CN113866421B - 一种黄曲霉毒素产毒真菌的产毒力指示分子快检试剂盒及其用途 - Google Patents

一种黄曲霉毒素产毒真菌的产毒力指示分子快检试剂盒及其用途 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种黄曲霉毒素产毒真菌的产毒力指示分子快检试剂盒及其用途。包括孔底包被有指示黄曲霉毒素产毒菌产毒力的分子的纳米抗体或单克隆抗体的酶标板、指示黄曲霉毒素产毒菌产毒力的分子的多克隆抗体、起标准物质作用的指示黄曲霉毒素产毒菌产毒力的分子纯品溶液、察氏培养基、辣根过氧化物酶标记抗体、ELISA显色液与终止液、样品稀释液；所述的指示黄曲霉毒素产毒菌产毒力的分子是指AFT‑YJFZP008肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。可用于快速定量检测指示黄曲霉毒素产毒菌产毒力的分子AFT‑YJFZP008，可用于鉴别比较曲霉属黄曲霉毒素产毒菌株产黄曲霉毒素能力，易操作，实用性强，容易推广应用。

Description

一种黄曲霉毒素产毒真菌的产毒力指示分子快检试剂盒及其 用途
技术领域
本发明涉及黄曲霉毒素产毒真菌的产毒力指示分子快检试剂盒及用途。
背景技术
黄曲霉毒素毒性强、危害大，是污染食品种类最多的污染物，近年总体呈现污染加重趋势，严重威胁食品安全和人民健康。黄曲霉毒素是自然界毒性最强的一类真菌毒素，其中黄曲霉毒素B1 是国际癌症研究组织（International Agency for Research onCancer, IARC）认定的I 类致癌物，已引发过多起人畜群体中毒事件，成为肝癌病例高发的主要原因之一。根据近5 年Web of Science 检索数据统计：黄曲霉毒素污染食品及原料种类超过了110 种，高居污染物首位。然而，迄今国内外仍没有黄曲霉毒素等微生物毒素污染前的分子预警研究范例，难以满足事前预警的迫切需求。
现有黄曲霉毒素预警方法主要是基于黄曲霉毒素检测技术建立，用于毒素污染水平评价或产后污染程度与消费风险评估，一旦检测发现，污染往往已经发生，难以满足事前预警与指导防控的迫切要求。利用黄曲霉毒素检测技术开展污染预警，是欧美等发达国家开展食品安全监管的成功经验。欧盟食品和饲料快速预警系统（Rapid Alert System forFood and Feed，RASFF）就是利用限量标准与检测获得食品与饲料中黄曲霉毒素含量，对各国输入欧盟的食品与饲料进行快速预警。美国研究机构基于黄曲霉毒素检测技术与污染监测数据，研究建立了多元罗吉斯蒂回归分析和叠加高斯处理等预警模型，主要用于评估产后玉米等农产品真菌毒素污染程度与消费风险。
综合国内外近二十年研究进展，当前黄曲霉毒素早期预警分子检测技术缺乏是根本原因。针对这一瓶颈难题，发明人团队经过十多年攻关研究，成功发现了一种指示黄曲霉毒素产毒菌产毒力的分子及其早期预警作用，成为首个早期预警分子，在此基础上成功发明了黄曲霉毒素产毒真菌的产毒力指示分子快检试剂盒，并用于鉴别菌株产黄曲霉毒素能力——即产毒力，以及用于发现农田、农产品及饲料中是否存在强产毒力的黄曲霉毒素产毒菌株，为及时发现黄曲霉毒素污染风险与早防早控提供科学依据。
发明内容
本发明针对现有技术存在的不足，提供一种黄曲霉毒素产毒真菌的产毒力指示分子快检试剂盒及其用途，其用于鉴别曲霉属菌株产黄曲霉毒素能力和鉴别农田、农产品、中药材、饲料等产品中是否存在强产毒力的黄曲霉毒素产毒菌株，容易推广应用。
为解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案为：
提供黄曲霉毒素产毒真菌的产毒力指示分子快检试剂盒，包括孔底包被有指示黄曲霉毒素产毒菌产毒力的分子AFT-YJFZP008的纳米抗体或单克隆抗体的酶标板、指示黄曲霉毒素产毒菌产毒力的分子AFT-YJFZP008的多克隆抗体、起标准物质作用的指示黄曲霉毒素产毒菌产毒力的分子AFT-YJFZP008纯品溶液、察氏培养基或其他适宜产毒黄曲霉菌生长的培养基、与指示黄曲霉毒素产毒菌产毒力的分子AFT-YJFZP008多克隆抗体发生结合反应的辣根过氧化物酶标记抗体、ELISA显色液与终止液、样品稀释液；
所述的指示黄曲霉毒素产毒菌产毒力的分子是指AFT-YJFZP008肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1 所示。
按上述方案，所述的孔底包被有指示黄曲霉毒素产毒菌产毒力的分子AFT-YJFZP008的纳米抗体或单克隆抗体的酶标板，是通过如下方法制备获得：将上述AFT-YJFZP008的纳米抗体或单克隆抗体溶解在ELISA包被缓冲液中，形成0.2-8.0 μg/mL的包被液，再加入至酶标板中（以100-200 μL/孔），4 ℃放置过夜或者37 ℃放置不少于2 h后，去除上述酶标板中包被液，再用ELISA常规洗液洗涤酶标板；然后加入ELISA常规封闭液（每孔加200-300 μL），放置室温或37 ℃封闭不少于1 h后，再弃去封闭液，再用ELISA常规洗液洗涤酶标板。
所述的ELISA包被缓冲液是指常规碳酸盐缓冲液，配制方法为：称取NaHCO31.465g、Na2CO30.795 g, 加入去离子水定容至500 mL即可。
上述方案中，指示黄曲霉毒素产毒菌产毒力的分子AFT-YJFZP008的多克隆抗体为指示黄曲霉毒素产毒菌产毒力的分子AFT-YJFZP008兔源多克隆抗体，所述的辣根过氧化物酶标记抗体为辣根过氧化物酶标记羊抗兔抗体。
上述方案中，指示黄曲霉毒素产毒菌产毒力的分子AFT-YJFZP008的多克隆抗体与指示黄曲霉毒素产毒菌产毒力的分子AFT-YJFZP008的纳米抗体或单克隆抗体的动物源不同，具体可利用研究获得的指示黄曲霉毒素产毒菌产毒力的分子直接用作抗原，制备获得纳米抗体或单克隆抗体、以及兔源多克隆抗体；
所述的指示黄曲霉毒素产毒菌产毒力的分子AFT-YJFZP008的纳米抗体或单克隆抗体，可利用AFT-YJFZP008作为免疫抗原，采用常规方式免疫羊驼或者Balb/c鼠，再利用已知常规的纳米抗体或鼠源单克隆抗体制备技术方案即可制备获得。
所述的指示黄曲霉毒素产毒菌产毒力的分子AFT-YJFZP008的兔源多克隆抗体，可利用AFT-YJFZP008作为免疫抗原，采用常规方式免疫新西兰大白兔等试验兔，再利用已知常规的兔多克隆抗体制备技术方案即可制备获得。
所述的察氏培养基为常规察氏培养基，可以自配，也可以直接购买商品获得。
所述的辣根过氧化物酶标记羊抗兔抗体可以直接购买商品获得。
按上述方案，所述的ELISA显色液是指ELISA常规的双氧水与TMB显色液。
所述的终止液是指ELISA常规的显色终止液：2mol/L硫酸水溶液，配制方法为：取44 mL浓硫酸加入到300 mL去离子水中，搅拌到冷却，最后定容至400 mL即可。
所述的样品稀释液是指含有0.1%山梨醇和绵糖的0.01 mol/L 磷酸盐缓冲液，配制方法为：山梨醇与糖各0.5 g、NaCL 4.0 g、Na2HPO4∙12H2O 1.45 g、KCL 0.1g、KH2PO40.1g，加入去离子水定容至500 mL。
提供上述黄曲霉毒素产毒真菌的产毒力指示分子快检试剂盒在鉴别曲霉属菌株产黄曲霉毒素能力或鉴别农田、农产品及饲料中是否存在强产毒力的黄曲霉毒素产毒菌株中的应用。
应用方法：
用试剂盒中的察氏培养基适宜产毒黄曲霉菌生长的培养基培养并制备待鉴别菌株或待鉴别样品的待测液；
将待鉴别菌株的待测液用样品稀释液稀释，将稀释后待鉴别菌株的待测液或上述待鉴别样品的待测液，以每孔100-200 μL加入到试剂盒中的酶标板孔中，放置室温或37 ℃反应不少于1 h后，弃去反应后液体，洗涤酶标板;
然后加入试剂盒中AFT-YJFZP008多克隆抗体，每孔加入100-200μL，放置室温或37℃反应不少于1 h后，弃去液体，再洗涤酶标板;
然后每孔加入试剂盒中的辣根过氧化物酶标记抗体100-200μL，放置室温或37 ℃反应不少于1 h后，弃去液体，再洗涤酶标板，
然后先后加入试剂盒中的ELISA显色液、终止液，最后通过酶标仪读取并计算待测样品中AFT-YJFZP008的浓度。
按上述方案，上述方法还包括：检测结果评判：根据酶标仪结果，获得单位体积黄曲霉待测液中指示黄曲霉毒素产毒菌产毒力的分子AFT-YJFZP008的含量，分析待鉴别菌株的黄曲霉毒素产毒力。如果待鉴别菌株中指示黄曲霉毒素产毒菌产毒力的分子AFT-YJFZP008浓度越高，则说明鉴别菌株产黄曲霉毒素能力即产毒力越强；
根据酶标仪结果，获得单位体积待鉴别样品液中指示黄曲霉毒素产毒菌产毒力的分子AFT-YJFZP008的含量，判定待鉴别样品中是否含有黄曲霉毒素的强产毒力菌株。如果待鉴别样品中指示黄曲霉毒素产毒菌产毒力的分子AFT-YJFZP008浓度高，则说明待鉴别样品中含有黄曲霉毒素的强产毒力菌株。
按上述方案，用系列浓度的起标准物质作用的指示黄曲霉毒素产毒菌产毒力的分子AFT-YJFZP008纯品溶液（每孔100-200 μL），替换待测液，用于制作标准曲线，计算得到待测样品中AFT-YJFZP008的浓度。
按上述方案，上述待鉴别菌株的待测液的制备：待鉴别菌株培养，获得待鉴别菌株的待测液；具体可为：将待鉴别菌株在常规察氏培养基或者其他适宜菌株生长的培养基培养，培养的环境温度为15 ~ 35 ℃，培养时间不少于12 h后，取培养基与培养物的混合体充分匀浆，再用无菌水稀释1-10倍，获得待鉴别菌株的待测液；
上述待鉴别样品液的制备：待鉴别样品培养，稀释，获得待鉴别样品的待测液；
具体可为：称量待鉴别样品，转移至样品稀释液中，室温震荡至均匀，制成待测样品均匀分散液，取 10-1000 µL样品均匀分散液加在含6-600 mL常规察氏培养基或者其他适宜产毒黄曲霉菌生长的培养基中，置于15-35°C下200±50 rpm震荡培养，培养6-24 h后取样，形成待鉴别样品的待测液。
按上述方案，上述样品为农田、农产品、中药材、饲料等产品。
所述试剂盒可用于鉴别曲霉属菌株产黄曲霉毒素能力，待鉴别菌株中指示黄曲霉毒素产毒菌产毒力的分子含量越高，则说明鉴别菌株产黄曲霉毒素能力即产毒力越强；所述试剂盒可用于鉴别农田、农产品、中药材、饲料等产品中是否存在强产毒力的黄曲霉毒素产毒菌株，待鉴别样品中如果指示黄曲霉毒素产毒菌产毒力的分子含量高，则说明待鉴别样品中含有黄曲霉毒素的强产毒力菌株；
所述的黄曲霉菌株产毒力是衡量菌株产生黄曲霉毒素能力的指标，菌株产毒力越强，表明该菌株在相同时间和培养条件下能够产生黄曲霉毒素的量越多。本发明利用研究获得的指示黄曲霉毒素产毒菌产毒力的分子，结合指示黄曲霉毒素产毒菌产毒力的分子AFT-YJFZP008的纳米抗体或单克隆抗体、以及兔源多克隆抗体，并由这些抗体构建成夹心免疫检测方法，并最终组装成试剂盒；试剂盒的应用中，利用指示黄曲霉毒素产毒菌产毒力的分子测定浓度与菌株产毒力成正相关的特征，从而用于鉴别曲霉属菌株产黄曲霉毒素能力和鉴别农田、农产品及饲料中是否存在强产毒力的黄曲霉毒素产毒菌株的用途，实用且易推广用，为及时发现黄曲霉毒素污染风险与早防早控提供了关键抓手与科学依据，对促进农业产业高质量发展与保障食品安全具有重要意义。
本发明有益效果在于：
1.提供了用于黄曲霉毒素产毒真菌的产毒力指示分子快检试剂盒，可用于快速定量检测指示黄曲霉毒素产毒菌产毒力的分子AFT-YJFZP008，2.可用于鉴别比较曲霉属黄曲霉毒素产毒菌株产黄曲霉毒素能力，3.可用于鉴别农田、农产品及饲料中是否存在强产毒力的黄曲霉毒素产毒菌株，4.易操作，实用性强，容易推广应用，5.对促进农业产业高质量发展与保障食品安全具有重要意义。
具体实施方式
实施例1 试剂盒中可起标准物质作用的指示黄曲霉毒素产毒菌产毒力的分子AFT-YJFZP008的制备
按照如下配方配置察氏培养基：3%（w/v）蔗糖，0.3%（w/v）NaNO3，0.1%（w/v）K2HPO4，0.05%（w/v）MgSO4·7H2O，0.05%（w/v）KCl，0.001%（w/v）FeSO4，pH6.5，配置获得察氏培养基。随机选取公开文献《中国典型花生产区黄曲霉菌分布、产毒力与侵染研究》——中国农业科学院硕士学位论文，作者张杏，第33页——公布的产毒菌株HLJ-1、HeNZY-2、HuBha-24、JXZS-29-2、LNct-6、GXfc-34、GDZJ-122-2、JSnt-1、HuNdx-7、HBHA-8-17等10株，分别接种到上述察氏培养基中，于28℃ 200 rpm/min培养5天后，常规方法充分匀浆、破碎细胞，再用常规的蛋白质纯化系统、蛋白质电泳、免疫亲和等方法，即可纯化获得指示黄曲霉毒素产毒菌产毒力的分子AFT-YJFZP008。试验结果表明，上述产毒菌株培养物中均可以制备得到AFT-YJFZP008，在同样培养条件下，HBHA-8-17制备得到AFT-YJFZP008的量最多，而HLJ-1制备得到AFT-YJFZP008的量最少。
所述的免疫亲和方法，是指用上样液稀释黄曲霉毒素产毒菌细胞破碎液，经常规滤纸过滤后，再连续加到上述免疫亲和柱中，待基本流尽时，再免疫亲和柱常规淋洗液洗涤柱体，最后用pH 2.2的甘氨酸缓冲液或者70%甲醇水溶液洗脱，收集洗脱液后通过常规超滤离心方法及时去除溶液，再用无菌水从超滤离心管中溶解出留在超滤离心管内的蛋白质，即可获得指示黄曲霉毒素产毒菌产毒力的分子AFT-YJFZP008水溶液。
指示黄曲霉毒素产毒菌产毒力的分子AFT-YJFZP008的初始获得用发掘方法：
用于发掘黄曲霉菌株产毒力指示分子AFT-YJFZP008的方法如下：
（1）取黄曲霉强产毒力菌株，培养获得菌株培养物和胞外分泌蛋白质混合物；然后将菌株培养物细胞破碎，获得胞内蛋白质混合物；将上述胞外分泌蛋白质混合物和胞内蛋白质混合物合并，加入碳二亚胺偶联获得黄曲霉抗原；
（2）将上述黄曲霉抗原免疫试验动物，获得纳米抗体库或单克隆抗体库；
（3）获得不同产毒力的黄曲霉菌株的蛋白质合并溶液，利用步骤（2）获得的抗体库中的抗体，检测不同产毒力的黄曲霉菌株的蛋白质，获得系列检测信号；
（4）找出检测信号与上述黄曲霉菌株产毒力呈现正相关的纳米抗体，即黄曲霉菌株产毒力指示分子抗体，与黄曲霉菌株产毒力指示分子抗体对应的蛋白质即发掘出的黄曲霉菌株产毒力指示分子。
上述方案中，步骤（1）的黄曲霉强产毒力菌株是通过常规方法从自然界分离、鉴定，或者通过人工改造获得，其产毒力经NY/T 2311—2013标准方法鉴定结果不小于10 µg/kg。
步骤（3）中所述的不同产毒力的黄曲霉菌株不少3株，其产毒力经NY/T 2311—2013标准方法鉴定结果呈现为高、中、低至少3个层次。
所述的黄曲霉强产毒力菌株培养中采用的培养基为察氏培养基或者其他可供黄曲霉正常生长的营养物，培养时间不少于12 h，培养的环境温度为15 ~ 35 ℃。
所述的菌株培养物细胞破碎是通过常规液氮研磨或者细胞破碎仪等方法。
所述的碳二亚胺的用量为每1.0 mL合并的胞外分泌蛋白质混合物和胞内蛋白质混合物中，加入碳二亚胺量为0.005 ~ 0.1 g。
所述的偶联反应指在15~37℃反应2 ~ 6 h，在4~ 10℃反应过夜。
所述的免疫是常规免疫方式，接种黄曲霉抗原。所述的试验动物是指小白鼠或者羊驼或者其他具有相似效果的试验动物。
按上述方案，所述的抗体制备流程是指常规的纳米抗体制备技术流程或者常规的基于细胞融合的杂交瘤单克隆抗体制备技术流程。
按上述方案，所述的检测不同产毒力的黄曲霉菌株的蛋白质是指采用常规的Western Blot技术流程，即将不同产毒力的黄曲霉菌株的蛋白质移至硝酸纤维素膜上，再利用上述抗体库中抗体，经直接方法或者间接方法检测，或者采用具有类似功效的其他技术流程。
按上述方案，上述直接方法是指将上述抗体库中抗体通过常规方法与信号材料偶联，再与上述移至硝酸纤维素膜上的相应蛋白质发生免疫结合反应。
按上述方案，上述间接方法是指将上述抗体库中抗体先与上述移至硝酸纤维素膜上的相应蛋白质发生免疫结合反应，然后再利用第二抗体与信号材料偶联物与上述结合到硝酸纤维素膜上的抗体发生免疫结合反应。
上述检测中信号材料是辣根过氧化物酶或者是胶体金或者是荧光材料或者是具有类似功效的其他材料。检测信号是显色反应信号或者是斑点信号或者是荧光信号。
实施例2 指示黄曲霉毒素产毒菌产毒力的分子AFT-YJFZP008的纳米抗体制备
利用AFT-YJFZP008作为免疫抗原，采用常规方式免疫羊驼或者Balb/c鼠，再利用已知常规的纳米抗体或鼠源单克隆抗体制备技术方案即可研制获得。
将上述制备获得的AFT-YJFZP008溶解在常规PBS缓冲液或者生理盐水中至浓度不低于0.1 mg/mL，再和弗氏完全佐剂等体积混合乳化，通过背部皮下或皮内多点注射方式免疫羊驼，之后每隔2-4周加强免疫1次，加强免疫时用弗氏不完全佐剂替换弗氏完全佐剂。采用常规ELISA流程监测免疫效果，至羊驼血清效价不再上升后，随后对免疫羊驼的静脉取血、提取总RNA、合成cDNA、VHH基因的扩增、VHH基因片段的回收、VHH基因与双酶切处理的pCANTAB 5 E（his）载体的连接、连接产物电转化、构建纳米抗体基因库以及纳米抗体基因库的拯救等操作按照专利文献CN103866401A的方法完成，最终获得拯救后的纳米抗体基因库。
将上述制备获得的AFT-YJFZP008按8μg/孔、2μg/孔、0.5μg/孔、0.1μg/孔的梯度固定在96孔酶标板等固相载体上，按照专利文献CN103866401A的方法对上述拯救后的纳米抗体基因库进行2-4次淘选，再用AFT-YJFZP008和间接非竞争ELISA鉴定每一噬菌体克隆产生的抗体，阳性结果对应的噬菌体为噬菌体阳性克隆，再将此阳性克隆通过纳米抗体制备的常规方式制备出纳米抗体，即为AFT-YJFZP008的纳米抗体，用于进一步应用研究工作，优选经ELISA方法表征，具有特异性强、亲和力高的纳米抗体。
实施例3 指示黄曲霉毒素产毒菌产毒力的分子AFT-YJFZP008的单克隆抗体制备
利用AFT-YJFZP008作为免疫抗原，采用常规方式免疫羊驼或者Balb/c鼠，再利用已知常规的纳米抗体或鼠源单克隆抗体制备技术方案即可研制获得。
将上述制备获得的AFT-YJFZP008溶解在常规PBS缓冲液或者生理盐水中至浓度不低于0.1 mg/mL，再和弗氏完全佐剂等体积混合乳化，通过背部皮下或皮内多点注射方式BALB/c鼠，之后每隔2-4周加强免疫1次，加强免疫时用弗氏不完全佐剂替换弗氏完全佐剂。采用常规ELISA流程监测免疫效果，至BALB/c鼠血清效价不再上升后，随后分离免疫小鼠脾细胞、脾细胞与鼠源骨髓瘤细胞SP2/0融合、半固体培养基对杂交瘤细胞的选择性培养操作参考专利文献CN103849604A的方法完成，待半固体培养基上长出针尖白色斑点后，将白色斑点分别挑取到内置杂交瘤常规培养基的96孔培养板，从而获得单克隆杂交瘤资源库。
参考专利文献CN103849604A的方法获取上述单克隆杂交瘤培养上清即单克隆抗体，将上述制备获得的AFT-YJFZP008按8 μg/孔、2μg/孔、0.5μg/孔、0.1μg/孔的梯度固定在96孔酶标板等固相载体上，再用间接非竞争ELISA程序鉴定每一单克隆抗体，挑取阳性克隆，获得AFT-YJFZP008单克隆抗体，并用于进一步应用研究工作，优选经检测具有特异性强、亲和力高的特点的 AFT-YJFZP008单克隆抗体。
实施例4 指示黄曲霉毒素产毒菌产毒力的分子AFT-YJFZP008的兔源多克隆抗体制备
利用AFT-YJFZP008作为免疫抗原，采用常规方式免疫新西兰大白兔等试验兔，再利用已知常规的兔多克隆抗体制备技术方案即可研制获得。
将上述制备获得的AFT-YJFZP008直接用作抗原，以浓度不低于0.1mg/mL的溶液与弗氏完全佐剂等体积混合乳化，通过背部皮下或皮内多点注射方式新西兰大白兔，之后每隔2-4周加强免疫1次，加强免疫时用弗氏不完全佐剂替换弗氏完全佐剂。采用常规ELISA流程监测免疫效果，至免疫动物血清效价不再上升后，通过常规方法制备获得免疫动物的血清，即为指示黄曲霉毒素产毒菌产毒力的分子AFT-YJFZP008的兔源多克隆抗体。
实施例5指示黄曲霉毒素产毒菌产毒力的分子AFT-YJFZP008的免疫快速检测方法建立
AFT-YJFZP008的免疫快速检测方法即双抗夹心间接非竞争ELISA方法的基本操作程序：酶标板中包被AFT-YJFZP008的纳米抗体，洗板；加入封闭液封闭，洗板；加入AFT-YJFZP008或待测液反应，洗板；加入AFT-YJFZP008兔源多克隆抗体反应，洗板；加入辣根过氧化物酶标记的羊抗兔抗体反应，洗板；加入显色液反应；加入终止液，酶标仪读取并计算结果。以下工作均采用该基本程序完成。
抗体浓度的确定：采用设计棋盘滴定法同时进行多个平行实验，采用不同浓度的上述纳米抗体包被，另外将上述兔源多克隆抗体设置为不同浓度，最终根据结果确定纳米抗体和兔源多克隆抗体的一个适宜工作浓度，即在节省抗体用量的原则下选择OD450nm值近似 1.0的点所对应的上述两种抗体浓度，ELISA结果研究表明，上述纳米抗体和兔源多克隆抗体的其他浓度也可以实现检测，上述纳米抗体的一个适宜包被浓度为2.2μg/mL，上述兔源多克隆抗体的一个适宜包被浓度为2.8μg/mL。
最佳抗体包被条件的确定：包被是ELISA方法研究的第一步，包被效果的好坏对ELISA 的结果有着非常关键的影响。为确定不同包被条件对检测结果的影响，选择了4℃包被过夜、37℃恒温包被2h、37℃恒温包被1h三种不同的条件包被在孔内，检测结果表明，研究的三种包被方式均可以实现包被，4℃下包被过夜为最佳包被条件。
最佳封闭剂的确定：抗体完成包被以后，为了避免酶标板孔未被占用的位点对ELISA后续的步骤造成干扰，需要利用一些惰性蛋白即封闭剂来占用这些位点，而不适当的封闭剂会与二抗非特异性结合，造成假阳性的情况。本研究采用3％BSA/PBST、3％脱脂奶粉/PBST、5％脱脂奶粉/PBST三种不同的封闭剂进行封闭，研究结果表明，虽然三种封闭剂均可不同程度的达到封闭的目的，5％脱脂奶粉/PBST的封闭效果最佳，为最佳封闭剂。
封闭时间的确定：研究分别设置37℃恒温封闭1h、2h、3h三种不同的封闭时长进行封闭，检测的结果表明37℃、封闭2h的设置下阳性孔OD450nm值/阴性孔OD450nm值的数值最大，阳性样品OD450nm值＞1，因此37℃恒温封闭2h为最佳封闭时间。
上述兔源多克隆抗体反应时间的确定：研究分别采用37℃恒温反应30min、50min、1h三个反应时长进行反应，检测结果表明： 37℃恒温下反应50min为上述兔源多克隆抗体的最佳反应时间。
指示黄曲霉毒素产毒菌产毒力的分子AFT-YJFZP008的ELISA标准曲线绘制：将AFT-YJFZP008分子分别稀释至0.00003、0.0003、0.003、0.03、0.3、3、30、300 ng/mL，每孔200μL入孔，采用上述最佳条件绘制AFT-YJFZP008的ELISA标准曲线。在上述最佳优化条件下建立的双抗夹心酶联免疫吸附分析方法的相关系数达0.99，对AFT-YJFZP008分子检测限可达到0.05 ng/mL，表明该检测方法具有良好的检测灵敏度和准确度。
方法特异性评价：为评价指示黄曲霉毒素产毒菌产毒力的分子AFT-YJFZP008的上述免疫检测方法的特异性，研究选取几株与黄曲霉菌具有一定同源性的真菌尖孢镰刀菌、黑曲霉、赭曲霉菌、串珠镰刀菌等，通过对这些真菌培养物的细胞破碎液进行检测，结果见表1，上述方法对与黄曲霉菌有同源性的真菌的蛋白质均无明显的交叉反应，表明建立的指示黄曲霉毒素产毒菌产毒力的分子AFT-YJFZP008免疫快速检测方法具有良好的特异性。
表1. 指示黄曲霉毒素产毒菌产毒力的分子免疫快速检测方法特异性测定结果
Figure SMS_1
方法重复性评价：为评价上述建立的指示黄曲霉毒素产毒菌产毒力的分子AFT-YJFZP008免疫快速检测方法的重复性，随机取4株黄曲霉毒素的产毒菌株——阳性1、阳性2、阳性3、阳性4和1株黄曲霉毒素的不产毒菌株——阴性5研究，对测定结果的板内、板间的数据变异进行分析。上述研究结果见表2，经计算板内变异系数为0.6%-5.7%，板间的变异系数为1.2%-9.1%，均在10%以下，因此，上述方法具有良好的重复性。
表2. 产毒力指示分子AFT-YJFZP008免疫快速检测方法重复性测定结果
Figure SMS_2
方法准确度评价：为了评价上述方法的检测准确度，同时也是为了考察方法的实用性，选择花生和玉米样品为例进行研究评价，在玉米和花生样品中添加指示黄曲霉毒素产毒菌产毒力的分子AFT-YJFZP008，检测结果的回收率越接近100%，说明方法越准确、越实用。该研究结果见表3，结果表明，上述建立的检测方法用于检测花生和玉米中产毒力指示分子AFT-YJFZP008，其回收率达到了83%-106%，说明该方法准确度高，可以应用到实际样品检测中去，具有良好的实用性。
表3. 指示黄曲霉毒素产毒菌产毒力的分子免疫快速检测方法添加回收试验结果
Figure SMS_3
实施例6指示黄曲霉毒素产毒菌产毒力的分子AFT-YJFZP008免疫快速检测试剂盒的组成与保质期
指示黄曲霉毒素产毒菌产毒力的分子AFT-YJFZP008免疫快速检测试剂盒主要由孔底包被有指示黄曲霉毒素产毒菌产毒力的分子AFT-YJFZP008的纳米抗体或单克隆抗体的酶标板、指示黄曲霉毒素产毒菌产毒力的分子AFT-YJFZP008的兔源多克隆抗体、起标准物质作用的指示黄曲霉毒素产毒菌产毒力的分子AFT-YJFZP008纯品溶液、察氏培养基、辣根过氧化物酶标记羊抗兔抗体、ELISA显色液与终止液、样品稀释液共同组成。
上述孔底包被有指示黄曲霉毒素产毒菌产毒力的分子AFT-YJFZP008的纳米抗体或单克隆抗体的酶标板的制备方法：将上述AFT-YJFZP008的纳米抗体或单克隆抗体溶解在ELISA包被缓冲液碳酸盐溶液中，形成2 μg/mL的包被液，再以100-200 μL/孔加入至96 孔酶标板中，4 ℃放置过夜或者37 ℃放置不少于2 h后，去除上述酶标板中包被液，再用ELISA常规洗液洗涤酶标板；然后每孔加200-300 μL的ELISA常规封闭液，放置室温或37 ℃封闭不少于1 h后，再弃去封闭液，再用ELISA常规洗液洗涤酶标板，即可获得孔底包被有指示黄曲霉毒素产毒菌产毒力的分子AFT-YJFZP008的纳米抗体或单克隆抗体的酶标板。
如上所述的指示黄曲霉毒素产毒菌产毒力的分子AFT-YJFZP008的纳米抗体或单克隆抗体可通过实例2和实施例3的方式制备获得。
所述的ELISA包被缓冲液是指常规碳酸盐缓冲液，配制方法为：称取NaHCO31.465g、Na2CO30.795 g, 加入去离子水定容至500 mL即可。
所述的指示黄曲霉毒素产毒菌产毒力的分子AFT-YJFZP008的兔源多克隆抗体可通过实施例4的方式制备获得。
所述的察氏培养基为常规察氏培养基，可以自配，也可以直接购买商品获得。
所述的辣根过氧化物酶标记羊抗兔抗体可以直接购买商品获得。
所述的ELISA显色液是指ELISA常规的双氧水与TMB显色液。
所述的终止液是指ELISA常规的显色终止液2mol/L硫酸水溶液，配制方法为：取44mL浓硫酸加入到300 mL去离子水中，搅拌到冷却，最后定容至400 mL即可。
所述的样品稀释液是指含有0.1%山梨醇和糖的0.01 mol/L 磷酸盐缓冲液，配制方法为：山梨醇与糖各0.5 g、NaCL 4.0 g、Na2HPO4∙12H2O 1.45 g、KCL 0.1g、KH2PO40.1 g，加入去离子水定容至500 mL。
上述试剂盒的保质期研究结果表明，4℃至少可以保存6个月以上。
实施例7指示黄曲霉毒素产毒菌产毒力的分子AFT-YJFZP008免疫快速检测试剂盒用于鉴别比较黄曲霉毒素的菌株产毒力
第一步，待鉴别菌株的待测液的制备：按菌株产毒力强弱，选取公开文献《中国典型花生产区黄曲霉菌分布、产毒力与侵染研究》——中国农业科学院硕士学位论文，作者张杏，第33页——公布的产毒菌株HBZHX-21、HBXY-36、HBHA-1-4、GDZJ-6、HeNZY-2、HuBha-24、JSnt-1、HuNdx-7、GDZJ-108-19、HBHA-8-17等10株，待鉴别菌株在上述试剂盒中的察氏培养基培养，培养的环境温度为15 ~ 35 ℃，培养时间不少于12 h后，取培养基与培养物的混合体充分匀浆，再用上述试剂盒的样品稀释液稀释1-10倍，获得待鉴别菌株的待测液。
第二步，上述待鉴别菌株待测液的测定：上述待测液以每孔100-200 μL加入到上述试剂盒的酶标板孔中，或者每孔加入上述试剂盒中系列浓度的本发明产毒力指示分子AFT-YJFZP008的溶液100-200 μL，放置室温或37 ℃反应不少于1 h后，弃去反应后液体，洗涤酶标板，然后加入上述试剂盒中AFT-YJFZP008兔源多克隆抗体，再每孔加入100-200μL，放置室温或37 ℃反应不少于1 h后，弃去液体，再液洗涤酶标板，然后每孔加入上述试剂盒中的辣根过氧化物酶标记羊抗兔抗体100-200μL，放置室温或37 ℃反应不少于1 h后，弃去液体，再洗涤酶标板，然后先后加入上述试剂盒中的ELISA显色液、终止液，最后通过酶标仪读取并计算待测样品中AFT-YJFZP008的浓度。
根据上述文献结果，HBZHX-21、HBXY-36、HBHA-1-4、GDZJ-6、HeNZY-2、HuBha-24、JSnt-1、HuNdx-7、GDZJ-108-19、HBHA-8-17等10株菌株的产毒力依次为：0 µg/L、0 µg/L、3.8 µg/L、4.9 µg/L、67.2 µg/L、81.7 µg/L、192.0 µg/L、204.4 µg/L、297.4 µg/L、1027.5µg/L，表明HBZHX-21和HBXY-36为不产毒菌株，HBHA-1-4和GDZJ-6等为弱产毒力菌株，HBHA-8-17和GDZJ-108-19等为强产毒菌株。
第三步，鉴别结果评判：待鉴别菌株中指示黄曲霉毒素产毒菌产毒力的分子AFT-YJFZP008含量越高，则说明鉴别菌株产黄曲霉毒素能力即产毒力越强。按上述试剂盒及其应用技术方案，测定HBZHX-21、HBXY-36、HBHA-1-4、GDZJ-6、HeNZY-2、HuBha-24、JSnt-1、HuNdx-7、GDZJ-108-19、HBHA-8-17等10株菌的AFT-YJFZP008浓度结果依次为：0 ng、0 ng、7.8 ng、11.2 ng、43.7 ng、51.5 ng、99.4 ng、109.0 ng、166.5 ng、562.3 ng，结果同样表明：HBZHX-21和HBXY-36为不产毒菌株，HBHA-1-4和GDZJ-6等为弱产毒力菌株，HBHA-8-17和GDZJ-108-19等为强产毒力菌株。该测定结果与上述公开文献《中国典型花生产区黄曲霉菌分布、产毒力与侵染研究》公布的菌株产毒力强弱次序一致，且强产毒力菌株与弱产毒力菌株鉴定结果与文献一致，证明本发明提供的试剂盒及其应用技术方案可以用于鉴别黄曲霉毒素的菌株产毒力，方法简便、易操作，实用性强。
实施例8 利用指示黄曲霉毒素产毒菌产毒力的分子AFT-YJFZP008免疫快速检测试剂盒鉴别农田中是否含有黄曲霉毒素的强产毒力菌株
第一步，待鉴别样品的待测液的制备：选取吉林、辽宁、江西、福建等花生花期根际土壤样品共4份，依次命名为土样-1、土样-2、土样-3、土样-4。依次称量待测的农田土壤样品，粉碎均匀后转移上述试剂盒的样品稀释液中，浓度0.5g/mL，室温震荡至均匀，制成待测样品均匀分散液。取 50µL该待测样品均匀分散液，加到30 mL的上述试剂盒的察氏培养基中，置于28°C下200 rpm震荡培养，培养24 h后取样，形成待鉴别样品的待测液。
第二步，上述待鉴别样品待测液的测定：上述待测液以每孔100-200 μL加入到上述试剂盒中的酶标板孔中，或者每孔加入上述试剂盒中系列浓度的本发明产毒力指示分子AFT-YJFZP008的溶液100-200 μL，放置室温或37 ℃反应不少于1 h后，弃去反应后液体，洗涤酶标板，然后加入上述试剂盒中AFT-YJFZP008兔源多克隆抗体，再每孔加入100-200μL，放置室温或37 ℃反应不少于1 h后，弃去液体，再液洗涤酶标板，然后每孔加入上述试剂盒中的辣根过氧化物酶标记羊抗兔抗体100-200μL，放置室温或37 ℃反应不少于1 h后，弃去液体，再洗涤酶标板，然后先后加入上述试剂盒中的ELISA显色液、终止液，最后通过酶标仪读取并计算待测样品中AFT-YJFZP008的浓度。
第三步，鉴别结果评判：如果待鉴别样品中指示黄曲霉毒素产毒菌产毒力的分子AFT-YJFZP008浓度高，则说明待鉴别样品中含有黄曲霉毒素的强产毒力菌株。按上述试剂盒及其应用技术方案，测定土样-1、土样-2、土样-3、土样-4中AFT-YJFZP008浓度结果依次为：0.2 ng、0.1 ng、10.6 ng、19.2 ng。该结果表明，土样-1和土样-2中每毫升培养液中含有AFT-YJFZP008的量均在1.0 ng以下，不含黄曲霉毒素的强产毒力菌株，其相应农田中花生产后污染风险很低；土样-3和土样-4中每毫升培养液中含有AFT-YJFZP008的量均在10ng/mL以上，含有黄曲霉毒素的强产毒力菌株，其相应农田中花生产后污染风险较高。
实施例9 利用指示黄曲霉毒素产毒菌产毒力的分子AFT-YJFZP008免疫快速检测试剂盒鉴别农产品中是否含有黄曲霉毒素的强产毒力菌株
第一步，待鉴别样品的待测液的制备：选取花生、玉米、大米、小麦等农产品样品共4份，依次称量待测的样品，粉碎后转移至上述试剂盒的样品稀释液，浓度0.5g/mL,，室温震荡至均匀，制成待测样品均匀分散液。取 100 µL该待测样品均匀分散液，加在含50mL的上述试剂盒的察氏培养基中，置于28°C下200 rpm震荡培养，培养6 h后取样，形成待鉴别样品的待测液。
第二步，上述待鉴别样品待测液的测定：上述待测液以每孔100-200 μL加入到上述试剂盒中的酶标板孔中，或者每孔加入上述试剂盒中系列浓度的本发明产毒力指示分子AFT-YJFZP008的溶液100-200 μL，放置室温或37 ℃反应不少于1 h后，弃去反应后液体，洗涤酶标板，然后加入上述试剂盒中AFT-YJFZP008兔源多克隆抗体，再每孔加入100-200μL，放置室温或37 ℃反应不少于1 h后，弃去液体，再液洗涤酶标板，然后每孔加入上述试剂盒中的辣根过氧化物酶标记羊抗兔抗体100-200μL，放置室温或37 ℃反应不少于1 h后，弃去液体，再洗涤酶标板，然后先后加入上述试剂盒中的ELISA显色液、终止液，最后通过酶标仪读取并计算待测样品中AFT-YJFZP008的浓度。
第三步，鉴别结果评判：如果待鉴别样品中指示黄曲霉毒素产毒菌产毒力的分子AFT-YJFZP008浓度高，则说明待鉴别样品中含有黄曲霉毒素的强产毒力菌株。按上述试剂盒及其应用技术方案，测定的花生、玉米、大米、小麦样品中AFT-YJFZP008浓度结果依次为：10.2 ng、12.6 ng、0.4 ng、0 ng。该结果表明，花生和玉米样品中每毫升培养液中含有AFT-YJFZP008的量均在10 ng以上，其含有黄曲霉毒素的强产毒力菌株，污染风险较高；大米样品中每毫升培养液中含有AFT-YJFZP008的量在1.0以下，不含有黄曲霉毒素的强产毒力菌株，污染风险很低； 测定的小麦样品中每毫升培养液中含有AFT-YJFZP008的量为0，不含有黄曲霉毒素产毒菌株，基本无黄曲霉毒素污染风险。
实施例10 利用指示黄曲霉毒素产毒菌产毒力的分子AFT-YJFZP008免疫快速检测试剂盒鉴别中药材中是否含有黄曲霉毒素的强产毒力菌株
第一步，待鉴别样品的待测液的制备：选取人参、当归、枸杞等中药材样品共3份，依次称量待测的中药材样品，粉碎后转移至上述试剂盒的样品稀释液，浓度0.5g/mL, 室温震荡至均匀，制成待测样品均匀分散液。取 50 µL该待测样品均匀分散液，加在含30mL的上述试剂盒的察氏培养基中，置于28°C下200 rpm震荡培养，培养6 h后取样，形成待鉴别样品的待测液。
第二步，上述待鉴别样品待测液的测定：上述待测液以每孔100-200 μL加入到上述试剂盒中的酶标板孔中，或者每孔加入上述试剂盒中系列浓度的本发明产毒力指示分子AFT-YJFZP008的溶液100-200 μL，放置室温或37 ℃反应不少于1 h后，弃去反应后液体，洗涤酶标板，然后加入上述试剂盒中AFT-YJFZP008兔源多克隆抗体，再每孔加入100-200μL，放置室温或37 ℃反应不少于1 h后，弃去液体，再液洗涤酶标板，然后每孔加入上述试剂盒中的辣根过氧化物酶标记羊抗兔抗体100-200μL，放置室温或37 ℃反应不少于1 h后，弃去液体，再洗涤酶标板，然后先后加入上述试剂盒中的ELISA显色液、终止液，最后通过酶标仪读取并计算待测样品中AFT-YJFZP008的浓度。
第三步，鉴别结果评判：如果待鉴别样品中指示黄曲霉毒素产毒菌产毒力的分子AFT-YJFZP008浓度高，则说明待鉴别样品中含有黄曲霉毒素的强产毒力菌株。按上述试剂盒及其应用技术方案，测定的人参、当归、枸杞等中药材样品中AFT-YJFZP008浓度结果依次为：0.2 ng/mL、0 ng/mL、0 ng/mL。该结果表明，测定的人参样品中AFT-YJFZP008浓度均在1.0以下，不含有黄曲霉毒素的强产毒力菌株，污染风险很低；测定的当归、枸杞样品中AFT-YJFZP008浓度为0，不含有黄曲霉毒素产毒菌株，基本无黄曲霉毒素污染风险。
实施例11 利用指示黄曲霉毒素产毒菌产毒力的分子AFT-YJFZP008免疫快速检测试剂盒鉴别饲料中是否含有黄曲霉毒素的强产毒力菌株
第一步，待鉴别样品的待测液的制备：从市场上选取待测饲料样品共4份，依次命名为饲料-1、饲料-2、饲料-3、饲料-4。依次称量待测的样品，粉碎后转移至上述试剂盒的样品稀释液中，浓度0.5g/mL, 室温震荡至均匀，制成待测样品均匀分散液。取 100 µL该待测样品均匀分散液，加在含200 mL的上述试剂盒的察氏培养基中，置于28°C下200 rpm震荡培养，培养24 h后取样，形成待鉴别样品的待测液。
第二步，上述待鉴别样品待测液的测定：上述待测液以每孔100-200 μL加入到上述试剂盒中的酶标板孔中，或者每孔加入上述试剂盒中系列浓度的本发明产毒力指示分子AFT-YJFZP008的溶液100-200 μL，放置室温或37 ℃反应不少于1 h后，弃去反应后液体，洗涤酶标板，然后加入上述试剂盒中AFT-YJFZP008兔源多克隆抗体，再每孔加入100-200μL，放置室温或37 ℃反应不少于1 h后，弃去液体，再液洗涤酶标板，然后每孔加入上述试剂盒中的辣根过氧化物酶标记羊抗兔抗体100-200μL，放置室温或37 ℃反应不少于1 h后，弃去液体，再洗涤酶标板，然后先后加入上述试剂盒中的ELISA显色液、终止液，最后通过酶标仪读取并计算待测样品中AFT-YJFZP008的浓度。
第三步，鉴别结果评判：如果待鉴别样品中指示黄曲霉毒素产毒菌产毒力的分子AFT-YJFZP008浓度高，则说明待鉴别样品中含有黄曲霉毒素的强产毒力菌株。按上述试剂盒及其应用技术方案，测定饲料-1、饲料-2、饲料-3、饲料-4中AFT-YJFZP008浓度结果依次为：0.5 ng、20.3 ng、14.2 ng、72.9 ng。该结果表明，饲料-1样品中每毫升培养液中含有AFT-YJFZP008的量在1.0 ng/mL以下，不含黄曲霉毒素的强产毒力菌株，其污染风险很低；以50µL样品均匀分散液加在含30 mL培养基中为例，饲料-2、饲料-3、饲料-4中每毫升培养液中含有AFT-YJFZP008的量均在10 ng/mL以上，含有黄曲霉毒素的强产毒力菌株。
＜110＞ 中国农业科学院油料作物研究所
＜120＞ 一种黄曲霉毒素产毒真菌的产毒力指示分子快检试剂盒及其用途
＜160＞ 1
＜210＞ 1
＜211＞ 18499
＜212＞ PRT
＜213＞ 黄曲霉
＜400＞ 1
ALAALASERL EPRALASERP HESERGLYPH ELYSALAPHE ASPSERSERP HEPRLEPRLY 60
SALAPHEPRA SNALAPRASP LYSALAGLYV ALILEPRGLS ERLEHISGLN ASPTHRVALG 120
LYTHRPHEGL YLYSALAILE HISASPGLVA LSERPRVALG LYASPTHRAS PALALELEGL 180
ARGALAILEA SNASPTYRIL EASPSERGLN LEASPLYSAL ALELEPHEGL YALAALAGLY 240
SERALAGLAS PPRVALVALV ALLYSALALE THRASNGLYA LAGLYALAIL ELYSALALEV 300
ALSERHISAS PGLYTHRPHE VALALAASPA LALYSALAAS NASNTYRCYS SERASNGLNV 360
ALGLGLYPRT YRSERLETYR SERGLYARGA LAPRVALVAL GLNTYRALAL EASNARGALA 420
SERMETVALT RPGLGLALAG LNGLNVALSE RGLYLYSALA SERPRSERTY RLETHRALAT 480
HRPRARGALA VALGLGLNSE RLEASPALAI LEARGALAVA LGLYGLNALA THRGLARGAL 540
AVALILETHR ASPILEVALA SNGLNGLNAR GALAVALSER PRSERPHEGL ASPVALTRPS 600
ERGLNPRARG ALATYRGLNG LYTYRPHEHI SSERASNASP ASPLELEASN ARGCYSASPV 660
ALALATHRTH RASPVALTYR TYRSERGLYL YSCYSVALTH RALAPRSERG LYPRCYSGLY 720
GLNLYSCYST YRALALEVAL ASNHISGLPH ESERARGASP ALAASPALAC YSASNGLYGL 780
YGLYILEGLT YRASPSERPR ALAASPTHRP RLEGLPHELY SASPALAGLY SERPRLYSPR 840
VALVALGLNI LEGLYHISGL GLYASPVALG LYVALALAGL ILEGLNASNM ETARGASPAL 900
AGLYTYRGLT HRSERILETH RASPTYRTRP GLYARGASPA LAVALTYRAL ALEASPALAI 960
LETYRGLYIL EASPALAARG ASPGLARGAL ASERLEASPV ALGLPRSERL EPRTRPPRAS 1020
NASPGLYILE PHEARGTRPA RGASPPHEPH EASNHISVAL THRILELYSA SPPHEGLYTR 1080
PASPSERALA PHEASPGLNL YSGLYASNSE RLEGLYLECY SLEPRTHRAS PPHELYSASP 1140
PHEPRCYSAS PVALGLNARG PRPRASPLEA LAALAASNAS PALALYSASP PHETHRASPI 1200
LETHRALAGL YSERSERILE GLYCYSASPG LYVALASNPR GLNTHRGLYL YSASPGLYAL 1260
AGLYGLNMET PHEILEPRLE ASNPRASNAL ATYRSERPRA SNTHRLEASN LYSASPGLYA 1320
SPLEVALTHR GLNGLNASNG LLEGLNGLYL YSASPLEASP GLNASPILEG LLYSLYSASP 1380
LEASNASPGL YGLYSERSER VALGLYVALG LNASNARGLY SASPLEASNP RASNGLYSER 1440
GLNPHEILET HRPRGLYGLY LYSASPLEPR TRPTYRGLNC YSASNGLNGL ILEHISTHRL 1500
EVALSERGLY LELEARGARG ASPASNILEL EPRGLASNLE ASPASPGLYL EPRSERGLNP 1560
HEVALTYRGL LYSASPASNT HRCYSASNAL APRILEPRVA LSERPHEPRV ALALAPRTHR 1620
ASPTHRLYSA SPPRPHELYS ALAILEILET HRLESERALA ARGLEASPTH RPHEALATHR 1680
ILEASNTHRL EPHELYSASP PRPRILEASN METGLYPRIL EPRALATHRT HRASPLETHR 1740
ASNMETASPA RGARGASPPR TYRMETPHEH ISGLNALAAS NLEARGASPG LNCYSASNTY 1800
RSERLEGLNT YRTHRILEGL YASNLYSASP GLNGLLYSAR GGLNARGASP GLNILEILEG 1860
LCYSARGASP THRLEVALIL EPRPRGLYSE RARGASPTHR SERLECYSPR METALAPRPR 1920
ASNSERPHEM ETSERTHRLE PRMETTHRAL AASPPHEARG ASPTHRTHRG LYPHEILEGL 1980
THRASPPRLE LYSASPVALH ISGLYPHEAL ATHRARGASP VALVALGLAL APHEARGASP 2040
TYRALACYSP RTRPASNGLY GLYGLGLVAL SERLELYSGL ALAALASERA LAALALEALA 2100
ALAGLYTYRL YSGLALAGLY LEVALPRPHE GLNVALSERP RTHRTHRLYS GLGLTYRASP 2160
GLGLYLEARG METVALASNL YSGLYLEALA LYSGLGLYAS NGLSERVALG LNVALPRARG 2220
ASNHISALAL ESERSERASP ARGGLHISHI SGLLEALAIL EALASERLYS GLILEASNGL 2280
NILEGLNARG GLILESERPH EASNGLNALA TRPLEARGGL LESERALATH RVALMETASP 2340
HISLELESER GLNARGGLLE VALLEVALLE GLYARGGLPR GLYALAGLGL YVALCYSGLT 2400
HRTHRPRGLY VALLYSGLPR GLYILECYSG LTHRTHRPRG LYVALLYSGL ARGGLLEASP 2460
SERARGGLSE RGLPHEPHEI LEARGPHEAL ALESERTHRT RPALAARGPH EALAASNGLN 2520
METPRASNGL YCYSGLNASP LEILESERTH RCYSLYSPHE ALASERASPA SPALACYSGL 2580
GLLYSPHEGL GLILEALAPR TYRVALASNG LYLYSARGPH EGLGLYTYRL EPRASPALAA 2640
RGPHEGLASN SERASNVALL YSPHEGLASN SERASNVALL YSSERSERVA LVALARGPHE 2700
GLYLYSPRVA LGLYALAVAL GLYSERALAA LATHRALALE LYSPHEGLYT RPTRPSERAL 2760
AASPGLYALA TRPPRGLYAL ALEASPASPP HEVALVALTR PVALGLNLYS LYSPHEHISA 2820
SPSERSERAS NASPSERGLY ASNARGPHEH ISVALLETHR ALAGLNLESE RPHEPRARGP 2880
HELEASPGLA LALETHRTYR PRPRPRLYSP HEASNSERLE ALAASPARGP HEGLNTYRPR 2940
GLYASPLEPH EASPGLNGLY THRTHRILEA RGPHESERSE RCYSSERGLY THRARGPHES 3000
ERTHRVALAL AGLYSERARG PHESERVALA LAGLILELEP RGLYALALYS PHEVALGLYG 3060
LYALASERTH RASPALAPHE ALAASPPRLY SPHEVALTHR ASPASNGLYA SPSERLYSGL 3120
YALAASPARG GLYARGGLYA SPALAGLYSE RPRVALPHES ERPRASPSER LYSGLYPHEP 3180
HETHRALAPR GLYARGGLYG LYGLYGLYGL YTHRPHEGLY VALVALMETG LSERTHRHIS 3240
ARGGLYGLYS ERGLYALALE GLYLEALAPH ESERGLALAL YSGLYILEAS PVALALALYS 3300
PRTHRGLYAR GGLYILEGLN ILEASNASPP RSERILEASN ASPASPSERV ALMETILETY 3360
RALAPRALAV ALARGGLYLE ARGASNSERG LYVALHISGL YTHRPHESER SERARGPRGL 3420
GLNGLGLILE GLNLYSGLYL ETYRALAGLY HISARGGLYP RLEASNGLGL YGLYLETYRA 3480
LAGLARGGLY GLNTHRPRLE PRILELEVAL ALAASPGLYA RGGLYSERAS PCYSSERTHR 3540
THRALAGLYG LYCYSCYSGL YGLYTHRGLY CYSGLNPRAS NGLTHRLEVA LPHEGLYSER 3600
SERASPLEAL AARGGLYVAL ASPPHETHRG LASPPRLELE GLNGLYARGG LYVALGLYSE 3660
RASPALATRP THRVALSERG LSERGLYARG GLYVALLEAR GPRVALSERT HRGLYSERAR 3720
GGLYVALTYR ASPILEARGG LYTYRLYSPR SERALASERS ERGLYSERLY SGLYTYRPRT 3780
HRSERGLNGL NASNTRPVAL GLYTHRLELE LEPRARGHIS ALAGLYGLNC YSGLYGLTYR 3840
HISGLASNLY SHISPHEGLN LEILEASNTH RALAALATYR TRPLYSHISP HETHRSERLE 3900
GLGLLYSHIS PHEVALASPT HRPHEGLYLE HISGLYHISL YSHISGLYGL YPRASNPHEG 3960
LGLNLEPRIL EASNGLNPRA RGHISLEPHE GLYLEHISAR GHISTHRASP TYRSERSERG 4020
LNGLSERTHR SERTYRLYSH ISVALASPGL YPHEGLYILE HISTHRPHEA RGHISVALTY 4080
RASPALAVAL GLNASPLYSI LEALAPHEAL ASERTYRLEG LGLTYRALAA RGILEALAPR 4140
GLNPHEGLYA SPLELYSILE ALASERLEAS NASPSERTYR GLTHRLELYS LYSARGILEP 4200
HEARGLELEG LYTHRPRASP GLASPSERTR PPRGLYVALT HRSERPHEPR ASPTYRLYSI 4260
LELEPHEASP SERASNASNV ALALATHRGL YVALGLNVAL SERTHRGLYG LYTHRPHEGL 4320
YTHRARGILE ASNPRHISGL LESERILEAR GASPPRASPP HETYRASNGL ILETYRVALT 4380
HRGLSERLYS ARGILEGLNA LAPHEVALIL ETYRPRGLAS NPHEASPLYS ILESERALAT 4440
YRVALGLGLY SERSERARGI LESERHISHI SALAGLNTHR LELEGLGLYL EGLYTHRHIS 4500
ARGTYRLEGL SERCYSTHRG LARGILESER TYRLYSGLPR GLYILECYSG LTHRTHRPRG 4560
LYVALLYSIL EVALPRGLGL TYRVALPRIL ETHRLYSILE VALGLNVALG LYASPLEARG 4620
ILEVALTHRP RASPGLYLYS ILETYRASPS ERILETYRVA LARGLYSALA LYSGLSERSE 4680
RSERGLSERS ERASPSERSE RGLSERGLSE RGLSERGLSE RGLASPGLLY SLYSPHETHR 4740
ASPTHRPRVA LLETYRGLYP RLYSLYSMET GLASPASPLE ARGLYSPRLE GLYTHRGLYT 4800
HRASPLETRP PRLYSLYSTH RLELEPHETY RALASERSER HISGLALAIL ESERPHEASP 4860
SERCYSARGL YSTHRSERSE RSERTHRALA THRSERTHRS ERTHRSERTH RGLYALAALA 4920
ALALEPRTHR ALAALAPHEG LYALAVALGL GLYGLYLEME TLEGLYVALV ALLEGLYVAL 4980
LEGLYLELEA SPARGPRPRV ALILEPRLEP RPRSERASPS ERASPVALTH RALAPHEARG 5040
LEGLGLLEAS NGLNARGLEG LGLNTYRARG METGLNLESE RGLYLELESE RGLNASNGLY 5100
GLNGLYSERL YSLEPHESER ILEPRALAAS PALAGLYASP ASPTYRLYSP RLYSLEPHES 5160
ERTYRLEASP THRGLNLEAS NARGLEPHET YRASNSERLE THRPRALAGL GLNGLNPHEV 5220
ALVALASPAL AILEARGLEL YSASPLEVAL LESERLELEA SNLESERSER PHEASPALAS 5280
ERGLYTYRIL EASPARGLEA SNTHRGLYAL AVALILEPRV ALLEVALARG LEPRASPILE 5340
CYSASNTHRC YSPHELYSLE SERGLNLEGL SERGLYLYSL ESERSERILE ALALEPRARG 5400
LETHRASPLE GLILEASNAR GLETHRGLYA SNLEGLYGLY GLASPTYRGL NASPLYSMET 5460
PRMETPRILE LEVALALAAS PGLYARGASN ALAGLYILEG LNTHRSERAR GASNALAHIS 5520
GLYGLNGLIL ELELEARGAS NALALEGLNT HRMETTYRAS PTHRGLNASP LYSASNASPP 5580
RVALALAVAL PHEASPGLYS ERVALILEPR LYSASNPHEA SPASNASPGL NHISARGASN 5640
PHEGLNGLLE PHEGLYILEL YSASNGLYAS PGLNSERPRP RSERALALEG LYPRLEPRSE 5700
RVALILEGLA RGASNHISAS NVALLESERA LAILEPRGLN GLPRTYRARG ASNHISTHRA 5760
LAGLYILEGL ALAARGASNL EGLTHRGLAR GGLNLEARGA SNLEGLVALL ESERLETHRL 5820
YSASNLEVAL GLYTHRSERG LYPHETHRSE RALAARGASN ASNVALILEI LEGLNLEASN 5880
ARGASNPRAS PLESERSERT HRSERASPTH RTHRASPVAL ILEARGASNS ERILELEGLG 5940
LYPRASPVAL LYSASNSERV ALVALGLYIL ELYSPRTHRV ALGLYLETHR SERARGASNV 6000
ALGLYLEVAL SERVALSERL EASPGLYLYS ASNVALLEAS PTYRGLYALA ARGASNVALV 6060
ALLEASPTHR THRALALESE RALAASNTHR LYSASNTRPH ISARGLESER PHETHRTYRA 6120
SNCYSTHRPR SERALAASNT YRGLNTYRIL EPRALATYRL YSASNTYRPH EALAGLTHRG 6180
LGLNVALMET PHEGLNPRGL YHISILEVAL ARGASNTYRI LEVALVALAS PALAASPSER 6240
SERPRLEGLN ILEVALILEA SPGLYPHEAR GPRPRMETGL ASPILEVALS ERPRTHRLEG 6300
LASPLEILEH ISLEALALEA RGARGPRPRG LNPRASPGLY ALATHRCYSI LELYSGLYAS 6360
NGLCYSGLAL APHECYSVAL ASPGLYVALC YSLYSPRGLN GLYASPPRLY SPRGLNSERI 6420
LEASPTHRIL EVALGLYTHR ASNLEHISME TASPILELES ERASPLEALA ALAALALEAL 6480
AGLYSERILE GLYVALALAP RSERSERASN LEASPPRTHR ARGLYSPRVA LALAASPALA 6540
ALAVALVALA SNALACYSGL SERPHEPRLE SERPHEASPT HRASPVALSE RARGARGPRT 6600
RPVALGLYGL YGLNILEVAL ASNSERILEP RALASERVAL GLLYSILEAL AVALLEGLGL 6660
NVALARGGLN ASPGLYHISP HESERVALPR SERTYRALAG LYHISVALAL ATHRMETTHR 6720
SERVALSERL EARGARGGLN ASPLEPHEGL ALAILEGLAL AGLYARGGLN ILEGLNTHRS 6780
ERARGGLNLE PRPRSERLEP RTYRTHRPHE TYRTHRSERT YRTHRSERGL ASPSERTYRL 6840
YSLYSGLNLE SERGLASPGL YVALASPVAL VALVALVALA LAGLARGARG ASPGLGLHIS 6900
GLNLEASPAS PASPPHEGLG LYILEASPAS PGLMETASPG LSERGLNSER ARGARGPRAS 6960
PLESERTHRP HEPHEALATH RLESERGLIL ESERPRASPG LALAARGARG PRPHEILEIL 7020
EALAARGARG PRGLYASPAR GSERHISSER ARGSERALAA LAALALESER THRSERGLLY 7080
SSERALAALA ALALESERTH RSERGLLYSA SPTRPLEGLN VALARGSERA LAALAASPGL 7140
YLEALASERA LAILETHRSE RLYSSERALA GLYTYRTHRP RLELYSSERA LAMETTHRLE 7200
PRARGSERAL ATHRVALMET THRTYRTRPL YSTHRGLGLG LYALAPRLEP RGLYCYSPRA 7260
RGTHRTHRLE GLNARGSERA SPASPALAIL ETHRARGTHR ASNPRASPAL ALELYSALAS 7320
ERALAVALPR GLYALASERA LALYSSERGL YASNTYRSER TYRGLYVALA RGSERGLYSE 7380
RSERPHESER SERILEGLYS ERALAILESE RMETSERLYS SERGLYSERV ALALALEGLY 7440
LYSSERHISL ESERVALVAL ASPGLYGLYG LASPGLYGLN ASNILEPRLE HISPRLEILE 7500
GLNPRGLARG SERILEALAV ALLYSALAPR SERPRTHRGL PRGLYSERPR ALASERPRGL 7560
YGLYSERGLN PRARGSERIL EILESERARG METLEVALTH RASPPRLYSS ERLEGLYASP 7620
VALCYSMETA SPLEGLNTHR ILETHRTHRS ERSERASPPR ASPPRLYSAR GSERASNILE 7680
THRGLILELE PRALAGLYTH RPRLEPRGLY THRALAALAT HRALAARGGL NASNPRASNP 7740
RALAALAALA ALASERTHRG LYGLYGLNAS PGLYGLYPRA SNASPALAVA LPRARGSERP 7800
RALAALAVAL GLNGLYILET YRGLYASNAR GSERSERGLL YSPRSERILE THRILEASPG 7860
LYASNASNIL EASNLYSSER SERGLYALAV ALTHRGLYGL NSERTHRARG SERSERGLYT 7920
HRGLYTHRSE RTHRGLYALA ALAALATHRG LYTHRGLTHR ASNALAALAS ERVALALALY 7980
SLEGLNMETG LYVALSERAL AALAGLYILE ALAGLYLEAL ALEGLYILET RPALALESER 8040
SERHISPRIL EGLVALPRVA LLYSSERTHR ASPTHRSERI LEASNVALAR GSERVALTHR 8100
SERGLYPHEV ALASPGLYIL ELYSSERVAL THRSERGLYP HEVALASPGL YILELYSASP 8160
GLYLEARGTH RALALEALAA SPTYRALALE CYSALAGLAL ATHRASNMET CYSARGTHRA 8220
LASERASNPH EASPGLNPRH ISSERASPGL SERALALEGL NHISLEARGT HRALAVALPR 8280
ILEASNGLYP RASPSERPRG LYTHRPRGLG LYVALLYSTH RASPTYRSER VALCYSGLYG 8340
LTHRTHRILE PHELYSTHRG LYTYRVALAS NTYRASNVAL ASPTHRTHRA SNLEARGTHR 8400
ILEPHEGLYT RPASPILEAL AGLGLYGLNL YSTHRILESE RASNVALVAL ASPASNGLLE 8460
ALAARGTHRI LEVALSERPR ASPGLYPHEA SNTRPASPTY RGLYSERTHR ARGTHRLEGL 8520
YILEASPILE ALAARGTHRL ESERTHRASN GLGLGLYTYR GLTHRSERAL AVALARGTHR 8580
METLEVALGL YMETASPVAL THRHISPRSE RPRGLYSERS ERALAASNAL APRSERVALA 8640
LAGLYMETVA LALASERVAL ASPSERTHRL ESERGLNTRP PRALAGLILE ARGVALGLNA 8700
RGTHRASNTH RGLNVALPRA SPALACYSTH RGLNCYSPHE GLNLYSTHRG LNGLYPRHIS 8760
SERTHRPHEA SPARGTHRSE RGLYSERGLY SERSERSERP RGLPRARGTH RTHRASPVAL 8820
GLYTHRPHEG LYGLNLYSTH RTHRGLYALA PHEASPGLSE RGLYPRPRLE SERGLNLYST 8880
HRTHRASNGL YILEVALSER THRASNGLSE RGLYARGTHR THRSERGLNT RPASNVALLE 8940
ASPLELYSTH RTHRTHRLEA SPGLNGLYHI STYRGLNSER ARGTHRTHRT YRASNVALVA 9000
LALAGLNTHR LYSTHRVALA SNVALASNAS NLELYSVALA LALEVALTYR GLYASPARGV 9060
ALALATHRIL EGLYSERALA THRPHEALAA RGVALCYSAS NLEILEGLYL EMETGLYLEA 9120
RGVALASPPH ETYRASNASN LELYSVALGL LEGLNSERLY SVALGLARGT HRGLYTYRAL 9180
AALAPHEARG VALGLSERAL ASERALAASP LEILESERTH RILETHRLYS VALPHEASPA 9240
LAGLYHISTH RVALPRALAP HEGLNPRGLT HRMETPHEAR GVALPHEGLA LAGLYHISGL 9300
VALPRALATY RGLNPRGLTH RALATYRGLI LEPHEHISAR GVALGLYGLG LGLTHRPRAL 9360
ALEVALHISA SPLEASNTHR ALAMETARGV ALGLYPHELE ALASERVALG LTHRPRALAS 9420
ERILEGLALA ALASERGLLE SERLYSVALG LYGLYTHRLE ALATYRVALS ERVALGLILE 9480
GLLYSVALLY SVALGLYTHR ILEILETHRG LYASPPRLEA SPPRPRVALL ELYSVALILE 9540
PRLEGLNGLY CYSASPALAA SPGLTYRGLY ARGVALLELE HISPRLELET HRALAALAAL 9600
ALELEGLYAL ASERALAARG ALAGLNSERV ALVALGLYTH RPRPHEGLYP HEALASERGL 9660
YTHRTHRGLY GLYGLYASNA LAALAPRALA ALAPRLYSVA LASNGLYVAL GLTYRGLYGL 9720
THRARGVALG LNLEASPGLG LYLELYSARG VALSERILET RPTHRGLSER TYRGLYGLYA 9780
RGVALSERAS NASPLEALAA RGVALSERGL NILESERGLY ASNARGPRLE ASPALALEAS 9840
PGLNGLYTHR ARGVALSERT YRTHRGLTYR ASPSERTYRT YRASPHISTY RASNLYSVAL 9900
THRASNSERP RSERASNLEV ALTRPTYRSE RILESERTHR ARGVALVALA LAVALASPTH 9960
RALASERASN LYSVALVALA SNTYRTYRSE RASPASPPRT HRGLYMETSE RASPSERGLY 10020
GLASPALAPH EASPMETARG LYSVALTYRA LATHRPRASP GLNASPILEG LHISGLYARG 10080
TRPASNGLTH RILETYRVAL ILEILETHRS ERPHESERAS PTHRLETHRI LEGLNPRTYR 10140
ASPTRPASNG LPHEARGLYS TRPASNPHEI LEMETASNSE RARGTRPARG HISTYRTYRL 10200
EARGTYRALA GLYGLTYRGL PHEGLNALAA SPLEPHELYS TYRCYSALAS ERALAGLNGL 10260
ASPASNALAT HRLEGLNALA LELEARGTYR ASPLEASNLE GLASNLYSTY RGLYPRSERP 10320
HETHRALAPH EPHEGLNGLG LNASNGLLYS TYRLYSGLPR GLYALAGLGL YVALCYSGLT 10380
HRTHRPRGLY VALLYSTYRL EALASERTHR GLNMETGLPR THRASPALAA RGTYRLEASP 10440
GLNGLNILET HRALAGLTHR LYSTYRLEAS PTHRLEPRGL ILELYSTYRL ETHRASNSER 10500
GLNALALEAL AASPLEPRTY RPHEALAGLL YSTYRLEVAL ASPGLNLEAS NPRGLGLYLY 10560
STYRGLNGLY ALASERGLNC YSPRPHEARG TYRGLNPRHI STHRVALTHR THRVALSERA 10620
LAGLYALASE RASPPRARGG LYSERPRGLG LYGLYGLYAR GTYRVALASP ALAGLYGLYP 10680
HEGLPRSERI LELYSTYRVA LTHRSERASN ALAVALSERV ALGLYVALTH RHISPHEALA 10740
GLYSERARGA LAALAALALE ALAGLLEVAL TRPSERGLYA SNARGALAAL AALAPRLYSS 10800
ERALAALALE ASPALALEGL NGLNSERILE TYRLEGLNPR LYSALAALAT HRTYRCYSPR 10860
GLASNILEGL LYSALAGLAS PTYRLELEAS NPRSERPRLY SALAGLHISC YSPHEASPTY 10920
RASPLESERT YRLYSPRALA ASPLYSALAG LASNGLNALA VALALAVALG LYARGALAGL 10980
YALAVALALA ALAVALVALT YRASNASNGL LYSALAGLYL YSPRTHRLEG LYPHELEASN 11040
PRLELETYRS ERGLYALALE LYSALAGLYS ERSERPRTHR ASPILEILES ERGLYILESE 11100
RASPLYSALA ILEHISASPG LVALSERPRV ALGLYASPTH RASPALALEL EGLARGALAI 11160
LEMETGLYAL AGLGLALAAL ALYSALALES ERGLMETILE LEGLNSERGL LYSALALEVA 11220
LGLGLYSERT HRPHEALALY SALALETYRS ERSERALAAL ATHRGLYTHR TYRALASERS 11280
ERTHRTHRVA LTYRLYSALA ASNGLGLNPR THRTRPVALT YRARGALAAS NPHEGLVALG 11340
LTHRPRARGA LAASNASNTY RCYSSERASN GLNVALGLGL YPRTYRSERL ETYRSERGLY 11400
ARGALAPRVA LVALGLNTYR ALALEASNAR GALAGLNASN ASPPRASNAL APHEGLYVAL 11460
VALALAALAA RGALASERAL AILEGLNLEA SPGLYILEIL ETYRARGALA SERMETVALT 11520
RPGLGLALAG LNGLNVALSE RGLYLYSALA SERASNSERL EGLNTYRVAL ASNVALGLNV 11580
ALLYSALATH RGLYASPVAL LEPHEASNTH RLYSALAVAL GLYGLNALAT HRGLARGALA 11640
VALHISGLAS PLEASPVALA LAALAILEAS PALAALAGLV ALARGALAVA LLELELEASP 11700
GLALAASPVA LPHEMETGLG LARGALAVAL SERPRSERPH EGLASPVALT RPSERGLNPR 11760
ARGCYSGLNS ERVALPHEAS NPRASNILEP RLYSASPALA TYRSERPRHI SGLILETYRS 11820
ERARGASPPH ETHRASPILE THRALAGLYS ERSERILEGL YCYSASPGLY VALASNPRGL 11880
NTHRGLYLYS ASPGLYLEGL GLYSERPHEL YSASPLYSAS PPRGLLYSAS PPRLYSALAI 11940
LEGLLEPRAR GASPGLNILE ILEGLCYSAR GASPSERGLY LEVALMETLY SASPSERPRL 12000
ETYRPRTYRA RGASPVALHI SGLYPHEALA THRARGASPV ALLYSSERME TLYSASPVAL 12060
VALVALVALG LYGLYGLYAL ASERGLYALA TYRALAALAV ALARGASPTY RGLNVALGLM 12120
ETVALASNLY SGLALAGLYL EVALPRPHEG LNVALSERPR THRTHRLYSG LGLPRSERPH 12180
EGLNPRASPA SPVALTHRLE LELESERGLN ASPPRGLYHI STRPGLLYSG LGLYILESER 12240
ILEHISTHRC YSASPGLNAR GGLHISHISG LLEALAILEA LASERLYSGL ILEPRVALGL 12300
YTYRSERALA ALAASPILEA SPTHRASNAR GGLLEASPTH RGLNHISILE HISPRPRASP 12360
SERTYRPHEV ALSERPRLET HRARGGLPRG LYILECYSGL THRTHRPRGL YVALLYSGLP 12420
RSERASNASP PRASNPRPRG LTHRTYRSER LYSGLSERLE GLASPILEAR GLYSGLTYRL 12480
EVALALAASN GLYVALGLNA LAGLNALALE VALPRLYSPH EGLPRPRALA VALTYRASNA 12540
SPGLLELYSP HEGLYALATH RGLYASPGLT YRARGPHEGL YLYSPRVALG LYALAVALGL 12600
YSERALAALA THRALALELY SPHELEASPG LALALETHRT YRPRPRPRLY SPHEASNVAL 12660
ASPGLTHRAL APHETHRGLY ALATRPGLYA RGPHEARGGL NASPLEILES ERGLILELYS 12720
PRCYSCYSGL GLLYSPHETH RALAVALPHE THRPRSERIL EVALGLARGP HETHRASPTH 12780
RPRVALLETY RGLYPRLYSP HEVALTHRAS PASNGLYASP SERLYSPHEV ALTHRASNME 12840
TGLNALAALA LELELYSGLY PHEPRASPVA LALAALAHIS SERLETHRPR ARGGLYGLYS 12900
ERILELEPRM ETGLNGLVAL ALALETHRTH RARGGLYILE ASPVALALAL YSPRTHRGLY 12960
ARGGLYILEM ETLEASPTHR GLYARGGLYL YSGLSERCYS LYSGLYLETY RALAGLYHIS 13020
ARGGLYMETV ALPHESERIL EASPALAGLN GLYGLLYSGL YPRALAARGA RGARGGLYGL 13080
NLEGLYPHET RPGLYASNLY SGLYSERILE VALGLYPRAR GTRPLYSLEP RPHEMETGLY 13140
PRPHELEGLN SERVALASNP RLYSGLYTHR VALPHEPRSE RGLTHRGLGL YGLSERMETA 13200
LASERARGGL YVALASPPHE THRGLASPPR LELEGLNGLY ARGGLYVALL YSILESERGL 13260
YTRPASPVAL GLTHRLEGLY ASPGLILETH RHISVALGLY GLLYSPHETH RLYSGLYTYR 13320
LYSPRSERAL ASERSERGLY SERLYSHISA LAGLYGLNCY SGLYGLTYRH ISGLASNLYS 13380
HISPHETHRS ERLEGLGLLY SHISPHEVAL ASPTHRPHEG LYLEHISGLY HISLYSHISG 13440
LYGLYPRASN PHEGLGLNLE PRILEASNGL NPRARGHISG LYILEPRGLY GLYGLYILEA 13500
LATHRGLYAL AGLGLYILEL YSHISMETPH EGLYLEVALA LASERGLASP ALAGLYARGH 13560
ISPRVALGLV ALALAGLGLG LALASERLYS PRLYSHISVA LASPGLYPHE GLYILEHIST 13620
HRPHEARGHI SVALGLNLEL EGLNLEASNM ETGLTYRASP ASPASPILEL ECYSARGLYS 13680
SERLYSHISV ALTYRASPAL AVALGLNASP LYSILEALAP HEALASERTY RLEGLGLTYR 13740
ALAARGILEA SPALATHRTH RASNPRGLYM ETARGILEAS PTYRILEGLY GLYGLYASPL 13800
EPHEARGILE GLILEGLASN SERILEARGI LEGLASNGLN SERASPALAA SPGLYTYRSE 13860
RSERCYSSER THRLELYSIL EPHEGLGLNL EGLGLYMETS ERLESERLYS ILEPHESERT 13920
YRLYSMETAS NSERTHRLEA RGTYRLEPRP HEARGILEGL YLEHISPHEA RGTHRARGIL 13980
EHISLETHRV ALPRGLASPL EARGILEGLN ASPGLYSERG LNVALLYSIL EGLNGLYILE 14040
SERASNPRSE RGLYALALES ERSERGLYGL YLEGLYGLPR LYSILEGLNS ERLYSLEARG 14100
GLYLEVALGL NARGILEARG ASPALAMETA RGGLNARGIL EARGLEHISL EGLARGTHRG 14160
LYGLNLEGLY VALGLYSERA SPGLYASNPR VALVALALAG LYARGILESE RALATYRVAL 14220
GLGLYSERSE RARGILEVAL PRGLGLTYRV ALPRILETHR LYSILETYRS ERPHEPHEVA 14280
LGLYGLYALA VALPRGLASN LEARGILETY RVALTHRGLY GLSERTYRAL AGLYARGLYS 14340
ASPILEARGH ISGLYHISLY SLYSGLHISA SPLYSSERLY SPHETHRASP THRPRVALLE 14400
TYRGLYPRLY SLYSGLYASP ALAPRTHRIL EASPTHRSER ASNTYRPHEL EPHEGLYLYS 14460
LYSMETGLAS PASPLEARGL YSTYRTHRVA LPRSERTHRC YSGLYVALLY SLEGLMETTY 14520
RGLNGLYGLY ILEGLLESER ALALELEGLN METILEGLNA SPALAILEAR GLEPHESERT 14580
YRLEASPTHR GLNLEASNAR GLEGLYILET HRTYRTHRTH RTYRSERLYS LELYSASPLE 14640
VALLESERLE LEASNALALE GLNGLYGLYA RGLEASNTHR GLYALAVALI LEPRVALLEV 14700
ALARGLEASN VALILEASPP HEPRLYSLEG LNVALARGAL AALAALAARG ARGLESERAL 14760
AGLYSERARG LESERGLLEG LTRPILEARG LESERGLNLE GLSERGLYLY SLESERSERI 14820
LEALALEPRA RGLETHRASP LEGLILEASN ARGLEVALAL AHISSERVAL ALATHRTYRA 14880
LAARGLEVAL CYSPHEPHEP RTHRLYSLEV ALGLNASNAS PPHEASNTHR LELEARGMET 14940
ALAPRMETSE RGLGLASPLE ALATRPPHEA RGSERTHRPH EHISPRILEP RLYSMETGLY 15000
SERLESERAS PVALARGMET LYSSERILEG LGLLYSGLYG LGLYMETTHR ASNASPTYRI 15060
LESERALALE THRLYSASNA LAPHEILETH RASNTYRPRS ERGLGLNARG ASNALAGLYI 15120
LEGLNTHRSE RARGASNPHE SERARGPRLY SASNHISGLY THRSERTHRV ALALAPRGLN 15180
VALGLNALAS ERVALTYRAR GASNHISASN VALLESERAL AILEPRGLNG LPRTYRARGA 15240
SNILEASNME TLELETYRGL YTHRASPASP CYSSERGLYL YSASNLEASP GLLETRPILE 15300
VALGLYHISG LYALAVALAL AARGASNLEV ALGLYTHRSE RGLYPHETHR SERALAARGA 15360
SNMETHISAS PVALILEGLY ASNASPGLYT HRVALPRSER GLPHEARGAS NASNVALILE 15420
ILEGLNLEAS NARGASNSER METTHRASPC YSCYSILEGL THRTYRLEME TLYSSERGLA 15480
RGASNTHRLE ALAPHEPHES ERGLYASNGL VALILEASNA SPGLYPRSER SERLYSASNT 15540
HRPRVALPRS ERCYSPHEHI SPHEPHEILE TYRLYSGLYC YSTRPMETPH ELETYRARGA 15600
SNTYRPHEAL AGLTHRGLGL NVALMETPHE GLNPRGLYHI SILEVALARG PRASPGLYTH 15660
RGLYPHEARG LYSPRLETRP ARGHISTYRP HEGLNASNTH RGLNGLYILE ILEPHEVALV 15720
ALASPSERAS NASPARGPRV ALVALGLNVA LLEMETPRGL GLYMETASPS ERASPGLSER 15780
GLNALAILEL EASNASNILE GLYALAASPG LYGLNSERAL AGLNGLYALA SERPRGLYVA 15840
LVALILEALA SERPRSERLY SGLNASPLEP HEGLALAILE GLALAGLYAR GGLNTHRTYR 15900
ALASERCYST RPGLYGLYVA LGLYGLNGLY GLCYSARGGL YSERSERASN CYSLYSARGC 15960
YSTRPSERGL YVALPHETYR SERASNTRPI LEGLNGLLEL EARGARGSER METGLYLEGL 16020
SERARGSERA LAALAASPGL YLEALASERA LAILETHRSE RLYSSERALA ILESERGLNT 16080
YRGLYASPSE RPHEALALYS SERALAMETT HRLEPRARGS ERALAVALGL NSERASPVAL 16140
TRPARGSERA SPGLYGLNCY SSERASPLEL ELYSSERASP LYSLEASNVA LILEASPPHE 16200
PRLYSSERAS PTYRASPALA PHEILEARGS ERASPTYRGL NGLCYSALAA SPALAPRGLY 16260
GLNLYSSERA SPTYRSERAL ALEGLNSERG LNGLYLEILE LESERLEARG SERGLMETLE 16320
ALAGLGLNAS PLYSSERGLS ERASNPRGLY VALMETSERT HRARGSERGL YALAASPTHR 16380
HISLYSSERI LEVALILEAR GSERILETYR ALAILEASNS ERGLYARGSE RLEPRLEILE 16440
VALGLYASNS ERASPGLNGL GLYLYSSERG LNSERASPPH EGLSERGLPH ESERTHRALA 16500
LYSSERSERG LYALAVALTH RGLYGLNSER THRARGSERS ERSERALATY RGLSERLETH 16560
RSERALAVAL LYSSERTHRA SPTHRSERIL EASNVALARG SERVALVALG LASNASNASN 16620
ASPGLYLETH RALAALATYR ARGTHRALAL EPHEASPSER HISGLTYRAR GTHRALASER 16680
ASNPHEASPG LNPRHISSER ASPGLSERAL ALEGLNHISL EARGTHRCYS HISARGCYSC 16740
YSTHRTHRPH EALAPRASPA LATHRGLCYS GLASNCYSLY SHISTHRARG THRASPTYRS 16800
ERVALCYSGL YGLTHRTHRI LEPHELYSTH RGLYGLTHRT HRGLNILEHI SALAARGTHR 16860
GLYPRSERIL EGLNASPARG THRILESERA SNVALVALAS PASNGLLEAL AARGTHRLYS 16920
SERLEPRARG THRLEPRPRL EGLNTYRARG ASPLEASPLE LEPRLEHISG LNASNLEILE 16980
LYSTHRLEVA LSERTHRGLY ARGTHRPRAL AALAHISARG ALAARGTHRS ERGLYSERGL 17040
YSERSERSER PRGLPRARGT HRTHRASPVA LGLYTHRPHE GLYGLNLYST HRTHRGLMET 17100
THRGLNARGT HRTHRSERAS NPRGLTHRAR GTHRVALGLY SERSERCYSP RTYRCYSASP 17160
SERGLNALAP RGLNVALARG THRVALASNG LYGLYPHEGL NILEALAARG THRVALASNV 17220
ALASNASNLE LYSTHRVALT YRALAPHEAS PVALSERGLA SPGLYSERTY RLELYSTHRT 17280
YRGLVALVAL GLYASNVALT YRLYSVALAL ALEVALTYRG LYASPARGVA LALAPRASNS 17340
ERGLYALATY RLEASNGLAL AASPPHEARG VALALASERL ELEGLNARGV ALALATHRIL 17400
EGLYSERALA THRPHEALAA RGVALCYSAS NLEILEGLYL EMETGLYLEA RGVALASPAS 17460
NVALVALALA SERPHELYSV ALGLTYRSER ASPALAALAL YSVALPHEGL ALAGLYHISG 17520
LVALPRALAT YRGLNPRGLT HRALATYRGL ILEPHEHISA RGVALGLYSE RILEGLPHET 17580
HRALALEPRG LNLEGLNSER LEASPPHETH RLYSVALILE PRGLILEASP METPRSERHI 17640
SSERSERSER GLYTRPLYSV ALLEASPARG ASPPRASNHI SALALYSVAL LEPHELEGLY 17700
ARGVALLEIL EALAASPMET CYSARGARGV ALLEPRGLNV ALILEGLALA THRASNARGV 17760
ALGLNASNGL YALAVALTHR TRPGLSERAS PPRASNARGV ALGLNASNGL YALAVALTHR 17820
TRPGLSERAS PPRASNARGL YSVALSERAS NASPLEALAA RGVALTHRAL AMETARGTYR 17880
TRPTRPLECY SGLILEALAT YRCYSPHEAL ASERVALGLY GLYLYSVALV ALTHRASPSE 17940
RPHEARGVAL TYRSERVALA SPASNSERLY STRPASPASN LEASPSERAL AALALEASNT 18000
HRLYSTRPPH EALAGLASPP RSERARGTYR CYSALASERA LAGLNGLASP ASNALATHRL 18060
EGLNALALEL EARGTYRCYS GLYVALGLYV ALASNILELE TYRGLARGTY RGLALAALAI 18120
LEGLNGLYVA LALAALATHR ASPLYSTYRP HETYRGLYAS PASNTYRALA THRLEARGTY 18180
RGLYALATYR SERVALCYSS ERPRLYSTYR GLYGLTHRGL LYSSERGLYL EGLSERILEA 18240
LAALAALAAR GTYRILEALA ARGPRASPIL EMETLYSTYR LEASPGLNGL NILETHRALA 18300
GLTHRLYSTY RLEVALASPG LNLEASNPRG LGLYLYSTYR GLNPHEPRGL NTHRPRSERA 18360
RGTYRARGHI SLEPRPRGLT HRVALTHRGL YILELEGLYA RGALATHRPH ETRPTRPILE 18420
ASNSERILEL ELYSTYRTHR ALAGLGLYTY RGLALAALAT HRLYSTYRVA LASPALAGLY 18480
GLYPHEGLPR SERILELYS 18499

Claims (10)

1.黄曲霉毒素产毒真菌的产毒力指示分子快检试剂盒，其特征在于：包括孔底包被有指示黄曲霉毒素产毒菌产毒力的分子AFT-YJFZP008的纳米抗体或单克隆抗体的酶标板、指示黄曲霉毒素产毒菌产毒力的分子AFT-YJFZP008的多克隆抗体、起标准物质作用的指示黄曲霉毒素产毒菌产毒力的分子AFT-YJFZP008纯品溶液、察氏培养基或其他适宜产毒黄曲霉菌生长的培养基、与指示黄曲霉毒素产毒菌产毒力的分子AFT-YJFZP008多克隆抗体发生结合反应的辣根过氧化物酶标记抗体、ELISA显色液与终止液、样品稀释液；
所述的指示黄曲霉毒素产毒菌产毒力的分子是指AFT-YJFZP008肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1 所示。
2.根据权利要求1所述的黄曲霉毒素产毒真菌的产毒力指示分子快检试剂盒，其特征在于：所述的孔底包被有指示黄曲霉毒素产毒菌产毒力的分子AFT-YJFZP008的纳米抗体或单克隆抗体的酶标板，是通过如下方法制备获得：将AFT-YJFZP008的纳米抗体或单克隆抗体溶解在ELISA包被缓冲液中，形成0.2-8.0 μg/mL的包被液，再加入至酶标板中，4 ℃放置过夜或者37 ℃放置不少于2 h后，去除上述酶标板中包被液，再用ELISA常规洗液洗涤酶标板；然后加入ELISA常规封闭液，放置室温或37 ℃封闭不少于1 h后，再弃去封闭液，再用ELISA常规洗液洗涤酶标板。
3.根据权利要求1所述的黄曲霉毒素产毒真菌的产毒力指示分子快检试剂盒，其特征在于：指示黄曲霉毒素产毒菌产毒力的分子AFT-YJFZP008的多克隆抗体为指示黄曲霉毒素产毒菌产毒力的分子AFT-YJFZP008兔源多克隆抗体，所述的辣根过氧化物酶标记抗体为辣根过氧化物酶标记羊抗兔抗体。
4.根据权利要求1所述的黄曲霉毒素产毒真菌的产毒力指示分子快检试剂盒，其特征在于：所述的ELISA显色液是指ELISA常规的双氧水与TMB显色液；
所述的终止液是指ELISA常规的显色终止液：2mol/L硫酸水溶液。
5.根据权利要求1所述的黄曲霉毒素产毒真菌的产毒力指示分子快检试剂盒，其特征在于：所述的样品稀释液是指含有0.1%山梨醇和0.1%糖的0.01 mol/L 磷酸盐缓冲液。
6.权利要求1所述的黄曲霉毒素产毒真菌的产毒力指示分子快检试剂盒的使用方法，包括以下步骤：
用试剂盒中的察氏培养基或其他适宜产毒黄曲霉菌生长的培养基培养并制备待鉴别菌株或待鉴别样品的待测液；
将待鉴别菌株的待测液用样品稀释液稀释，将稀释后待鉴别菌株的待测液或待鉴别样品的待测液，以每孔100-200 μL加入到试剂盒中的酶标板孔中，放置室温或37 ℃反应不少于1 h后，弃去反应后液体，洗涤酶标板；
然后加入试剂盒中AFT-YJFZP008多克隆抗体，每孔加入100-200μL，放置室温或37 ℃反应不少于1 h后，弃去液体，再洗涤酶标板；
然后每孔加入试剂盒中的辣根过氧化物酶标记抗体100-200μL，放置室温或37 ℃反应不少于1 h后，弃去液体，再洗涤酶标板；
然后先后加入试剂盒中的ELISA显色液、终止液，最后通过酶标仪读取并计算待测样品中AFT-YJFZP008的浓度。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，用系列浓度的起标准物质作用的指示黄曲霉毒素产毒菌产毒力的分子AFT-YJFZP008纯品溶液，替换待测液，用于制作标准曲线，计算得到待测样品中AFT-YJFZP008的浓度。
8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，还包括：检测结果评判：根据酶标仪结果，获得单位体积待鉴别菌株待测液中指示黄曲霉毒素产毒菌产毒力的分子AFT-YJFZP008的含量，分析待鉴别菌株的黄曲霉毒素产毒力，待鉴别菌株中指示黄曲霉毒素产毒菌产毒力的分子AFT-YJFZP008浓度越高，则说明鉴别菌株产黄曲霉毒素能力即产毒力越强；
根据酶标仪结果，获得单位体积待鉴别样品的待测液中指示黄曲霉毒素产毒菌产毒力的分子AFT-YJFZP008的含量，判定待鉴别样品中是否含有黄曲霉毒素的强产毒力菌株。
9. 根据权利要求6所述的方法，其特征在于，待鉴别菌株的待测液的制备：待鉴别菌株培养，稀释，获得待鉴别菌株的待测液；具体为：将待鉴别菌株在常规察氏培养基或者其他适宜产毒黄曲霉菌生长的培养基培养，培养的环境温度为15 ~ 35 ℃，培养时间不少于12h后，取培养基与培养物的混合体充分匀浆，再用无菌水稀释1-10倍，获得待鉴别菌株的待测液；待鉴别样品液的制备：待鉴别样品培养，获得待鉴别样品的待测液；
具体可为：称量待鉴别样品，转移至样品稀释液中，室温震荡至均匀，制成待测样品均匀分散液，取 10-1000 µL样品均匀分散液加在6-600 mL常规察氏培养基或者其他适宜产毒黄曲霉菌生长的培养基中，置于15-35°C下200±50 rpm震荡培养，培养6-24 h后取样，形成待鉴别样品的待测液。
10.权利要求1所述的黄曲霉毒素产毒真菌的产毒力指示分子快检试剂盒在鉴别曲霉属菌株产黄曲霉毒素能力或鉴别农田、农产品及饲料中是否存在强产毒力的黄曲霉毒素产毒菌株中的应用，所述样品为农田、农产品、中药材或饲料。
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