであるが、この観点は、加工サンプル中のサルモ
ネラが、ほとんど致死量に近い損傷を受け、何れかの明
白な選択性にかけられる前に適切に蘇生されることを、
特別に考慮している。
この発明のこの観点による強化手順は、完璧に適合可
能である（上記定義の）分析物測定（assay determinat
ion）に関してのみならず、全く一般的に独立して強化
手順として、独特でかつ有利であると信じられ、それ
は、従来の選択的強化培地（例えば、以下で定義するRV
およびTTB）並びに従来の寒天培養と組み合わせて用い
ることができる。しかしながら、大抵の目的のために
は、測定は、標的分子あるいは標的分子を伴う分子相互
作用の同定および／または定量に基づき、かつこの明細
書で定義した寒天培養とは異なる検定工程からなるのが
好ましい（特に未加工製品に関する観点に関連したディ
スカッション参照）。
能である（上記定義の）分析物測定（assay determinat
ion）に関してのみならず、全く一般的に独立して強化
手順として、独特でかつ有利であると信じられ、それ
は、従来の選択的強化培地（例えば、以下で定義するRV
およびTTB）並びに従来の寒天培養と組み合わせて用い
ることができる。しかしながら、大抵の目的のために
は、測定は、標的分子あるいは標的分子を伴う分子相互
作用の同定および／または定量に基づき、かつこの明細
書で定義した寒天培養とは異なる検定工程からなるのが
好ましい（特に未加工製品に関する観点に関連したディ
スカッション参照）。
各々の強化手順の条件は、
−水性増殖培地に、約1000個の熱処理した細胞/mlの開
始濃度までサルモネラの菌株の熱処理した細胞を植え付
け、５％の脂肪を含まない乾燥ミルクを強化手順の最初
に培地に加えるという、強化手順と測定とからなるテス
ト（テスト４）が、測定において、一団のランダムに選
択されたサルモネラの血清型をテストしたときに、全ケ
ースの90％に陽性の結果を生じ、かつ −水性増殖培地に、強化手順の最初に約100細胞/mlの開
始濃度まで非サルモネラ種である、シトロバクター フ
レンジ（Citrobacter freundii）、エシエリヒア コリ
（Escherichia coli）およびエンテロバクター クロア
カエ（Enterobacter cloacae）のうちの１つの菌株を接
種するという、強化手順と測定とからなるテスト（テス
ト５）が、測定において、非サルモネラ株の20のランダ
ムに選択された種の一団の各々の種のなかで、多くてせ
いぜい25％の偽陽性のパーセンテージを生じる ように、測定に適合させるのが好ましい。
始濃度までサルモネラの菌株の熱処理した細胞を植え付
け、５％の脂肪を含まない乾燥ミルクを強化手順の最初
に培地に加えるという、強化手順と測定とからなるテス
ト（テスト４）が、測定において、一団のランダムに選
択されたサルモネラの血清型をテストしたときに、全ケ
ースの90％に陽性の結果を生じ、かつ −水性増殖培地に、強化手順の最初に約100細胞/mlの開
始濃度まで非サルモネラ種である、シトロバクター フ
レンジ（Citrobacter freundii）、エシエリヒア コリ
（Escherichia coli）およびエンテロバクター クロア
カエ（Enterobacter cloacae）のうちの１つの菌株を接
種するという、強化手順と測定とからなるテスト（テス
ト５）が、測定において、非サルモネラ株の20のランダ
ムに選択された種の一団の各々の種のなかで、多くてせ
いぜい25％の偽陽性のパーセンテージを生じる ように、測定に適合させるのが好ましい。
上述の細胞の熱処理は、0.85％の塩化ナトリウムを含
む51℃の水中で10分間行われるべきである。
む51℃の水中で10分間行われるべきである。
また、この観点においては、測定が、標準プロトコー
ルと比べて少なくとも80％の真正陽性の結果を生じかつ
バッチとタイプに関してランダムに選択された50gのミ
ルクパウダーの合計50のサンプルをテスト（テスト６）
したときに多くてせいぜい10％のこの明細書で定義した
偽陽性の結果を生じ、各々のサンプルが１セットの２つ
の25g部分に分割され、各々のセットの１つの部分が特
に加工製品におけるサルモネラを強化しかつ測定するた
めにサンプルとしてこの発明の方法に付され、各々のセ
ットの他の部分がサンプルとして標準培養プロトコール
に付され、25g部分の50のセットのうちの25が以下の方
法：即ち −標準培養プロトコールに付されるセットの１つの25g
部分が、そのプロトコールの強化手順の最初に、約5CFU
のサルモネラ パナマ（Salmonella panama）またはサ
ルモネラ チフィムリウム（Salmonella typhimurium）
を含む0.1〜1gの脂肪を含まない乾燥ミルクをプロトコ
ールに用いる水性増殖培地に加えることによって補わ
れ、 −特に加工製品におけるサルモネラを強化しかつ測定す
るためにこの発明の方法に付されるセットの他の25g部
分が、強化手順の最初に、約5CFUのサルモネラ パナマ
（Salmonella panama）またはサルモネラ チフィムリ
ウム（Salmonella typhimurium）を含む0.1〜1gの脂肪
を含まない乾燥ミルクを水性増殖培地に加えることによ
って補われる、 という方法にスパイクされる（spike）というような方
法で、標準培養プトロコール、NMKL no.71（Nordic Com
mittee on Food Analysis method no.71,1991,第４版）
に対する較正が行われる。
ルと比べて少なくとも80％の真正陽性の結果を生じかつ
バッチとタイプに関してランダムに選択された50gのミ
ルクパウダーの合計50のサンプルをテスト（テスト６）
したときに多くてせいぜい10％のこの明細書で定義した
偽陽性の結果を生じ、各々のサンプルが１セットの２つ
の25g部分に分割され、各々のセットの１つの部分が特
に加工製品におけるサルモネラを強化しかつ測定するた
めにサンプルとしてこの発明の方法に付され、各々のセ
ットの他の部分がサンプルとして標準培養プロトコール
に付され、25g部分の50のセットのうちの25が以下の方
法：即ち −標準培養プロトコールに付されるセットの１つの25g
部分が、そのプロトコールの強化手順の最初に、約5CFU
のサルモネラ パナマ（Salmonella panama）またはサ
ルモネラ チフィムリウム（Salmonella typhimurium）
を含む0.1〜1gの脂肪を含まない乾燥ミルクをプロトコ
ールに用いる水性増殖培地に加えることによって補わ
れ、 −特に加工製品におけるサルモネラを強化しかつ測定す
るためにこの発明の方法に付されるセットの他の25g部
分が、強化手順の最初に、約5CFUのサルモネラ パナマ
（Salmonella panama）またはサルモネラ チフィムリ
ウム（Salmonella typhimurium）を含む0.1〜1gの脂肪
を含まない乾燥ミルクを水性増殖培地に加えることによ
って補われる、 という方法にスパイクされる（spike）というような方
法で、標準培養プトロコール、NMKL no.71（Nordic Com
mittee on Food Analysis method no.71,1991,第４版）
に対する較正が行われる。
「CFU」（コロニー形成単位）は、従来の希釈および
培養法を用いて測定される。
培養法を用いて測定される。
テスト４）〜６）で目的としている結果に関しては、
関連する請求の範囲から明らかなように、テスト５が上
述の対応するテスト２よりも一般的に厳重さがいくらか
低いことを除いて、特に未加工製品に関する観点につい
て上記したのと同じ考慮が適用される。
関連する請求の範囲から明らかなように、テスト５が上
述の対応するテスト２よりも一般的に厳重さがいくらか
低いことを除いて、特に未加工製品に関する観点につい
て上記したのと同じ考慮が適用される。
変形ａ）または変形ｂ）において、前強化時間は、通
常少なくとも1/2時間（例えば１〜10時間）であり、好
ましくは１〜８時間、特に２〜６時間（例えば３〜５時
間）、最も好ましくは３時間半〜４時間半である。前強
化時間のとりわけ好ましい持続時間は、約３時間であ
る。
常少なくとも1/2時間（例えば１〜10時間）であり、好
ましくは１〜８時間、特に２〜６時間（例えば３〜５時
間）、最も好ましくは３時間半〜４時間半である。前強
化時間のとりわけ好ましい持続時間は、約３時間であ
る。
総強化時間、測定工程の持続時間および検定の特徴に
関しては、上記と同じ考慮が適用される。
関しては、上記と同じ考慮が適用される。
上記の全観点について、サンプルは、個々の国におい
てそのサンプルが属する製品の特別な分野に適用される
規則に従って調製されるであろう。従って、サンプルの
調製は、公知の標準法に従って、グライディング、粉
砕、均質化などからなるであろう。
てそのサンプルが属する製品の特別な分野に適用される
規則に従って調製されるであろう。従って、サンプルの
調製は、公知の標準法に従って、グライディング、粉
砕、均質化などからなるであろう。
実施例
材料および方法
サルモネラは１細菌/25g食品と同程度の低い濃度で測
定されなければならないので、ELISA分析にかける前に
ンプルの強化を行うことが必要である。
定されなければならないので、ELISA分析にかける前に
ンプルの強化を行うことが必要である。
実施例で用いた強化手順は、上述した原理に従った選
択的一次強化（15−30時間）と、幾つかの実施例では次
の分析で干渉する可能性のある食品成分を希釈するため
に測定工程の一部としての修飾Ｍ−ブイヨンでの後強化
（post−enrichment）とからなっている。サルモネラ菌
の希釈を補償するために、後強化は、通常40℃〜43℃の
温度範囲内で約２〜約６時間の間行われる。Ｍ−ブイヨ
ンの修飾は、テトラチオネートかノボビオシンのどちら
かを加えることからなっている。
択的一次強化（15−30時間）と、幾つかの実施例では次
の分析で干渉する可能性のある食品成分を希釈するため
に測定工程の一部としての修飾Ｍ−ブイヨンでの後強化
（post−enrichment）とからなっている。サルモネラ菌
の希釈を補償するために、後強化は、通常40℃〜43℃の
温度範囲内で約２〜約６時間の間行われる。Ｍ−ブイヨ
ンの修飾は、テトラチオネートかノボビオシンのどちら
かを加えることからなっている。
従って、全強化手順は、合計約15〜約36時間で行うこ
とができる。
とができる。
以下の培地が、以下の実施例に記載された実験で用い
られた： AIP−20Eシステム:Bio Merieux20100 BGA:ブリリアントグリーン寒天（Merck7273/Oxoid CM32
9） BPW:緩衝化されたペプトン水（Buffered Peptone Wate
r）（Gibco152−03812/Oxoid CM501） コンジュゲート1:酵素β−ガラクトシダーゼ（２μg/m
l）結合型（Conjugate） サルモネラモノクローナル抗
体 コンジュゲート2:ビオチン結合型サルモネラポリクロー
ナル抗体 AV−GAL:1％牛血清アルブミンで2000倍に希釈したβ−
ガラクトシダーゼ（Zymed）結合型ストレプトアビジン Ｈ−血清：多価Ｈ−血清（Difco2406） LIA:リジン鉄寒天（Difco0849） MB:M−ブイヨン（Difco0940） MBN:ノボビオシン（Sigma N1628,10μg/ml）が補われた
Ｍ−ブイヨン Ｏ−血清：多価Ｏ−血清（Difco2264） ONPGブイヨン:Cowanにより1974年に記載されたように調
製されたｏ−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトピラノ
シド（Sigma N1127） 粒子溶液2:サルモネラに共通のべん毛抗原に対して特異
的なモノクローナル抗体でコートされた免疫球｛Dynabe
adR（DynalとNorwayによる登録商標）、2.0mg/ml｝ 粒子溶液1:サルモネラに共通のべん毛抗原に対して特異
的なモノクローナル抗体でコートされた免疫球｛Dynabe
adR（DynalとNorwayによる登録商標）、0.6mg/ml｝ RVブイヨン：ラパポルト−バシリアディスブイヨン（Ra
ppaport−Vassiliadis Broth）（Merck7700） RVSブイヨン：ラパポルト−バシリアディスブイヨン（O
xoid CM866） RM:生培地:19ml/lのヨウ素溶液の添加により一部がテト
ラチオネートに変換された17g/lのNaS2O3（Merck6516）
が補われたBPW ヨウ素溶液:6gのヨウ素（Merck 4761）＋5gのKI（Merck
5043）＋20mlの水 STOP:グリシンバッファー（0.1M、pH10.5） SUB:0.7％のジメチルホルムアミド中に４−メチルウン
ベリフェリル−β−ガラクトシド100μＭと1mMの塩化マ
グネシウムを含むもの TSI:三重糖鉄（Triple−Sugar−Iron）（Difco0265） TTB:テトラチオネートブイヨン（Difco0104） 洗浄液:PBS（リン酸塩緩衝化生理食塩液）＋0.1％のト
リトン−X100、pH7.4 XLD:キシロース リジン デキソシコレート寒天（Gibc
o152−05600/Oxoid CM469） リジンブイヨン:2gのＬ−リジン（Merck5700）を、水10
mlに溶解し、200mlのデカルボキシラーゼ塩基メラー（D
ifco 0890）に加えたもの 亜硫酸鉄:1980年にAnonymousにより記載されたように調
製された寒天培地 MX4:20μl/mlのヨウ素溶液の添加により一部がテトラチ
オネートに変換された17g/lのNaS2O3（Merck6516）が補
われたMB 全ての強化したサンプルを、自動分析機でエライザ法
（ELISA technique）（酵素結合型免疫吸着検定法）に
より測定した。実施例３〜８は、自動ELISA分析機のか
わりにデンマークのFoss Electricによりデザインされ
た機器であるEiaFossTM分析機を用いて行われ、一方、
実施例１および２の実験は、同じ機器の開発型を用いて
行われた。
られた： AIP−20Eシステム:Bio Merieux20100 BGA:ブリリアントグリーン寒天（Merck7273/Oxoid CM32
9） BPW:緩衝化されたペプトン水（Buffered Peptone Wate
r）（Gibco152−03812/Oxoid CM501） コンジュゲート1:酵素β−ガラクトシダーゼ（２μg/m
l）結合型（Conjugate） サルモネラモノクローナル抗
体 コンジュゲート2:ビオチン結合型サルモネラポリクロー
ナル抗体 AV−GAL:1％牛血清アルブミンで2000倍に希釈したβ−
ガラクトシダーゼ（Zymed）結合型ストレプトアビジン Ｈ−血清：多価Ｈ−血清（Difco2406） LIA:リジン鉄寒天（Difco0849） MB:M−ブイヨン（Difco0940） MBN:ノボビオシン（Sigma N1628,10μg/ml）が補われた
Ｍ−ブイヨン Ｏ−血清：多価Ｏ−血清（Difco2264） ONPGブイヨン:Cowanにより1974年に記載されたように調
製されたｏ−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトピラノ
シド（Sigma N1127） 粒子溶液2:サルモネラに共通のべん毛抗原に対して特異
的なモノクローナル抗体でコートされた免疫球｛Dynabe
adR（DynalとNorwayによる登録商標）、2.0mg/ml｝ 粒子溶液1:サルモネラに共通のべん毛抗原に対して特異
的なモノクローナル抗体でコートされた免疫球｛Dynabe
adR（DynalとNorwayによる登録商標）、0.6mg/ml｝ RVブイヨン：ラパポルト−バシリアディスブイヨン（Ra
ppaport−Vassiliadis Broth）（Merck7700） RVSブイヨン：ラパポルト−バシリアディスブイヨン（O
xoid CM866） RM:生培地:19ml/lのヨウ素溶液の添加により一部がテト
ラチオネートに変換された17g/lのNaS2O3（Merck6516）
が補われたBPW ヨウ素溶液:6gのヨウ素（Merck 4761）＋5gのKI（Merck
5043）＋20mlの水 STOP:グリシンバッファー（0.1M、pH10.5） SUB:0.7％のジメチルホルムアミド中に４−メチルウン
ベリフェリル−β−ガラクトシド100μＭと1mMの塩化マ
グネシウムを含むもの TSI:三重糖鉄（Triple−Sugar−Iron）（Difco0265） TTB:テトラチオネートブイヨン（Difco0104） 洗浄液:PBS（リン酸塩緩衝化生理食塩液）＋0.1％のト
リトン−X100、pH7.4 XLD:キシロース リジン デキソシコレート寒天（Gibc
o152−05600/Oxoid CM469） リジンブイヨン:2gのＬ−リジン（Merck5700）を、水10
mlに溶解し、200mlのデカルボキシラーゼ塩基メラー（D
ifco 0890）に加えたもの 亜硫酸鉄:1980年にAnonymousにより記載されたように調
製された寒天培地 MX4:20μl/mlのヨウ素溶液の添加により一部がテトラチ
オネートに変換された17g/lのNaS2O3（Merck6516）が補
われたMB 全ての強化したサンプルを、自動分析機でエライザ法
（ELISA technique）（酵素結合型免疫吸着検定法）に
より測定した。実施例３〜８は、自動ELISA分析機のか
わりにデンマークのFoss Electricによりデザインされ
た機器であるEiaFossTM分析機を用いて行われ、一方、
実施例１および２の実験は、同じ機器の開発型を用いて
行われた。
ELISA−1:
このELISA分析は、サルモネラの抗原に特異的な２つ
の異なるモノクローナル抗体を用いる“サンドイッチ
法”に基づいている。抗体は、天然の（native）べん毛
とはわずかしか反応しないが、熱処理したサルモネラの
抽出物とは強く反応する。従って、強化されたサンプル
は、ELISAにかける前に実施例１で詳細に記載したよう
に100℃で15分間熱処理される。この熱処理は、サルモ
ネラや他の病原細菌を殺し、不活化させる。ELISAで
は、1mlにつき105個の細胞を検出することができる。強
化は、強化が終了した時にサルモネラの数が少なくとも
105個/mlであることを確実にするように適合される。
の異なるモノクローナル抗体を用いる“サンドイッチ
法”に基づいている。抗体は、天然の（native）べん毛
とはわずかしか反応しないが、熱処理したサルモネラの
抽出物とは強く反応する。従って、強化されたサンプル
は、ELISAにかける前に実施例１で詳細に記載したよう
に100℃で15分間熱処理される。この熱処理は、サルモ
ネラや他の病原細菌を殺し、不活化させる。ELISAで
は、1mlにつき105個の細胞を検出することができる。強
化は、強化が終了した時にサルモネラの数が少なくとも
105個/mlであることを確実にするように適合される。
EiaFossTM分析機での自動ELISA分析は、約75分かかる
が、以下に記載するように手動で行うことが可能であ
る。
が、以下に記載するように手動で行うことが可能であ
る。
−１本の洗浄液の入ったテストチューブ（陰性対照）と
１本の500μｌの較正物質｛約106細胞/mlの濃度に希釈
したサルモネラ チフィムリウム（Salmonella typhimu
rium）の熱処理懸濁液｝が入ったテストチューブを、50
0μｌの熱処理したサンプルを含むテストチューブとと
もにサンプルディスクにおく。
１本の500μｌの較正物質｛約106細胞/mlの濃度に希釈
したサルモネラ チフィムリウム（Salmonella typhimu
rium）の熱処理懸濁液｝が入ったテストチューブを、50
0μｌの熱処理したサンプルを含むテストチューブとと
もにサンプルディスクにおく。
−サンプルを、35℃に加温し、分析を開始する。
−90μｌの粒子溶液１を、各サンプルに加え、12分半イ
ンキュベートする。サンプル中に存在するサルモネラ抗
原は、抗体と反応し、免疫球の表面に免疫複合体を形成
するであろう。小さな球体の全表面領域は非常に大きい
ので、それによって抗原と抗体との間の迅速かつ効率よ
い結合が生じる。
ンキュベートする。サンプル中に存在するサルモネラ抗
原は、抗体と反応し、免疫球の表面に免疫複合体を形成
するであろう。小さな球体の全表面領域は非常に大きい
ので、それによって抗原と抗体との間の迅速かつ効率よ
い結合が生じる。
−非結合材料を、免疫球が磁気力によってテストチュー
ブの側面にある間に洗浄液により洗い流す。
ブの側面にある間に洗浄液により洗い流す。
−次いで、130μｌのコンジュゲート１を加え、12分半
インキュベートする。複合抗体は、免疫球−抗原複合体
に結合する。これによってサルモネラ抗原を中間とする
“サンドイッチ”が生じる。
インキュベートする。複合抗体は、免疫球−抗原複合体
に結合する。これによってサルモネラ抗原を中間とする
“サンドイッチ”が生じる。
−非結合の標識抗体を、洗浄液で洗い流す。
−200μｌのSUBを加え、12分半インキュベートする。粒
子に結合している酵素は、基質を蛍光検出機（励起365n
m、放射450nm）で測定される蛍光化合物である４−メチ
ルウンベリフェリル（a.o.4−メチルウンベリフェリ
ル）に分解するであろう。
子に結合している酵素は、基質を蛍光検出機（励起365n
m、放射450nm）で測定される蛍光化合物である４−メチ
ルウンベリフェリル（a.o.4−メチルウンベリフェリ
ル）に分解するであろう。
−酵素反応を、STOPを200μｌ加えることによって停止
する。４−メチルウンベリフェリルの濃度を、検出機で
測定する。その濃度は、サンプル中に存在するサルモネ
ラ抗原の量に比例している。個々のサンプルの蛍光シグ
ナルを、25％の較正シグナルとして定義されるカット−
オフ値と比較する。カット−オフ値に等しいか、または
それより高いシグナルをもつサンプルは、陽性と考えら
れる。カット−オフ値より低いシグナルをもつサンプル
は、陰性と考えられる。
する。４−メチルウンベリフェリルの濃度を、検出機で
測定する。その濃度は、サンプル中に存在するサルモネ
ラ抗原の量に比例している。個々のサンプルの蛍光シグ
ナルを、25％の較正シグナルとして定義されるカット−
オフ値と比較する。カット−オフ値に等しいか、または
それより高いシグナルをもつサンプルは、陽性と考えら
れる。カット−オフ値より低いシグナルをもつサンプル
は、陰性と考えられる。
ELISA2:
このELISA分析も、サルモネラ抗原に対する２つの異
なる抗体（モノクローナルとポリクローナル抗体各１
つ）を用いる“サンドイッチ法”に基づいている。抗体
は、天然のべん毛とはわずかしか反応しないが、熱処理
したサルモネラの抽出物とは強く反応する。従って、強
化されたサンプルは、ELISAにかける前に実施例１で詳
細に記載したように100℃で15分間熱処理される。この
熱処理は、サルモネラと他の病原細胞を殺し不活性化す
る。ELISAでは、1mlにつき106個の細胞を検出すること
ができる。
なる抗体（モノクローナルとポリクローナル抗体各１
つ）を用いる“サンドイッチ法”に基づいている。抗体
は、天然のべん毛とはわずかしか反応しないが、熱処理
したサルモネラの抽出物とは強く反応する。従って、強
化されたサンプルは、ELISAにかける前に実施例１で詳
細に記載したように100℃で15分間熱処理される。この
熱処理は、サルモネラと他の病原細胞を殺し不活性化す
る。ELISAでは、1mlにつき106個の細胞を検出すること
ができる。
ELISA分析は、以下のように記載することができる。
−洗浄液の入った１本のテストチューブ（陰性対照）と
500μｌの陽性対照（約106細胞/mlの細胞懸濁液中のフ
ラジェリン濃度に対応する濃度まで希釈したサルモネラ
チフィムリウムのフラジェリンの精製溶液）の入った
１本のテストチューブを、熱処理したサンプル500μｌ
を含むテストチューブとともにサンプルディスクにお
く。
500μｌの陽性対照（約106細胞/mlの細胞懸濁液中のフ
ラジェリン濃度に対応する濃度まで希釈したサルモネラ
チフィムリウムのフラジェリンの精製溶液）の入った
１本のテストチューブを、熱処理したサンプル500μｌ
を含むテストチューブとともにサンプルディスクにお
く。
−63μg/mlのコンジュゲート２を含む粒子溶液２の60μ
ｌを各サンプルに加え、25分間インキュベートする。サ
ンプル中に存在するサルモネラ抗原は、抗体と反応し、
免疫球の表面上で免疫複合体を形成するであろう。ビオ
チン複合抗体は、免疫球−抗原複合体に同時に結合す
る。これによって、サルモネラ抗原を中間とした“サン
ドイッチ”が生じる。小さな球体の全領域は非常に大き
いので、それによって抗原と抗体との間の迅速かつ効率
良い反応が生じる。
ｌを各サンプルに加え、25分間インキュベートする。サ
ンプル中に存在するサルモネラ抗原は、抗体と反応し、
免疫球の表面上で免疫複合体を形成するであろう。ビオ
チン複合抗体は、免疫球−抗原複合体に同時に結合す
る。これによって、サルモネラ抗原を中間とした“サン
ドイッチ”が生じる。小さな球体の全領域は非常に大き
いので、それによって抗原と抗体との間の迅速かつ効率
良い反応が生じる。
−非結合材料を、免疫球が磁気力によってテストチュー
ブの側面にある間に洗浄液で洗い流す。
ブの側面にある間に洗浄液で洗い流す。
−次いで、100μｌのAV−GALを加え、20分間インキュベ
ートする。AV−GALは、免疫球−抗原−抗体複合体に結
合する。
ートする。AV−GALは、免疫球−抗原−抗体複合体に結
合する。
−非結合AV−GALを、洗浄液で洗い流す。
−230μｌのSUBを加え、８分間インキュベートする。粒
子に結合している酵素は、基質を蛍光検出機（励起365n
m、放射450nm）で測定される蛍光化合物である４−メチ
ルウンベリフェリル（a.o.4−メチルウンベリフェリ
ル）に分解するであろう。
子に結合している酵素は、基質を蛍光検出機（励起365n
m、放射450nm）で測定される蛍光化合物である４−メチ
ルウンベリフェリル（a.o.4−メチルウンベリフェリ
ル）に分解するであろう。
−酵素反応を、230μｌのSTOPを加えることによって停
止する。４−メチルウンベリフェリルの濃度を、検出機
で検出する。その濃度は、サンプル中に存在するサルモ
ネラ抗原の量に比例している。個々のサンプルの蛍光シ
グナルを、陰性対照のシグナルの２倍として定義される
カット−オフ値と比較する。カット−オフ値に等しい
か、またはそれより高いシグナルをもつサンプルは陽性
と考えられる。カット−オフ値より低いシグナルをもつ
サンプルは、陰性と考えられる。
止する。４−メチルウンベリフェリルの濃度を、検出機
で検出する。その濃度は、サンプル中に存在するサルモ
ネラ抗原の量に比例している。個々のサンプルの蛍光シ
グナルを、陰性対照のシグナルの２倍として定義される
カット−オフ値と比較する。カット−オフ値に等しい
か、またはそれより高いシグナルをもつサンプルは陽性
と考えられる。カット−オフ値より低いシグナルをもつ
サンプルは、陰性と考えられる。
上記のELISAで使用した抗体は、当業者に公知の方法
によって提供されるであろう。
によって提供されるであろう。
例えば、サルモネラに対するポリクローナル抗体は、
標準化した免疫手順に従って精製したべん毛でうさぎを
免疫化することによって製造することができる。うさぎ
から血液を取り、血清を単離し、標準的な技法を用いて
精製する。抗体を、交差反応を示すシトロバクターフレ
ンジ（Citrobacter freundii）からの精製したべん毛を
用いて、ポリクローナル抗体を含む抗血清の吸収により
さらに精製する。
標準化した免疫手順に従って精製したべん毛でうさぎを
免疫化することによって製造することができる。うさぎ
から血液を取り、血清を単離し、標準的な技法を用いて
精製する。抗体を、交差反応を示すシトロバクターフレ
ンジ（Citrobacter freundii）からの精製したべん毛を
用いて、ポリクローナル抗体を含む抗血清の吸収により
さらに精製する。
モノクローナル抗体は、免疫原としてサルモネラのフ
ラジェリンを用いる標準的なモノクローナル抗体技法に
基づいて製造することができる（モノクローナル抗体に
関する情報として、Kohler ＆ Millstein,1975参照）。
ラジェリンを用いる標準的なモノクローナル抗体技法に
基づいて製造することができる（モノクローナル抗体に
関する情報として、Kohler ＆ Millstein,1975参照）。
実施例１
ひき肉のスパイクされたサンプルにおけるサルモネラの
初期の選択的強化と測定 サルモネラを含まないひき肉サンプル1gの２つの部分
を、各々RM 10mlを含む２本のテストチューブに移し
た。１晩37℃で培養したサルモネラを0.85％の塩化ナト
リウム溶液で105倍に希釈し、サルモネラの最終濃度を
約３×103細胞/mlにした。この細胞懸濁液50μｌを上述
のテストチューブの１つに加え、平均初期細胞数を15細
胞/mlにした。両テストチューブを41℃で24時間インキ
ュベートした。
初期の選択的強化と測定 サルモネラを含まないひき肉サンプル1gの２つの部分
を、各々RM 10mlを含む２本のテストチューブに移し
た。１晩37℃で培養したサルモネラを0.85％の塩化ナト
リウム溶液で105倍に希釈し、サルモネラの最終濃度を
約３×103細胞/mlにした。この細胞懸濁液50μｌを上述
のテストチューブの１つに加え、平均初期細胞数を15細
胞/mlにした。両テストチューブを41℃で24時間インキ
ュベートした。
強化後、テストチューブを沸騰水中で15分間加熱し
た。冷却後、熱処理懸濁液をELISA−２分析にかけた。
た。冷却後、熱処理懸濁液をELISA−２分析にかけた。
全部で34のひき肉のサンプルを上記のようにテストし
た。（汚染のパターンは表１に示されている）。34の全
スパイラルサンプルは、ELISA−２分析で陽性の反応を
示したが、汚染されていない肉のサンプルは、どれも陽
性を示さなかった。
た。（汚染のパターンは表１に示されている）。34の全
スパイラルサンプルは、ELISA−２分析で陽性の反応を
示したが、汚染されていない肉のサンプルは、どれも陽
性を示さなかった。
このように、未加工の食品サンプル由来のサルモネラ
を強化するためのこの発明の方法は、サルモネラを約15
細胞/mlの濃度から約106細胞/mlのELISA−２のカット−
オフ値に対応するレベルより上のレベルまで特異的に強
化するための能力を示している。
を強化するためのこの発明の方法は、サルモネラを約15
細胞/mlの濃度から約106細胞/mlのELISA−２のカット−
オフ値に対応するレベルより上のレベルまで特異的に強
化するための能力を示している。
実施例２
実施例１の方法における温度依存性
一次選択的強化が37℃および43℃で行われたことを除
いて、実施例１でのテストと類似の方法で、25のひき肉
サンプルをテストした。肉サンプルの汚染の概要は、表
２に列挙したようであった。
いて、実施例１でのテストと類似の方法で、25のひき肉
サンプルをテストした。肉サンプルの汚染の概要は、表
２に列挙したようであった。
結果を表３に列挙する。
従って、上記の結果から明らかに分かるように、最適
温度は約41℃と思われる。
温度は約41℃と思われる。
その方法における温度依存性をさらに調べるために、
９つのひき肉のサンプルを、39℃、40℃、41℃および42
℃の温度で上記のようにテストした。接種の概要は表４
のようであった。
９つのひき肉のサンプルを、39℃、40℃、41℃および42
℃の温度で上記のようにテストした。接種の概要は表４
のようであった。
これらのテストの結果を表５に列挙する。
明らかに分かるように、実施例１の方法は、39℃〜42
℃の全範囲内で非常に感度が高く、かつ特異性が高い。
℃の全範囲内で非常に感度が高く、かつ特異性が高い。
実施例３
未加工および加工製品由来のサルモネラの一次選択的強
化の選択性 25の異なるサルモネラ株と11の異なる非サルモネラ株
をMB中非選択的条件下（37℃、18時間）で強化し、100
℃で15分間熱処理し、その後連続的に10倍から10000倍
に希釈した。11の非サルモネラ株は、サルモネラに近縁
の100株から選択され、その全てがELISA−１で弱〜強の
交差反応を示した（初期の実験で）が、残りの89株は交
差反応を示さなかった。希釈された懸濁液をELISA−１
にかけた。結果を表６に示す。
化の選択性 25の異なるサルモネラ株と11の異なる非サルモネラ株
をMB中非選択的条件下（37℃、18時間）で強化し、100
℃で15分間熱処理し、その後連続的に10倍から10000倍
に希釈した。11の非サルモネラ株は、サルモネラに近縁
の100株から選択され、その全てがELISA−１で弱〜強の
交差反応を示した（初期の実験で）が、残りの89株は交
差反応を示さなかった。希釈された懸濁液をELISA−１
にかけた。結果を表６に示す。
サルモネラと非サルモネラの同じ株もまた、未加工製
品の強化のために特に適切な一次選択的強化と、それに
続くELISA−１にかけられた： 1.5μg/mlのノボビオシンと1gの熱処理（100℃、15分
間）したひき肉を補った10mlのRMを含むテストチューブ
に、1ml当たり約103細胞を加えた。次いで、そのテスト
チューブを41℃で19時間インキュベートした。次いで、
0.5mlの強化した懸濁液を、10mlのMBNに移し、次いでそ
れを42℃で３時間インキュベートした。そのMBNを、熱
処理し、希釈し、この実施例で上記したようにELISA−
１でテストした。
品の強化のために特に適切な一次選択的強化と、それに
続くELISA−１にかけられた： 1.5μg/mlのノボビオシンと1gの熱処理（100℃、15分
間）したひき肉を補った10mlのRMを含むテストチューブ
に、1ml当たり約103細胞を加えた。次いで、そのテスト
チューブを41℃で19時間インキュベートした。次いで、
0.5mlの強化した懸濁液を、10mlのMBNに移し、次いでそ
れを42℃で３時間インキュベートした。そのMBNを、熱
処理し、希釈し、この実施例で上記したようにELISA−
１でテストした。
従って、表６および７から明らかなように、この発明
の強化は、非選択的に強化したときに交差反応を示した
11の非サルモネラ株のうちの10においてどんな交差反応
も除去することができる。そして、サルモネラが選択的
な一次選択強化によって与えられる影響の程度は非常に
小さいことが理解できる。
の強化は、非選択的に強化したときに交差反応を示した
11の非サルモネラ株のうちの10においてどんな交差反応
も除去することができる。そして、サルモネラが選択的
な一次選択強化によって与えられる影響の程度は非常に
小さいことが理解できる。
サルモネラと非サルモネラの同じ株もまた、加工製品
の強化のために特に適切な一次選択的強化後に、ELISA
−１にかけられた。
の強化のために特に適切な一次選択的強化後に、ELISA
−１にかけられた。
1ml当たり約30個の細胞を、2.5μg/mlのノボビオシン
を補った10mlのBPWを含むテストチューブに加えた。次
いで、そのテストチューブを37℃で４時間インキュベー
トした。その後すぐに、そのテストチューブをさらに41
℃で15時間インキュベートした。次いで、0.5mlの強化
懸濁液を10mlのMBNに移し、次いでそれを42℃で３時間
インキュベートした。MBNを、熱処理し、希釈し、この
実施例で上記したようにELISA−１でテストした。
を補った10mlのBPWを含むテストチューブに加えた。次
いで、そのテストチューブを37℃で４時間インキュベー
トした。その後すぐに、そのテストチューブをさらに41
℃で15時間インキュベートした。次いで、0.5mlの強化
懸濁液を10mlのMBNに移し、次いでそれを42℃で３時間
インキュベートした。MBNを、熱処理し、希釈し、この
実施例で上記したようにELISA−１でテストした。
従って、表６と８の比較から明らかなように、この発
明の強化は、非選択的に強化したとき交差反応を示した
11の非サルモネラ株のうちの９においてどんな交差反応
も除去することができる。しかしながら、サルモネラが
選択的な一次選択的強化によって与えられる影響の程度
は非常に小さい。
明の強化は、非選択的に強化したとき交差反応を示した
11の非サルモネラ株のうちの９においてどんな交差反応
も除去することができる。しかしながら、サルモネラが
選択的な一次選択的強化によって与えられる影響の程度
は非常に小さい。
実施例４
未加工製品中のサルモネラにおける標準的な培養手順
と、一次選択的強化および測定の比較 RVを41.5℃の代わりに42.5℃でインキュベートしたこ
とを主に除いて、Nordic Committee on Food Analysis
（NMKL no.71）によって提案された強化手順を利用する
標準培養プロトコールを用いて、全部で54の未加工サン
プル（例：ブロイラー、ひき肉、卵白および卵黄）が、
サルモネラの存在に関して調べられた。
と、一次選択的強化および測定の比較 RVを41.5℃の代わりに42.5℃でインキュベートしたこ
とを主に除いて、Nordic Committee on Food Analysis
（NMKL no.71）によって提案された強化手順を利用する
標準培養プロトコールを用いて、全部で54の未加工サン
プル（例：ブロイラー、ひき肉、卵白および卵黄）が、
サルモネラの存在に関して調べられた。
25gのサンプルを、滅菌したストマッカーバッグ（sto
macher bags）中の225mlのBPWと混合し、15〜20秒間手
動で均質化した。そのバッグを37℃±１℃で18〜24時間
インキュベートした。0.1mlを10mlのRVブイヨンに移
し、42.5℃±0.2℃の水浴中で20〜24時間インキュベー
トした。強化したRVブイヨンから、白金匙量分をBGA上
に線状に塗布した。その寒天プレートを37±１℃でイン
キュベートし、28〜24時間後に検査し、48時間後に再検
査した。もし得られたならば、各プレートからの４〜６
の疑わしいコロニーを、TSI、硫化鉄寒天、リジンブイ
ヨン、ONPGブイヨンに接種し、最終的に多価のＯ−およ
びＨ−血清との凝集によって血清学的に確認した。それ
でもなお疑わしい単離物は、API−20Eシステムを用いて
さらに同定した。
macher bags）中の225mlのBPWと混合し、15〜20秒間手
動で均質化した。そのバッグを37℃±１℃で18〜24時間
インキュベートした。0.1mlを10mlのRVブイヨンに移
し、42.5℃±0.2℃の水浴中で20〜24時間インキュベー
トした。強化したRVブイヨンから、白金匙量分をBGA上
に線状に塗布した。その寒天プレートを37±１℃でイン
キュベートし、28〜24時間後に検査し、48時間後に再検
査した。もし得られたならば、各プレートからの４〜６
の疑わしいコロニーを、TSI、硫化鉄寒天、リジンブイ
ヨン、ONPGブイヨンに接種し、最終的に多価のＯ−およ
びＨ−血清との凝集によって血清学的に確認した。それ
でもなお疑わしい単離物は、API−20Eシステムを用いて
さらに同定した。
54のサンプルが、この発明の手順を用いて平行してテ
ストされた。
ストされた。
25gのサンプルを上記の標準培養法のように混合し、
均質化した。未加工製品を、1.5μg/mlのノボビオシン
を補った225mlのRMと混合した。未加工サンプルの入っ
たRMを、41.5℃±0.2℃の水浴中で19〜24時間インキュ
ベートした。そのサンプルを、MBN中で３時間後強化
し、上記実施例３で記載したELISA−１の技法を用いて
テストした。陽性のサンプルを、RMから10mlのRVブイヨ
ンに0.1ml移し、それを42.5±0.2℃の水浴中で20〜24時
間インキュベートすることによって証明した。RVブイヨ
ンから、白金匙量分をBGA上に線状に塗布し、それを37
±１℃で18〜24時間インキュベートした。疑わしいコロ
ニー（各プレートで１〜３個形成）を、TSIとLIAに接種
し、多価のＯ−およびＨ−血清により血清学的に確認し
た。それでもなお疑わしい単離物は、API−20Eシステム
を用いてさらに同定した。ELISA−１の陽性サンプルが
上記の方法により証明することができなかったときに
は、TTBを選択的強化ブイヨンとして用いて、サルモネ
ラの単離も試みた。RMから1mlを10mlのTTBに移し、42.5
℃で18〜24時間インキュベートし、その後、BGAとXLD上
で継代培養した。疑わしいコロニーを、上記のように試
験した。
均質化した。未加工製品を、1.5μg/mlのノボビオシン
を補った225mlのRMと混合した。未加工サンプルの入っ
たRMを、41.5℃±0.2℃の水浴中で19〜24時間インキュ
ベートした。そのサンプルを、MBN中で３時間後強化
し、上記実施例３で記載したELISA−１の技法を用いて
テストした。陽性のサンプルを、RMから10mlのRVブイヨ
ンに0.1ml移し、それを42.5±0.2℃の水浴中で20〜24時
間インキュベートすることによって証明した。RVブイヨ
ンから、白金匙量分をBGA上に線状に塗布し、それを37
±１℃で18〜24時間インキュベートした。疑わしいコロ
ニー（各プレートで１〜３個形成）を、TSIとLIAに接種
し、多価のＯ−およびＨ−血清により血清学的に確認し
た。それでもなお疑わしい単離物は、API−20Eシステム
を用いてさらに同定した。ELISA−１の陽性サンプルが
上記の方法により証明することができなかったときに
は、TTBを選択的強化ブイヨンとして用いて、サルモネ
ラの単離も試みた。RMから1mlを10mlのTTBに移し、42.5
℃で18〜24時間インキュベートし、その後、BGAとXLD上
で継代培養した。疑わしいコロニーを、上記のように試
験した。
結果を表９に示す。
従って、この発明の組み合わされた方法は、サルモネ
ラを検出することにおいて、標準培養法と少なくとも同
程度の感度がある。偽陽性は、一次選択的強化法が非常
に特異的であることを示しているこの発明の方法を用い
て観察されなかった。
ラを検出することにおいて、標準培養法と少なくとも同
程度の感度がある。偽陽性は、一次選択的強化法が非常
に特異的であることを示しているこの発明の方法を用い
て観察されなかった。
実施例５
方法M1をもちいた、自然に汚染した肉と骨のあらびき
粉、および乾燥した血液アルブミンのサンプルにおける
サルモネラの一次選択的強化と測定 45の肉と骨のあらびき粉のサンプルと、15の乾燥した
血液アルブミンのサンプルからなる合計で60のサンプル
を、以下のようにして、サルモネラの存在に関して調査
した。
粉、および乾燥した血液アルブミンのサンプルにおける
サルモネラの一次選択的強化と測定 45の肉と骨のあらびき粉のサンプルと、15の乾燥した
血液アルブミンのサンプルからなる合計で60のサンプル
を、以下のようにして、サルモネラの存在に関して調査
した。
M1:
各々のサンプルから、10g部分を160mlのBPWに移し
た。サンプルの入ったBPWを、37℃で４時間インキュベ
ートした。次いで、温度を41℃に調節し、インキュベー
ションを15時間続けた。各々の強化ブイヨンから、0.5m
lを10mlのMBNに移し、42℃で３時間インキュベートし
た。次いで、MBNを沸騰水中で15分間加熱し、ELISA−１
検定を行う前に蛇口からの水（tap water）で冷却し
た。ELISAで陽性のサンプルは、一次強化ブイヨン（BP
W）から、0.1mlを10mlのRVブイヨンに移し、1.0mlを10m
lのTTBに移すことによって、証明した。RVおよびTTBを
含むチューブを、43℃で20〜24時間インキュベートし
た。RVおよびTTBから、白金匙量分をBGAおよびXLD上に
線状に塗布し、それらを37℃で18〜24時間インキュベー
トした。疑わしいコロニーを、TSIおよびLIAに接種し、
多価のＯ−血清およびＨ−血清を用いて血清学的に確認
した。それでもなお疑わしい単離物は、API−20Eシステ
ムを用いてさらに同定した。
た。サンプルの入ったBPWを、37℃で４時間インキュベ
ートした。次いで、温度を41℃に調節し、インキュベー
ションを15時間続けた。各々の強化ブイヨンから、0.5m
lを10mlのMBNに移し、42℃で３時間インキュベートし
た。次いで、MBNを沸騰水中で15分間加熱し、ELISA−１
検定を行う前に蛇口からの水（tap water）で冷却し
た。ELISAで陽性のサンプルは、一次強化ブイヨン（BP
W）から、0.1mlを10mlのRVブイヨンに移し、1.0mlを10m
lのTTBに移すことによって、証明した。RVおよびTTBを
含むチューブを、43℃で20〜24時間インキュベートし
た。RVおよびTTBから、白金匙量分をBGAおよびXLD上に
線状に塗布し、それらを37℃で18〜24時間インキュベー
トした。疑わしいコロニーを、TSIおよびLIAに接種し、
多価のＯ−血清およびＨ−血清を用いて血清学的に確認
した。それでもなお疑わしい単離物は、API−20Eシステ
ムを用いてさらに同定した。
さらに、サンプルを、標準培養プロトコールを用いて
調査した。
調査した。
標準プロトコール：
各々のサンプルから10gを、160mlのBPWに移し、37℃
で18〜24時間インキュベートした。次いで、それぞれ強
化ブイヨンの0.1ml部分と1.0ml部分を10mlのRVブイヨン
に移し、1.0mlを10mlのTTBに移した。RVおよびTTBを含
むチューブを、43℃で20〜24時間インキュベートした。
RVおよびTTBから、白金匙量分をBGAおよびXLD上に線状
に塗布し、それらを37℃で18〜24時間インキュベートし
た。疑わしいコロニーを、TSIおよびLIAに接種し、多価
のＯ−血清およびＨ−血清を用いて血清学的に確認し
た。それでもなお疑わしい単離物は、API−20Eシステム
を用いてさらに同定した。
で18〜24時間インキュベートした。次いで、それぞれ強
化ブイヨンの0.1ml部分と1.0ml部分を10mlのRVブイヨン
に移し、1.0mlを10mlのTTBに移した。RVおよびTTBを含
むチューブを、43℃で20〜24時間インキュベートした。
RVおよびTTBから、白金匙量分をBGAおよびXLD上に線状
に塗布し、それらを37℃で18〜24時間インキュベートし
た。疑わしいコロニーを、TSIおよびLIAに接種し、多価
のＯ−血清およびＨ−血清を用いて血清学的に確認し
た。それでもなお疑わしい単離物は、API−20Eシステム
を用いてさらに同定した。
結果を表10に示す。
上記の表から明らかなように、方法M1は、調査した加
工製品サンプルにおいて、標準培養プロトコールよりも
サルモネラの検出に有効である。偽陽性が、M1を用いて
観察されなかったことは顕著なことである。
工製品サンプルにおいて、標準培養プロトコールよりも
サルモネラの検出に有効である。偽陽性が、M1を用いて
観察されなかったことは顕著なことである。
従って、温度を上昇させることによって導入される選
択性は、ELISA法を用いるとき並びに伝統的な培養法（p
lating technique）｛即ち確認培養プロトコール（conf
irmation cultural protocol）｝を用いるとき、サルモ
ネラの検出を改良する。
択性は、ELISA法を用いるとき並びに伝統的な培養法（p
lating technique）｛即ち確認培養プロトコール（conf
irmation cultural protocol）｝を用いるとき、サルモ
ネラの検出を改良する。
実施例６
実施例５のM1法における温度依存性
63の加工食品と飼料のサンプルを、一次選択的強化が
40℃および42℃で行われ、RVSがRVの代りに用いられか
つ42℃でインキュベートされ、かつTTBが42℃でインキ
ュベートされたことを除いて、実施例５のM1に類似の方
法でテストした。
40℃および42℃で行われ、RVSがRVの代りに用いられか
つ42℃でインキュベートされ、かつTTBが42℃でインキ
ュベートされたことを除いて、実施例５のM1に類似の方
法でテストした。
テストしたサンプルのうちの18は、サルモネラが予め
単離された飼料であった。残りの45のサンプルは、９つ
の栽培野菜のサンプル、７つのココアのサンプル、５つ
のペットフードのサンプル、４つの甲殻類のサンプル、
９つの調製食（prepared meals）のサンプル、９つのス
ープのサンプル、および２つの乾燥ココナッツのサンプ
ルからなり、予め調査されなかった。結果を表11に示
す。
単離された飼料であった。残りの45のサンプルは、９つ
の栽培野菜のサンプル、７つのココアのサンプル、５つ
のペットフードのサンプル、４つの甲殻類のサンプル、
９つの調製食（prepared meals）のサンプル、９つのス
ープのサンプル、および２つの乾燥ココナッツのサンプ
ルからなり、予め調査されなかった。結果を表11に示
す。
従って、M1強化法は、加工製品中のサンプルを検出す
ることに関して、40℃〜42℃の温度範囲で一様に有効で
ある。
ることに関して、40℃〜42℃の温度範囲で一様に有効で
ある。
実施例７
方法M2およびM3を用いた、自然に汚染した肉と骨のあら
びき粉、および乾燥した血液アルブミンのサンプルにお
けるサルモネラの一次選択的強化と測定 全部で89の飼料サンプル（そのうちの少数がサルモネ
ラで汚染されていることが提供者によって報告された）
を、以下のようにして、サルモネラの存在に関して調査
した。
びき粉、および乾燥した血液アルブミンのサンプルにお
けるサルモネラの一次選択的強化と測定 全部で89の飼料サンプル（そのうちの少数がサルモネ
ラで汚染されていることが提供者によって報告された）
を、以下のようにして、サルモネラの存在に関して調査
した。
M2:
各々のサンプルから、10g部分を、2.5μg/mlのノボビ
オシンが補われた160mlのBPWに移し、37℃で４時間イン
キュベートした。次いで、温度を41℃に調節し、インキ
ュベーションを15時間続けた。各々の強化ブイヨンか
ら、0.5mlを10mlのMX4に移し、41℃で４時間後強化し
た。次いで、MX4を沸騰水中で15分間加熱し、ELISA−１
検定を行う前に蛇口からの水（tap water）で冷却し
た。ELISAで陽性のサンプルは、一次強化ブイヨン（BP
W）から、0.1mlを10mlのRVSブイヨンに移し、1.0mlを10
mlのTTBに移すことによって、証明した。RVSおよびTTB
を含むチューブを、各々42℃および43℃で20〜24時間イ
ンキュベートした。RVSおよびTTBから、白金匙量分をBG
AおよびXLD上に線状に塗布し、それらを37℃で18〜24時
間インキュベートした。疑わしいコロニーを、TSIおよ
びLIAに接種し、多価のＯ−血清およびＨ−血清を用い
て血清学的に確認した。それでもなお疑わしい単離物
は、API−20Eシステムを用いてさらに同定した。
オシンが補われた160mlのBPWに移し、37℃で４時間イン
キュベートした。次いで、温度を41℃に調節し、インキ
ュベーションを15時間続けた。各々の強化ブイヨンか
ら、0.5mlを10mlのMX4に移し、41℃で４時間後強化し
た。次いで、MX4を沸騰水中で15分間加熱し、ELISA−１
検定を行う前に蛇口からの水（tap water）で冷却し
た。ELISAで陽性のサンプルは、一次強化ブイヨン（BP
W）から、0.1mlを10mlのRVSブイヨンに移し、1.0mlを10
mlのTTBに移すことによって、証明した。RVSおよびTTB
を含むチューブを、各々42℃および43℃で20〜24時間イ
ンキュベートした。RVSおよびTTBから、白金匙量分をBG
AおよびXLD上に線状に塗布し、それらを37℃で18〜24時
間インキュベートした。疑わしいコロニーを、TSIおよ
びLIAに接種し、多価のＯ−血清およびＨ−血清を用い
て血清学的に確認した。それでもなお疑わしい単離物
は、API−20Eシステムを用いてさらに同定した。
M3:
インキュベーション温度を41℃の代りに43℃に上昇さ
せたことを除いて、M2と類似の方法が、同じサンプルの
別のバッチに関して用いられた。
せたことを除いて、M2と類似の方法が、同じサンプルの
別のバッチに関して用いられた。
最終的には、サンプルは、標準培養プロトコールを用
いて調査された： 各々のサンプルから10gを、160mlのBPWに移し、37℃
で18〜24時間インキュベートした。次いで、各々強化ブ
イヨンの0.1ml部分と1.0ml部分を10mlのRVSブイヨンに
移し、1.0mlを10mlのTTBに移した。RVSおよびTTBを含む
チューブを、各々42℃および43℃で20〜24時間インキュ
ベートした。RVSおよびTTBから、白金匙量分をBGAおよ
びXLD上に線状に塗布し、それらを37℃で18〜24時間イ
ンキュベートした。疑わしいコロニーを、TSIおよびLIA
に接種し、多価のＯ−血清およびＨ−血清を用いて血清
学的に確認した。それでもなお疑わしい単離物は、API
−20Eシステムを用いてさらに同定した。
いて調査された： 各々のサンプルから10gを、160mlのBPWに移し、37℃
で18〜24時間インキュベートした。次いで、各々強化ブ
イヨンの0.1ml部分と1.0ml部分を10mlのRVSブイヨンに
移し、1.0mlを10mlのTTBに移した。RVSおよびTTBを含む
チューブを、各々42℃および43℃で20〜24時間インキュ
ベートした。RVSおよびTTBから、白金匙量分をBGAおよ
びXLD上に線状に塗布し、それらを37℃で18〜24時間イ
ンキュベートした。疑わしいコロニーを、TSIおよびLIA
に接種し、多価のＯ−血清およびＨ−血清を用いて血清
学的に確認した。それでもなお疑わしい単離物は、API
−20Eシステムを用いてさらに同定した。
結果を表12に示す。
方法M2は、標準プロトコールの50％のサンプルでサル
モネラを検出する。温度レベルを41℃（M2）の代りに43
℃（M3）に上昇させることによって、陽性サンプルの数
は、標準プロトコールに匹敵するレベルに減少する。し
かしながら、M2を用いるときには２つの偽陽性のサンプ
ルが検出されるが、M3によっては１つの偽陽性が検出さ
れるだけである。従って、インキュベーション温度を上
昇させることによって、選択性は増加するが、感度は減
少する。
モネラを検出する。温度レベルを41℃（M2）の代りに43
℃（M3）に上昇させることによって、陽性サンプルの数
は、標準プロトコールに匹敵するレベルに減少する。し
かしながら、M2を用いるときには２つの偽陽性のサンプ
ルが検出されるが、M3によっては１つの偽陽性が検出さ
れるだけである。従って、インキュベーション温度を上
昇させることによって、選択性は増加するが、感度は減
少する。
実施例８
スパイク（spike）した香辛料のサンプルにおけるサル
モネラの一次選択的強化と測定 全部で８つの香辛料のサンプル（胡椒、カレー、パプ
リカ、粉末のマスタード、タンドゥール）を、以下のよ
うにして調査した： 各々の香辛料サンプルの6.25gの２つの部分を、それぞ
れ2.5μg/mlのノボビオシンが補われた200mlのBPWを含
む２つのフラスコに移した。その部分の１つに、約5CFU
（コロニー形成単位）のサルモネラ パナマ（Salmonel
la panama）で汚染されたミルクパウダーを含むカプセ
ル（そのカプセルは、National Institute of Public H
ealth and Environmental Protection,Bildhoven,オラ
ンダから得られた）を。全てのフラスコを37℃で４時間
インキュベートし、その後インキュベーションを41℃で
15時間続けた。次いで、1mlを、10mlのMBNに移し、42℃
で３時間インキュベートし、次いで沸騰水中で50分間熱
処理した。冷却後、サンプルをELISA−１にかけた。全
サンプル（ELISAで陽性のものと陰性のものの両方）
を、一次強化ブイヨン（BPW）から0.1mlを10mlのRVSブ
イヨンに移すことによって証明した。チューブを、42℃
で20〜24時間インキュベートした。白金匙量分をBGAお
よびXLD上に線状に塗布し、それらを37℃で18〜24時間
インキュベートした。疑わしいコロニーを、TSIおよびL
IAに接種し、多価のＯ−血清およびＨ−血清を用いて血
清学的に確認した。それでもなお疑わしい単離物は、AP
I−20Eシステムを用いてさらに同定した。
モネラの一次選択的強化と測定 全部で８つの香辛料のサンプル（胡椒、カレー、パプ
リカ、粉末のマスタード、タンドゥール）を、以下のよ
うにして調査した： 各々の香辛料サンプルの6.25gの２つの部分を、それぞ
れ2.5μg/mlのノボビオシンが補われた200mlのBPWを含
む２つのフラスコに移した。その部分の１つに、約5CFU
（コロニー形成単位）のサルモネラ パナマ（Salmonel
la panama）で汚染されたミルクパウダーを含むカプセ
ル（そのカプセルは、National Institute of Public H
ealth and Environmental Protection,Bildhoven,オラ
ンダから得られた）を。全てのフラスコを37℃で４時間
インキュベートし、その後インキュベーションを41℃で
15時間続けた。次いで、1mlを、10mlのMBNに移し、42℃
で３時間インキュベートし、次いで沸騰水中で50分間熱
処理した。冷却後、サンプルをELISA−１にかけた。全
サンプル（ELISAで陽性のものと陰性のものの両方）
を、一次強化ブイヨン（BPW）から0.1mlを10mlのRVSブ
イヨンに移すことによって証明した。チューブを、42℃
で20〜24時間インキュベートした。白金匙量分をBGAお
よびXLD上に線状に塗布し、それらを37℃で18〜24時間
インキュベートした。疑わしいコロニーを、TSIおよびL
IAに接種し、多価のＯ−血清およびＨ−血清を用いて血
清学的に確認した。それでもなお疑わしい単離物は、AP
I−20Eシステムを用いてさらに同定した。
結果を表13に示す。
結論として、その方法は、８つのスパイクした香辛料
のサンプルのうちの７つにおいてサルモネラ パナマ
（Salmonella panama）を検出する。残りのスパイクし
たサンプルにおいては、サルモネラは、ELISAによって
も確認手順によっても検出することができなかった。し
かしながら、このことが、カプセルがサルモネラを奪わ
れていたことを示していることは、驚くべきことではな
い。非接種サンプルの１つが、ELISAによって偽陽性の
結果を示した。
のサンプルのうちの７つにおいてサルモネラ パナマ
（Salmonella panama）を検出する。残りのスパイクし
たサンプルにおいては、サルモネラは、ELISAによって
も確認手順によっても検出することができなかった。し
かしながら、このことが、カプセルがサルモネラを奪わ
れていたことを示していることは、驚くべきことではな
い。非接種サンプルの１つが、ELISAによって偽陽性の
結果を示した。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ
Ｃ１２Ｒ 1:42）
(58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名)
C12N 15/00 - 15/90
C12Q 1/00 - 3/00
G01N 33/00 - 33/98
ＥＵＲＯＰＡＴ（ＱＵＥＳＴＥＬ)
ＭＥＤＬＩＮＥ（ＳＴＮ)
ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)
ＰｕｂＭｅｄ
Claims (48)
- 【請求項１】サンプルを、pH5.6〜9.3に緩衝化されてい
るサルモネラ用の水性増殖培地に移し、移す前、移すの
と同時にまたは移した後テトラチオネートおよび／また
は亜セレン酸塩とは異なる別の選択物質を培地に加える
かまたは培地に発生させ、生じた混合物を、サンプルを
移した後、10分〜８時間のあいだの所定時間高くてもせ
いぜい38℃の温度で保持し（前強化時間）、次いでその
混合物の温度を39〜43℃に上昇させ、温度の上昇後、前
強化時間との合計が10〜48時間になるような時間のあい
だ39〜43℃の上昇温度で混合物を保持し（強化時間）、
または ２）サンプルを、pH5.6〜9.3に緩衝化されているサルモ
ネラ用の水性増殖培地に移し、サンプルが加えられた増
殖培地を39〜42.5℃の温度で保持し、移送前、移送と同
時にまたは移送後長くてせいぜい８時間でテトラチオネ
ートおよび／または亜セレン酸塩とは異なる別の選択物
質を培地に加えるかまたは培地に発生させ、生じた混合
物を移送から10〜48時間のあいだの所定時間39〜42.5℃
の温度で保持し（強化時間）、 の何れかからなる強化手順と、 その後、増殖後に強化培地に存在するサルモネラを同定
および／または定量するために測定を行うことからな
り、測定が、標的分子または標的分子を伴う分子相互作
用の同定および／または定量に基づき、かつこの明細書
で定義した伝統的な寒天培養法とは異なる検定工程から
なり、 強化手順の条件が、 選択的強化培地に約15細胞/mlの開始濃度までサルモネ
ラの菌株を接種し、10％のランダムに選択された未加工
のひき肉を強化時間の最初に強化培地に加え、生じた混
合物を強化時間中一つの温度もしくは複数の温度で保持
するという強化手順と測定とからなるテスト（テスト
１）が、測定において、一団のランダムに選択されたサ
ルモネラの血清型をテストしたときに全ケースの少なく
とも90％に陽性の結果を生じ、かつ 接種される非サルモネラ株以外の微生物を実質的に含ま
ない選択的強化培地に約100細胞/mlの開始濃度まで非サ
ルモネラ種である、シトロバクター フレンジ（Citrob
acter freundii）、エシエリヒア コリ（Escherichia
coli）およびエンテロバクター クロアカエ（Enteroba
cter cloacae）のうちの１つの菌株を強化時間の最初に
接種し、生じた混合物を強化時間中一つの温度もしくは
複数の温度で保持するという強化手順と測定とからなる
テスト（テスト２）が、検定において、非サルモネラ種
からランダムに選択された20株の一団をテストしたとき
に各々の種のなかで多くてせいぜい15％の偽陽性のパー
センテージを生じるように、測定に適合されている、サ
ンプル中のサルモネラ属に属する細菌の測定方法。 - 【請求項２】温度が、強化時間の少なくとも実質的な部
分の間、40〜42℃の範囲である請求の範囲第１項記載の
方法。 - 【請求項３】テトラチオネートおよび／または亜セレン
酸塩とは異なる別の選択物質が、長くてせいぜい４時間
で培地に加えられるかまたは培地に発生させられる請求
の範囲第１項または第２項記載の方法。 - 【請求項４】変形２）、即ち移送前、移送と同時にまた
は移送後に培地に加えられるかまたは培地に発生させら
れる唯一の選択物質が、ノボビオシンである前記請求の
範囲１〜３の何れかに記載の方法。 - 【請求項５】生じた混合物中のノボビオシンの濃度が１
〜100μg/mlの範囲である請求の範囲第４項記載の方
法。 - 【請求項６】サンプルを、pH5.6〜9.3に緩衝化されてい
るサルモネラ用の水性増殖培地に移し、移す前、移すの
と同時にまたは移した後長くてせいぜい３時間でテトラ
チオネートを培地に加えるかまたは培地に発生させ、サ
ンプルを移した後10〜48時間のあいだの所定時間（強化
時間）生じた混合物を約36〜39℃の温度で保持すること
からなる強化手順と、 その後、増殖後に強化培地に存在するサルモネラを同定
および／または定量するために測定を行うこととからな
り、測定が、長くてせいぜい７時間の持続時間を有し、
標的分子または標的分子を伴う分子相互作用の同定およ
び／または定量に基づき、かつ伝統的な寒天培養法とは
異なる検定工程からなり、 強化手順の条件が、請求の範囲第１項に定義のテスト１
が、測定において、一団のランダムに選択されたサルモ
ネラの血清型をテストしたときに全ケースの少なくとも
90％に陽性の結果を生じ、かつ 請求の範囲第１項に定義のテスト２が、検定において、
非サルモネラ種からランダムに選択された20株の一団を
テストしたときに各々の種のなかで多くてせいぜい15％
の偽陽性のパーセンテージを生じるように、測定に適合
されている、サンプル中のサルモネラ属に属する細菌の
測定方法。 - 【請求項７】温度が、強化時間の少なくとも実質的な部
分の間、36〜39℃の範囲である請求の範囲第６項記載の
方法。 - 【請求項８】テトラチオネートが、移送後長くてせいぜ
い１時間で培地に加えられるかまたは培地に発生させら
れる請求の範囲第６項または第７項記載の方法。 - 【請求項９】測定が、標準プロトコールと比べて少なく
とも80％の真正陽性の結果を生じ、かつ100個のひき肉
のサンプルをテスト（テスト３）したときに多くてせい
ぜい10％の偽陽性の結果を生じ、２つの方法の各々によ
ってテストされるサンプル部分の重さが25gであり、100
個のサンプルが、10の異なるサンプルを配達する10の異
なる小売店から提供され、提供されたサンプルのうちの
20に、サンプル当たり約15のサルモネラ チフィムリウ
ム（Salmonella typhimurium）細胞を接種し、かつ提供
されたサンプルのうちの20に、サンプル当たり約15のサ
ルモネラ エンテリティティス（Salmonella enteritit
is）細胞を接種するような方法で、ラパポルト−バシリ
アディスブイヨン（Oxoid CM866）（RVS）がラパポルト
−バシリアディスブイヨン（Merck 7700）（RV）の代り
に用いられ、かつRVSが42℃でインキュベートされ、ま
たキシロースリジンデソキシコレート寒天（Gibco 152
−05600/Oxoid CM469）（XLD）がプレーティング培地と
して用いられることを除いて、標準プロトコールNMKL n
o.71（Nordic Committee on Food Analysis method no.
71,1991,第４版、第17刷）に対して較正が行われる前記
請求の範囲１〜８の何れかに記載の方法。 - 【請求項１０】サンプルが、加工製品とは異なるもので
ある前記請求の範囲１〜９の何れかに記載の方法。 - 【請求項１１】測定が、テスト３において、標準プロト
コールと比べて少なくとも85％の真正陽性の結果を生じ
る請求の範囲第９項または第10項に記載の方法。 - 【請求項１２】測定が、テスト３において、標準プロト
コールと比べて少なくとも101％の真正陽性の結果を生
じる請求の範囲第11項記載の方法。 - 【請求項１３】測定が、テスト３において、多くてせい
ぜい８％の偽陽性の結果を生じる請求の範囲第９〜12項
の何れかに記載の方法。 - 【請求項１４】測定が、テスト３において、偽陽性の結
果を生じない請求の範囲第13項記載の方法。 - 【請求項１５】測定が、テスト１の全ケースにおいて、
少なくとも92％の真正陽性の結果を生じる前記請求の範
囲１〜14の何れかに記載の方法。 - 【請求項１６】測定が、テスト２において、多くてせい
ぜい12％の偽陽性の結果を生じる前記請求の範囲１〜15
の何れかに記載の方法。 - 【請求項１７】生じた混合物中のテトラチオネートの濃
度が、約５〜40mMの範囲である前記請求の範囲１〜16の
何れかに記載の方法。 - 【請求項１８】強化手順と測定工程の合計時間が、長く
てせいぜい56時間の持続時間を有する前記請求の範囲１
〜17の何れかに記載の方法。 - 【請求項１９】強化時間の持続時間、または変形１）に
関して前強化時間と強化時間の合計が、10〜48時間であ
る前記請求の範囲１〜18の何れかに記載の方法。 - 【請求項２０】ａ）サンプルを、pH5.6〜9.3に緩衝化さ
れ、かつ細菌の増殖を阻害する物質を実質的に含まない
サルモネラ用の水性増殖培地に移し、生じた混合物を１
〜８時間のあいだの所定時間高くてせいぜい39.0℃の温
度で保持し（前強化時間）、次いで 混合物の温度を39.5〜43℃に上昇させ、任意にノボビオ
シンおよび／または亜セレン酸塩とは異なる別の選択物
質を加え、 混合物を、温度を上昇させてから、前強化時間との合計
が10〜48時間になるような時間のあいだ39.5〜43℃の上
昇温度で保持し（選択的強化時間）、またはｂ）サンプ
ルを、pH5.6〜9.3に緩衝化されているサルモネラ用の水
性増殖培地に移し、移す前、移すのと同時にまたは移し
た後ノボビオシンおよび／または亜セレン酸塩とは異な
る別の選択物質を培地に加え、生じた混合物を、移送も
しくはノボビオシンまたは亜セレン酸塩とは異なる別の
選択物質の添加のうちどちらか遅いほうから１〜８時間
のあいだの所定時間高くてせいぜい39.0℃の温度で保持
し（前強化時間）、次いで 混合物の温度を39.5〜43℃に上昇させ、任意にノボビオ
シンまたは亜セレン酸塩とは異なる別の選択物質を加
え、 混合物を、温度を上昇させてから前強化時間との合計が
10〜48時間になるような時間のあいだ39.5〜43℃の上昇
温度で保持する（選択的強化時間） 何れかからなる強化手順を行い、 次いで、増殖後に強化培地に存在するサルモネラを同定
および／または定量するために測定を行うことからな
る、 サンプル中のサルモネラ属に属する細菌の測定方法。 - 【請求項２１】前強化時間の持続時間が、少なくとも1/
2時間である請求の範囲第20項記載の方法。 - 【請求項２２】サンプルを、pH5.6〜9.3に緩衝化されて
いるサルモネラ用の水性増殖培地に移し、移す前、移す
のと同時にまたは移した後ノボビオシンを培地に加え、
生じた混合物を、移送もしくはノボビオシンまたは亜セ
レン酸塩とは異なる別の選択物質の添加のうちどちらか
遅いほうから10〜48時間のあいだの所定時間高くてせい
ぜい39.0℃の温度で保持する（強化時間）ことからなる
強化手順を行い、 次いで、増殖後に強化培地に存在するサルモネラを同定
および／または定量するために、長くてせいぜい７時間
の持続時間を有する測定を行うことからなる、サンプル
中のサルモネラ属に属する細菌の測定方法。 - 【請求項２３】測定が、標的分子または標的分子を伴う
分子相互作用の同定および／または定量に基づき、かつ
寒天培養とは異なる検定工程からなる請求の範囲第20〜
22項の何れかに記載の方法。 - 【請求項２４】強化手順の条件が、 − 水性増殖培地に、約1000個の熱処理した細胞/mlの
開始濃度までサルモネラの菌株の熱処理した細胞を植え
付け、５％の脂肪を含まない乾燥ミルクを強化手順の最
初に培地に加えるという、強化手順と測定とからなるテ
スト（テスト４）が、測定において、一団のランダムに
選択されたサルモネラの血清型をテストしたときに、全
ケースの90％に陽性の結果を生じ、かつ − 水性増殖培地に、強化手順の最初に約100細胞/mlの
開始濃度まで非サルモネラ種である、シトロバクター
フレンジ、エシエリヒア コリおよびエンテロバクター
クロアカエのうちの１つの菌株を接種するという、強
化手順と測定とからなるテスト（テスト５）が、測定に
おいて、非サルモネラ株の20のランダムに選択された種
の一団の各々の種のなかで、多くてせいぜい25％の偽陽
性のパーセンテージを生じるように、測定に適合される
請求の範囲第20〜23項の何れかに記載の方法。 - 【請求項２５】測定が、標準プロトコールと比べて少な
くとも80％の真正陽性の結果を生じ、かつバッチとタイ
プに関してランダムに選択された50gのミルクパウダー
の合計50のサンプルをテスト（テスト６）したときに多
くてせいぜい10％の偽陽性の結果を生じ、各々のサンプ
ルが１セットの２つの25g部分に分割され、各々のセッ
トの１つの部分がサンプルとして請求の範囲第21〜24項
の何れかに記載の方法に付され、各々のセットの他の部
分がサンプルとして標準培養プロトコールに付され、25
g部分の50のセットのうちの25が： − 標準培養プロトコールに付されるセットの１つの25
g部分が、そのプロトコールの強化手順の最初に、約5CF
Uのサルモネラ パナマ（Salmonella panama）またはサ
ルモネラ チフィムリウムを含む0.1〜1gの脂肪を含ま
ない乾燥ミルクをプロトコールに用いる水性増殖培地に
加えることによって補われ、 − 請求の範囲第21〜24項の何れかの方法に付されるセ
ットの他の25g部分が、強化手順の最初に、約5CFUのサ
ルモネラ パナマまたはサルモネラ チフィムリウムを
含む0.1〜1gの脂肪を含まない乾燥ミルクを水性増殖培
地に加えることによって補われる、 方法にスパイクされるというような方法で、標準培養プ
ロトコールNMKL no.71（Nordic Committee on Food Ana
lysis method no.71,1991,第４版、第17刷）に対して較
正が行われる請求の範囲第20〜24項の何れかに記載の方
法。 - 【請求項２６】測定が、テスト６において、標準プロト
コールと比べて少なくとも85％の真正陽性の結果を生じ
る請求の範囲第25項記載の方法。 - 【請求項２７】測定が、テスト６において、標準プロト
コールと比べて少なくとも101％の真正陽性の結果を生
じる請求の範囲第26項記載の方法。 - 【請求項２８】測定が、テスト６において、多くてせい
ぜい８％の偽陽性の結果を生じる請求の範囲第25〜27項
の何れかに記載の方法。 - 【請求項２９】測定が、テスト６において、偽陽性の結
果を生じない請求の範囲第28項記載の方法。 - 【請求項３０】強化手順と測定工程の合計時間が、長く
てせいぜい56時間の持続時間を有する請求の範囲第20〜
29項の何れかに記載の方法。 - 【請求項３１】測定が、テスト４の全ケースにおいて、
少なくとも92％の真正陽性の結果を生じる請求の範囲第
20〜30項の何れかに記載の方法。 - 【請求項３２】測定が、テスト５において、多くてせい
ぜい20％の偽陽性の結果を生じる請求の範囲第20〜31項
の何れかに記載の方法。 - 【請求項３３】サンプルが、加工製品である請求の範囲
第20〜32項の何れかに記載の方法。 - 【請求項３４】強化時間の持続時間、または変形ａ）も
しくはｂ）に関して前強化時間と選択的強化時間の合計
が、10〜48時間である請求の範囲第20〜33項の何れかに
記載の方法。 - 【請求項３５】測定工程が、免疫学的反応からなる前記
請求の範囲１〜34の何れかに記載の方法。 - 【請求項３６】測定工程が、例えば放射線免疫検定法
（RIA）、酵素免疫検定法（EIA）、酵素結合イムノソル
ベント検定法（ELISA）、蛍光抗体法（FA）および検出
段階でリポソーム、ミセルもしくはリポソーム様粒子を
用いることからなる免疫検定法のような免疫検定法； 免疫固定化を伴う検定法； ラテックス凝集のような免疫凝集を伴う検定法； DNA/DNAハイブリッド形成検定法； RNA/RNAハイブリッド形成検定法；及び DNA/RNAハイブリッド形成検定法からなる群から選択さ
れる検定法からなる請求の範囲第35項記載の方法。 - 【請求項３７】測定工程が、ポリメラーゼ連鎖反応（PC
R）からなる請求の範囲第１〜34項の何れかに記載の方
法。 - 【請求項３８】測定工程が、ペプチド核酸（RNA）を用
いることからなる請求の範囲第１〜34項の何れかに記載
の方法。 - 【請求項３９】測定工程が、レクチンを用いることから
なる請求の範囲第１〜34項の何れかに記載の方法。 - 【請求項４０】測定工程が、バクテリオファージを用い
ることからなる請求の範囲第１〜34項の何れかに記載の
方法。 - 【請求項４１】測定工程が、サルモネラを含む培地の電
気抵抗またはインピーダンスの変化を起こす物質のサル
モネラによる代謝変換からなり、サルモネラの検出が、
この変化を測定することによって達せられる請求の範囲
第１〜34項の何れかに記載の方法。 - 【請求項４２】測定工程が、寒天マトリックス上もしく
は寒天マトリックスを介して移動するサルモネラの能力
に関する検定法からなる請求の範囲第１〜34項の何れか
に記載の方法。 - 【請求項４３】測定工程が、細菌が培地から分離され、
フィルター上に保持される濾過工程を伴う検定法からな
る請求の範囲第１〜34項の何れかに記載の方法。 - 【請求項４４】測定工程が、放射分析法を伴う検定法か
らなる請求の範囲第１〜34項の何れかに記載の方法。 - 【請求項４５】測定工程が、クロマトグラフィーによる
分離を伴う検定法からなる請求の範囲第１〜34項の何れ
かに記載の方法。 - 【請求項４６】測定工程が、選択的後強化を伴う前記請
求の範囲１〜45の何れかに記載の方法。 - 【請求項４７】選択的後強化が、２〜６時間の持続時間
を有する請求の範囲第46項に記載の方法。 - 【請求項４８】サルモネラ用の水性増殖培地が、多くて
もせいぜい0.5％w/vの亜セレン酸水素ナトリウム溶液中
の亜セレン酸塩濃度に対応する亜セレン酸塩濃度を有す
る前記請求の範囲１〜47の何れかに記載の方法。
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|---|---|---|---|
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