CN103018458A - 超灵敏黄曲霉毒素b1酶联免疫检测试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种超灵敏黄曲霉毒素B₁酶联免疫检测试剂盒，所述试剂盒包括黄曲霉毒素B₁标准溶液，固相载体，酶标记物，底物显色液，样品稀释液，终止液及浓缩洗涤液，其中，所述固相载体为微孔板，由黄曲霉毒素B₁单克隆抗体包被，所述酶标记物是有辣根过氧化物标记的黄曲霉毒素B₁蛋白偶联物，底物显色液为四甲基联苯胺(TMB)。本发明还公开了一种超灵敏黄曲霉毒素B₁酶联免疫检测试剂盒的制备方法及检测黄曲霉B₁的方法。使用本发明制备的试剂盒黄曲霉毒素B₁，具有操作简便，灵敏度高，特异性好，线性好等特点。

Description

超灵敏黄曲霉毒素B1酶联免疫检测试剂盒

技术领域

本发明涉及分析检测试剂领域，更具体地说，涉及一种检测黄曲霉毒素B₁的酶联免疫分析测定试剂盒及其制备、使用方法。

背景技术

黄曲霉毒素(Aflatoxin，AF)是一种极强的剧毒物质，已被世界卫生组织的癌症研究机构划定为1类致癌物。黄曲霉毒素是黄曲霉和寄生曲霉中产毒菌株的代谢产物，普遍存在于霉变的粮食、饲料及其制品中。黄曲霉毒素B₁、B₂、G₁及G₂是粮食和食品中黄曲霉毒素主要存在形式，其中黄曲霉毒素B₁的毒性和致癌性最强。由于自然界黄曲霉产毒菌株产生的毒素以AFB₁的为主，而且其毒性和致癌性最大，因此，在检验中通常都以AFB₁作为分析指标。

黄曲霉毒素B₁的分子式为C₁₇H₁₂O₆，化学结构如下：

其结构中含有一个双呋喃环和一个香豆素，前者为基本毒性结构，后者与其致癌性有关。黄曲霉毒素B1对雏鸭的半致死量仅为0.3mg/kg体重，其毒性为氰化钾的10倍，砒霜的68倍。当食品、饲料及其相关制品保存不当极易受到黄曲霉毒素B1的污染，黄曲霉毒素B1进入人体后，其主要靶器官为肝脏，急性中毒症状为恶心、呕吐、胃肠大出血而死亡。慢性中毒主要会引起肝癌，还可以诱发骨癌、肾癌、直肠癌等。目前，我国规定各种食物或饲料中黄曲霉毒素B₁的最高允许量根据来源不同为0.5～20.0μg/Kg。国际上AFT最大允许含量不断降低，2004年欧盟再次修订对婴儿和儿童食品中AFT的限量标准，包括谷类食品在内的婴幼儿食品以及具有特殊医疗目的的婴儿食品，AFB1的最大允许限量均为0.10ug/kg。因此，建立简便，快捷，超灵敏，低浓度预警的黄曲霉毒素B1检测方法显得尤为重要。

目前，国内检测黄曲霉毒素常用的仪器方法有薄层色谱法、高效液相色谱法、微柱层析法。薄层色谱法是最早应用于黄曲霉毒素检测的方法，在黄曲霉毒素鉴定分离方面具有重要地位。其原理是利用样品中的黄曲霉毒素与其它物质在固定相硅胶和流动相中的分配系数不同，达到分离的目的，再用365nm波长的紫外线激发黄曲霉素产生荧光，根据荧光的强弱与标准品比较测定含量。但此方法灵敏度低、特异性不强，样品处理繁琐，分析时间长，进行目测定量分析时主观性影响较大。黄曲霉毒素的高效液相色谱法包括正相液相色谱法(NP-HPLC)和反相液相色谱法(RP-HPLC)，检测器可用紫外检测器和荧光检测器，由于HPLC-荧光检测器灵敏度比紫外检测器高30-40倍，所以目前多使用HPLC-荧光检测器。但此法测定中最大问题是主要黄曲霉毒素的荧光发射依赖于溶剂的组成，黄曲霉毒素B1的荧光强度较强但在含水的溶剂中容易发生淬灭。微柱层析法主要利用硅镁型吸附剂吸附黄曲霉毒素后，在365nm波长紫外灯下呈蓝紫色荧光带，再与系列定量标准溶液的微柱管比较进行半定量，灵敏度为5-10ug/kg，回收率在90％以上，但需其他分析方法进一步测定确认。这些方法测定的准确度较高，重复性较好，但往往需配备大型较昂贵的设备，费用高，对操作人员要求高，一般适于在国家或地区级研究所或科研单位大型实验室中应用。

随着生物技术的不断发展，免疫分析法的应用开辟了黄曲霉毒素B1检测的新领域。目前常用的方法有放射免疫分析法、荧光免疫分析法、酶联免疫分析法等。其中，放射性免疫分析虽高灵敏、高特异性，但存在有效期短、具有放射性污染的问题；荧光免疫分析法虽然特异性强、敏感性高、速度快，但非特异性染色问题尚未解决，结果判定的客观性不足，程序也比较复杂。而酶联免疫法集合了抗原抗体反应的高特异性与酶促反应的高度敏感性。这种方法灵敏度高，比薄层法提高了近200倍；特异性强，荧光物质、色素、结构类似物对结果无干扰；而且回收率高，提取方法简单，可进行定性定量测定。但目前黄曲霉毒素B₁的酶联免疫分析方法的检测限通常只能达到0.1ng/mL，而对于更低浓度的黄曲霉毒素B₁则不能进行准确定量。由于黄曲霉毒素B₁的慢性毒性强，若能在产黄曲霉毒素细菌生长的初期就将其鉴别出来，对于社会、经济效益均有重要意义，因此，我们研发了比传统酶联免疫试剂盒灵敏度更高的超灵敏黄曲霉毒素B₁检测试剂盒。

发明内容

为了解决上述现有技术存在的不足，本发明提供一种超灵敏、检测范围宽、操作快捷、无毒无污染而且所用仪器简单经济的检测黄曲霉毒素B₁灵敏度达到0.005ng/mL的酶联免疫分析检测试剂盒，同时提供其制备方法，以及检测方法。

本发明的一个目的是提供一种检测黄曲霉毒素B₁的酶联免疫检测超灵敏试剂盒，所述试剂盒包括黄曲霉毒素B₁标准溶液，固相载体，酶标记物，底物显色液，样品稀释液，终止液及浓缩洗涤液。试剂盒有两种实现形式：

第一种，其中，所述固相载体为微孔板，所述微孔板由黄曲霉毒素B₁单克隆抗体包被，所述酶标记物为辣根过氧化物酶标记的黄曲霉毒素B₁完全抗原，所述底物显色液含四甲基联苯胺(TMB)，终止液含硫酸。

第二种，其中，所述固相载体为微孔板，所述微孔板由黄曲霉毒素B₁完全抗原包被，所述酶标记物为辣根过氧化物酶标记的黄曲霉毒素B₁单克隆抗体，所述底物显色液含四甲基联苯胺(TMB)，终止液含硫酸。

优选地，所述抗体是黄曲霉毒素B₁的特异性高亲和力单克隆抗体，间接ELISA效价达1∶32万。

优选地，所述酶标抗原是黄曲霉毒素B₁完全抗原与辣根过氧化物酶偶联物

优选地，酶与完全抗原的偶联比是3∶1～8∶1

所述酶标抗原含有：

黄曲霉毒素B₁完全抗原

优选地，黄曲霉毒素B₁与蛋白比是：8∶1～14∶1

辣根过氧化物酶标记黄曲霉毒素B₁单克隆抗体

优选地，酶与抗体的偶联比是：3∶1～8∶1

所述底物显色液含有：

四甲基联苯胺(TMB)

所述样品稀释液含有：

磷酸一氢钠

磷酸氢二钠

所述终止液含有：

硫酸            10～30％

优选地，硫酸    15％

所述浓缩洗涤液含有：

优选地，所述浓缩洗涤液含有：

本发明的另一目的是提供一种检测黄曲霉毒素B₁的酶联免疫检测超灵敏试剂盒的制备方法，所述方法包括如下步骤：

A、制备固相载体：将0.05mol/L碳酸盐缓冲液(pH值为9.0-9.6)与曲霉毒素B₁的特异性高亲和力单克隆抗体或完全抗原以适当比例混合，将混合液负载于载体上，用含0.05％吐温20(体积)的磷酸盐缓冲液洗涤后，用保护液封闭保护上述洗涤后的载体；

B、制备辣根过氧化物酶标记的黄曲霉毒素B₁的完全抗原或单克隆抗体：采用改进过的高碘酸钠法制备辣根过氧化物酶标记的黄曲霉毒素B₁的完全抗原或单克隆抗体，采用棋盘滴定法选择最佳的酶标记物的工作浓度。酶标抗原或抗体溶于酶稀释液中以制备抗原或抗体工作溶液；

C、制备底物显色液

a)显色A溶液的制备：以DMSO为稀释液配制成较低浓度的TMB溶液即成。

b)显色B溶液的制备：以去离子水为稀释液配制成一定浓度的一水合柠檬酸、过氧化氢尿素和十二水磷酸一氢钠混合液即成。

D、制备浓缩洗涤液：

浓缩洗涤液中含有：

优选地，所述浓缩洗涤液中含有：

E、制备黄曲霉毒素B₁标准溶液：用黄曲霉毒素B₁的纯品配制，分装0、0.1、0.3、0.9、2.7、8.1ng/mL共6瓶，过滤除菌、分装、低温避光保存。

F、制备终止液：

终止液含有：

硫酸            15％(质量)

G、制备样品提取液

所述样品提取液含有：

甲醇            50～80％   (体积)

N_aCL            2～10％    (重量)

优选地，所述样品提取液含有：

甲醇            70％       (体积)

N_aCL            4％        (重量)

本发明的再一目的提供一种检测黄曲霉毒素B₁的方法，其中所述方法包括以下步骤：

A.样品前处理：

将所述样品粉碎成粉末，与样品提取液按1∶5比例混合，过筛后取上清液4℃保存，使用时用样品稀释液1∶9体积稀释为样品液。

B.使用前述两种试剂盒任一种所述试剂盒及微孔板酶标分析仪检查定量样品液黄曲霉毒素B₁的含量。

优选地所述步骤B包括：

a)加标准品或样本：价标准品或样品30～60uL到对应微孔板中，加AFB₁酶标物30～60uL/孔，震荡摇匀，用盖板膜盖板后室温或37℃反应20～60min。

b)洗板：揭开盖板膜，将孔内液体甩干，用洗涤工作液200～300uL/孔，充分洗涤数次，每次间隔30s，用吸水纸拍干。

c)显色：加入显色液50～150uL/孔，盖板后置室温或37℃避光反应10～20min。

d)测定：加入终止液20～60uL/孔，震荡摇匀，设定酶标仪于450检测，测定每孔OD值。

e)结果判定：在微孔板酶标仪上测量OD值，与根据标准品OD值的标准曲线对比，确定样品液中黄曲霉毒素B₁的含量。

优选地，所述步骤B)中反应温度为37℃；所述黄曲霉毒素B₁标准品或样品液的加入体积为50uL/孔，所述酶标记物的加入体积50uL/孔，所述显色液的体积100uL/孔，所述洗涤工作液体积300uL/孔，所述终止液体积50uL/孔。

本发明酶联免疫分析法测定黄曲霉毒素B₁的原理：本试剂盒采用直接竞争ELISA方法，在酶标板微孔条上预包被黄曲霉毒素B₁抗体，样本中黄曲霉毒素B₁和酶标抗原竞争结合黄曲霉毒素B₁抗体，经TMB底物显色，样本吸光值与其含有的黄曲霉毒素B₁成负相关，与标准曲线比较再乘以其对应稀释倍数，即可得样品液中黄曲霉毒素B₁的含量。

本发明提供了一种超灵敏黄曲霉毒素B₁酶联免疫检测试剂盒及其检测方法，与现有技术相比，具有以下有益效果：

1.超高灵敏度、高特异性、高效性、高稳定性：与现有的黄曲霉毒素B₁酶联免疫检测试剂盒相比，本发明的试剂盒不仅保留了传统试剂盒的高特异性、高效、高稳定性的特点，更具有超过现有试剂盒的灵敏度的超高灵敏度，灵敏度为现有试剂盒的近20倍，可达0.005ng/mL。

2.检测时间短，操作简单，误差较小：与传统的试剂盒相比，本发明的试剂盒检测时间短于60min，而且只需要加入酶标记物即可反应，传统的试剂盒还需反应后再加入酶标二抗反应，因此，本发明的试剂盒操作更简单，所需的检测时间更短，误差较小。

3.使用成本低，更易推广：不需要大型设备，只需配合体积较小的酶标仪即可检测，所需时间短，操作方便，携带便捷，更易适合社区家庭使用，有很好的推广价值。

4.同时提供了一种超灵敏黄曲霉毒素B₁酶联免疫检测试剂盒制备方法：该方法简单可行，批间差异小，稳定性高，适合于批量生产和质量控制。

附图说明

图1为检测黄曲霉毒素B1的标准曲线图。

具体实施方式

以下所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的保护范围

实施例1

一种超灵敏黄曲霉毒素B₁酶联免疫检测试剂盒的制备

1.制备黄曲霉毒素B₁标准溶液：

用黄曲霉毒素B₁的纯品配制，分装0、0.1、0.3、0.9、2.7、8.1ng/mL共6瓶，过滤除菌、分装、低温避光保存。

2.黄曲霉毒素B₁单克隆抗体包被微孔板：

1)包被

采用0.05mol/L pH为9.6的碳酸盐缓冲液与合适浓度的黄曲霉毒素B₁单克隆抗体混合制成包被液，并将其负载于固相载体上，微孔板每孔100μL，4℃过液。

2)洗涤

用含0.05％吐温20(体积)的磷酸盐缓冲液洗涤。

3)保护

将保护液加入已洗涤好的固相载体上，每孔150μL，37℃放置1小时，甩掉保护液，在吸水纸上拍干，37℃干燥箱中干燥1小时，立即进行真空封袋，封袋时每袋放入一个干燥剂。封袋后放置30分钟检查有无漏气，如果漏气需重新封袋。检查无漏气后贴上标签2～8℃保存。

3.酶标抗原的制备：

采用改进过的高碘酸钠法制备辣根过氧化物酶来标记黄曲霉毒素B₁完全抗原，采用棋盘滴定法选择最佳的酶标抗原工作浓度。酶标抗原溶于酶稀释液中。

4.底物显色液的制备：

1)显色A溶液的制备：以DMSO为稀释液配制成较低浓度的TMB溶液即成。

2)显色B溶液的制备：以去离子水为稀释液配制成一定浓度的一水合柠檬酸、过氧化氢尿素和十二水磷酸一氢钠混合液即成。

5.终止液的制备：

用超纯水将浓硫酸配制成15％的硫酸溶液(质量体积分数)。

6.浓缩洗涤液的制备：

所述浓缩洗涤液中含有：

优选地，所述浓缩洗涤液中含有：

使用时用超纯水稀释10倍。

将以上步骤所得产品分装即得半成品，经抽检合格后组装为成品，4℃保存。

实例2

一种黄曲霉毒素B₁酶联免疫检测试剂盒的制备

1.黄曲霉毒素B₁完全抗原包被微孔板：

1)包被

采用0.05mol/L pH为9.6的碳酸盐缓冲液与合适浓度的黄曲霉毒素B₁完全抗原混合制成包被液，并将其负载于固相载体上，微孔板每孔100μL，4℃过液。

2)洗涤

用含0.05％吐温20(体积)的磷酸盐缓冲液洗涤。

3)保护

将保护液加入已洗涤好的固相载体上，每孔150μL，37℃放置1小时，甩掉保护液，在吸水纸上拍干，37℃干燥箱中干燥1小时，立即进行真空封袋，封袋时每袋放入一个干燥剂。封袋后放置30分钟检查有无漏气，如果漏气需重新封袋。检查无漏气后贴上标签2～8℃保存。

2.酶标抗体的制备：

采用改进过的高碘酸钠法制备辣根过氧化物酶来标记黄曲霉毒素B₁的单克隆抗体，采用棋盘滴定法选择最佳的酶标抗体工作浓度。酶标抗体溶于酶稀释液中。

3.浓缩洗涤液的制备：

所述浓缩洗涤液中含有：

优选地，所述浓缩洗涤液中含有：

使用时用超纯水稀释10倍。

其余步骤同实施例1

实施例3

使用本发明实施例1～2所制备的酶联免疫试剂盒检测黄曲霉毒素B₁的方法

1.样品前处理：

将所述样品粉碎成粉末，与样品提取液按1∶2比例混合，过筛后取上清液4℃保存，使用时用样品稀释液1∶9体积稀释为待测液，此时已稀释20倍。

2.使用超灵敏黄曲霉毒素B₁酶联免疫检测试剂盒检测所述样品黄曲霉毒素B1的含量。

1)将试剂盒从4℃取出，室温放置1小时，在包被好的微孔板中加入黄曲霉毒素B1标准溶液或待测液50μL/孔，酶标记物50μL/孔，混匀后25℃温育30分钟；

2)将上述微孔板用洗涤液洗涤后，加底物显色液100μL/孔，25℃避光反应5min；

3)在上述微孔板孔中加入终止液50μL/孔，用酶标仪检测450nm处的吸光度值。根据标准溶液的吸光值做出标准曲线，以浓度为0的标准溶液孔的吸光度值为对照，其他浓度的标准溶液吸光度值与其的比值为纵坐标，标准品浓度的对数值为横坐标，做出的标准曲线线性方程为Y＝-42.645X-20.186，R²＝0.9832(X表示标准溶液浓度值)。将样品的吸光度值与标准曲线进行对比，确定样品中黄曲霉毒素B₁的含量。

实施例4

使用本发明实施例1～2所制备的酶联免疫试剂盒检测黄曲霉毒素B₁的方法

1.样品前处理：

将所述样品粉碎成粉末，与样品提取液按1∶4比例混合，过筛后取上清液4℃保存，使用时用样品稀释液1∶9体积稀释为待测液，此时已稀释40倍。

2.使用超灵敏黄曲霉毒素B₁酶联免疫检测试剂盒检测所述样品黄曲霉毒素B1的含量。

1)将试剂盒从4℃取出，室温放置1.5小时，在包被好的微孔板中加入黄曲霉毒素B1标准溶液或待测液50μL/孔，酶标记物50μL/孔，混匀后37℃温育40分钟；

2)将上述微孔板用洗涤液洗涤后，加底物显色液100μL/孔，37℃避光反应10min；

3)在上述微孔板孔中加入终止液50μL/孔，用酶标仪检测450nm处的吸光度值。根据标准溶液的吸光值做出标准曲线，以浓度为0的标准溶液孔的吸光度值为对照，其他浓度的标准溶液吸光度值与其的比值为纵坐标，标准品浓度的对数值为横坐标，做出的标准曲线线性方程为Y＝-42.72 X-20.70，R²＝0.99(X表示标准溶液浓度值)。将样品的吸光度值与标准曲线进行对比，确定样品中黄曲霉毒素B₁的含量。

实施例5

使用本发明实施例1～2所制备的酶联免疫试剂盒检测黄曲霉毒素B₁的方法

1.样品前处理：

将所述样品粉碎成粉末，与样品提取液按1∶5比例混合，过筛后取上清液4℃保存，使用时用样品稀释液1∶9体积稀释为待测液，此时已稀释50倍。

2.使用超灵敏黄曲霉毒素B₁酶联免疫检测试剂盒检测所述样品黄曲霉毒素B1的含量。

1)将试剂盒从4℃冰箱取出，室温放置2小时，在包被好的微孔板中加入黄曲霉毒素B1标准溶液或待测液50μL/孔，酶标记物50μL/孔，混匀后37℃温育60分钟；

2)将上述微孔板用洗涤液洗涤后，加底物显色液100μL/孔，37℃避光反应15min；

3)在上述微孔板孔中加入终止液50μL/孔，用酶标仪检测450nm处的吸光度值。根据标准溶液的吸光值做出标准曲线，以浓度为0的标准溶液孔的吸光度值为对照，其他浓度的标准溶液吸光度值与其的比值为纵坐标，标准品浓度的对数值为横坐标，做出的标准曲线线性方程为Y＝-42.706 X-20.645，R²＝0.9926(X表示标准溶液浓度的自然对数值)。将样品的吸光度值与标准曲线进行对比，确定样品中黄曲霉毒素B₁的含量。

实施例6本发明制备试剂盒的方法学鉴定

对本发明实施例1-2所制备的试剂盒进行方法学鉴定

表1试剂盒的技术指标测试结果

从上述检测鉴定结果得知，本发明试剂盒灵敏度高了一个数量级以上，可达到0.005ng/mL；特异性、精密度也有很大提高。

实施例7本发明试剂盒标准曲线的绘制

1)将试剂盒从4℃冰箱取出，恢复至室温，在包被好的微孔板中加入黄曲霉毒素B1标准溶液50μL/孔，酶标记物50μL/孔，混匀后37℃温育40分钟；

2)将上述微孔板用洗涤液洗涤后，加底物显色液100μL/孔，37℃避光反应15min；

3)在上述微孔板孔中加入终止液50μL/孔，用酶标仪检测450nm处的吸光度值。根据标准溶液的吸光值做出标准曲线，以浓度为0的标准溶液孔的吸光度值为对照，其他浓度的标准溶液吸光度值与0浓度吸光值的比值为纵坐标，标准品浓度的自然对数值为横坐标，做出的标准曲线线性方程为Y＝-17.501n(X)-9.411，R²＝0.995(x表示标准溶液浓度值)。采用较佳条件制作的标准曲线，试验数据表明标准溶液吸光值与标准品浓度的对数值有很好的线性关系。

表2制作标准曲线的实验数据

标准溶液浓度值(ng/ml)	吸光值	相对吸光值
			0	1.612	100
0.005	1.372	85.1
			0.015	1.015	63
0.045	0.715	44.4
			0.14	0.357	22.1
0.41	0.144	8.9

Claims (9)

1.一种检测黄曲霉毒素B₁的酶联免疫检测超灵敏试剂盒，所述试剂盒包括黄曲霉毒素B₁标准溶液，固相载体，酶标记物，底物显色液，样品稀释液，终止液及浓缩洗涤液，其特征在于，所述固相载体为微孔板，且所述微孔板由黄曲霉毒素B1单克隆抗体包被，所述酶标记物为辣根过氧化物酶标记的黄曲霉毒素B1完全抗原，所述底物显色液含四甲基联苯胺(TMB)，终止液含硫酸。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述抗体是黄曲霉毒素B1的特异性高亲和力单克隆抗体，间接ELISA效价达1∶32万；所述酶标抗原是黄曲霉毒素B1完全抗原与辣根过氧化物酶偶联物；酶与完全抗原的偶联比是3∶1～8∶1。

3.根据权利要求2所述试剂盒，其特征在于，所述酶标抗原含有：

黄曲霉毒素B1完全抗原

辣根过氧化物酶

所述黄曲霉毒素B1完全抗原的黄曲霉毒素B1与蛋白偶联比是：8∶1～14∶1

所述酶与抗体的偶联比是：3∶1～8∶1

4.根据权利要求1～3任一项所述试剂盒，其特征在于，所述浓缩洗涤液含有：

5.根据权利要求4所述试剂盒，其特征在于，所述浓缩洗涤液含有：

6.一种检测黄曲霉毒素B1的酶联免疫检测超灵敏试剂盒的制备方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

A、制备固相载体：将0.05mol/L碳酸盐缓冲液(pH值为9.0-9.6)与曲霉毒素B1的特异性高亲和力单克隆抗体或完全抗原以适当比例混合，将混合液负载于载体上，用含0.05％吐温20(体积)的磷酸盐缓冲液洗涤后，用保护液封闭保护上述洗涤后的载体；

B、制备辣根过氧化物酶标记的黄曲霉毒素B1的完全抗原或单克隆抗体：采用改进过的高碘酸钠法制备辣根过氧化物酶标记的黄曲霉毒素B1的完全抗原或单克隆抗体，采用棋盘滴定法选择最佳的酶标记物的工作浓度。酶标抗原或抗体溶于酶稀释液中以制备抗原或抗体工作溶液；

C、制备底物显色液

a)显色A溶液的制备：以DMSO为稀释液配制成较低浓度的四甲基联苯胺(TMB)溶液即成。

b)显色B溶液的制备：以去离子水为稀释液配制成一定浓度的一水合柠檬酸、过氧化氢尿素和十二水磷酸一氢钠混合液即成。

D、制备浓缩洗涤液：

浓缩洗涤液中含有：

E、制备黄曲霉毒素B1标准溶液：用黄曲霉毒素B1的纯品配制，分装0、0.1、0.3、0.9、2.7、8.1ng/mL共6瓶，过滤除菌、分装、低温避光保存。

F、制备终止液：

终止液含有：

硫酸                15％(质量)

G、制备样品提取液

所述样品提取液含有：

甲醇                50～80％(体积)

NaCL                2～10％(重量)

7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述浓缩洗涤液含有：

所述样品提取液含有：

甲醇     70％    (体积)

NaCL     4％     (重量)

8.一种检测黄曲霉毒素B1的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

1)样品的前处理：

将所述样品粉碎成粉末，与样品提取液按1∶5比例混合，过筛后取上清液4℃保存，使用时用样品稀释液1∶9体积稀释为样品液。

2)使用前述两种试剂盒任一种所述试剂盒及微孔板酶标分析仪检查定量样品液黄曲霉毒素B1的含量。

其中，所述步骤2)包括

A.加标准品或样本：加标准品或样品30～60uL到对应微孔板中，加AFB1酶标物30～60uL/孔，震荡摇匀，用盖板膜盖板后室温或37℃反应20～60min。

B.洗板：揭开盖板膜，将孔内液体甩干，用洗涤工作液200～300uL/孔，充分洗涤数次，每次间隔30s，用吸水纸拍干。

C.显色：加入显色液50～150uL/孔，盖板后置室温或37℃避光反应10～20min。

D.测定：加入终止液20～60uL/孔，震荡摇匀，设定酶标仪于450检测，测定每孔OD值。

E.结果判定：在微孔板酶标仪上测量OD值，与根据标准品OD值的标准曲线对比，确定样品液中黄曲霉毒素B1的含量。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述步骤2)中反应温度为37℃；所述黄曲霉毒素B1标准品或样品液的加入体积为50uL/孔，所述酶标记物的加入体积50uL/孔，所述显色液的体积100uL/孔，所述洗涤工作液体积300uL/孔，所述终止液体积50uL/孔。温育时间为40min，避光反应时间为15min。

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