CN111521824A - 一种检测黄曲霉素b1的酶联免疫检测方法及其试剂盒 - Google Patents

一种检测黄曲霉素b1的酶联免疫检测方法及其试剂盒 Download PDF

Info

Publication number
CN111521824A
CN111521824A CN202010418170.7A CN202010418170A CN111521824A CN 111521824 A CN111521824 A CN 111521824A CN 202010418170 A CN202010418170 A CN 202010418170A CN 111521824 A CN111521824 A CN 111521824A
Authority
CN
China
Prior art keywords
aflatoxin
solution
antigen
hole
liquid
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202010418170.7A
Other languages
English (en)
Inventor
孙惠洁
于兴华
张丽丽
翁正杭
杨鸿乐
李欣
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Xinda An Testing Technology Tianjin Co ltd
Original Assignee
Xinda An Testing Technology Tianjin Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Xinda An Testing Technology Tianjin Co ltd filed Critical Xinda An Testing Technology Tianjin Co ltd
Priority to CN202010418170.7A priority Critical patent/CN111521824A/zh
Publication of CN111521824A publication Critical patent/CN111521824A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6854—Immunoglobulins
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/5308—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for analytes not provided for elsewhere, e.g. nucleic acids, uric acid, worms, mites

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

本发明涉及黄曲霉素B1检测技术领域，公开了一种检测黄曲霉素B1的酶联免疫检测方法，包括以下步骤：将黄曲霉毒素B1抗抗体与辣根过氧化物酶进行偶联得到酶标记的黄曲霉毒素B1抗抗体；用包被缓冲液将包被黄曲霉毒素B1抗原稀释，注孔，避光孵育，倾去孔中液体，用洗涤液洗涤，静置，拍干，然后在孔中加入封闭液，再避光孵育，倾去孔内液体拍干，干燥后得到酶标板，用铝膜真空密封保存；建立黄曲霉毒素B1标准品浓度相对吸光度的标准曲线，并根据该标准曲线由待测样品的吸光度推算出待测样品中的黄曲霉毒素B1含量；该方法在15min内显色，检测黄曲霉毒素B1变异系数在5.3‑8.5％之间，精密度较高；并提供采用该酶联免疫检测方法进行检测的试剂盒。

Description

一种检测黄曲霉素B1的酶联免疫检测方法及其试剂盒
技术领域
本发明涉及黄曲霉素B1检测技术领域，具体涉及一种检测黄曲霉素B1的 酶联免疫检测方法及其试剂盒。
背景技术
黄曲霉毒素B1(aflatoxinB1称AFB1)是真菌的次级代谢产物，主要是由 黄曲霉(Aspergillusflavus)、寄生曲霉(Aspergillusparasiticus)和特曲霉(Aspergillusnomius)产生。它易天然存在于花生、棉籽、玉米、小麦和稻米等 农作物中，具有强烈的毒性和致癌性。
黄曲霉毒素B1的分子式为C17H12O6，化学结构如下：
Figure BDA0002495814320000011
其结构中含有一个双呋喃环和一个香豆素，前者为基本毒性结构，后者与 其致癌性有关。黄曲霉毒素B1对雏鸭的半致死量仅为0.3mg/kg体重，其毒性 为氰化钾的10倍，砒霜的68倍。当食品、饲料及其相关制品保存不当极易受 到黄曲霉毒素B1的污染，黄曲霉毒素B1进入人体后，其主要靶器官为肝脏， 急性中毒症状为恶心、呕吐、胃肠大出血而死亡。慢性中毒主要会引起肝癌， 还可以诱发骨癌、肾癌、直肠癌等。目前，我国规定各种食物或饲料中黄曲霉 毒素B1的最高允许量根据来源不同为0.5～20.0μg/Kg。国际上AFT最大允许含量不断降低，2004年欧盟再次修订对婴儿和儿童食品中AFT的限量标准，包 括谷类食品在内的婴幼儿食品以及具有特殊医疗目的的婴儿食品，AFB1的最大 允许限量均为0.10ug/kg。现在黄曲霉毒素B1检测方法要求也在不断提高。
目前常用的方法有放射免疫分析法、荧光免疫分析法、酶联免疫分析法等。 其中，放射性免疫分析虽高灵敏、高特异性，但存在有效期短、具有放射性污 染的问题；荧光免疫分析法虽然特异性强、敏感性高、速度快，但非特异性染 色问题尚未解决，结果判定的客观性不足，程序也比较复杂。而酶联免疫法集 合了抗原抗体反应的高特异性与酶促反应的高度敏感性。这种方法灵敏度高， 比薄层法提高了近200倍；特异性强，荧光物质、色素、结构类似物对结果无 干扰；而且回收率高，提取方法简单，可进行定性定量测定。但目前黄曲霉毒 素B1的酶联免疫分析方法精密度较低。
发明内容
针对现有技术存在的不足，本发明的目的在于提供一种检测黄曲霉素B1的 酶联免疫检测方法，该方法在15min内显色，检测黄曲霉毒素B1变异系数在 5.3-8.5％之间，精密度较高，且测得黄曲霉毒素B2/G1/G2交叉反应率结果均小 于1％；并提供采用该酶联免疫检测方法进行检测的试剂盒。
为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
一种检测黄曲霉素B1的酶联免疫检测方法，包括以下步骤：
(1)以黄曲霉毒素B1单克隆抗体为免疫原对无病原体免疫动物进行免疫， 得到黄曲霉毒素B1抗抗体；
(2)将步骤(1)得到的黄曲霉毒素B1抗抗体与辣根过氧化物酶进行偶联 得到酶标记的黄曲霉毒素B1抗抗体；
(3)用包被缓冲液将包被黄曲霉毒素B1抗原稀释，注孔，避光孵育，倾 去孔中液体，用洗涤液洗涤，静置，拍干，然后在孔中加入封闭液，再避光孵 育，倾去孔内液体拍干，干燥后得到酶标板，用铝膜真空密封保存；
(4)建立黄曲霉毒素B1标准品浓度相对吸光度的标准曲线，并根据该标 准曲线由待测样品的吸光度推算出待测样品中的黄曲霉毒素B1含量。
在本发明中，优选的，所述免疫动物为山羊。
在本发明中，优选的，所述黄曲霉毒素B1单克隆抗体的制备方法，包括以 下步骤：将包被黄曲霉毒素B1抗原注入到Balb/c小鼠体内，取其脾细胞与SP2/0 骨髓瘤细胞融合，采用间接竞争ELISA测定细胞上清液，筛选阳性孔；利用有 限稀释法对阳性孔进行克隆化，直到得到分泌黄曲霉毒素B1单克隆抗体的杂交 瘤细胞株；注射细胞进小鼠体内诱生腹水；将采集的腹水用辛酸-饱和硫酸铵法 进行腹水纯化，-20℃保存。
在本发明中，优选的，所述包被黄曲霉毒素B1抗原的制备方法，包括以下 步骤：
1)将黄曲霉素B1和羧甲基羟半盐酸盐溶于吡啶甲醇混合溶液中，搅拌， 旋干，加入双蒸水溶解，随即用碳酸氢钠调节pH至8.0，苯酚萃取，再用硫酸 调节液相pH至4.0，在氮气保护下浓缩，得到黄色油状液体即为AFB1肟化物 黄曲霉毒素B1抗原；
2)将得到的AFB1肟化物黄曲霉毒素B1抗原溶于DMF中，加入碳二亚胺 盐酸盐，搅拌，取BSA溶解于LPBS缓冲液中，将此溶液加入反应液中，相同 条件继续反应，离心后用PBS透析，得到免疫黄曲霉毒素B1抗原；
3)将免疫黄曲霉毒素B1抗原、N羟基琥珀亚胺和二环己基碳二亚胺溶解 于无水四氢呋喃中震荡反应，离心，取上清吹干，加入DMF；取OVA溶解于 PBS缓冲液中，加入到反应物中反应，离心后用PBS透析，得到包被黄曲霉毒 素B1抗原。
在本发明中，优选的，所述包被缓冲液为pH9.6的碳酸盐溶液。
在本发明中，优选的，在步骤(3)中，用pH9.6碳酸盐将包被黄曲霉毒素 B1抗原稀释成5μg/mL。
在本发明中，优选的，在步骤(3)中，每孔加入150μl稀释后的包被黄曲 霉毒素B1抗原稀释液，4℃避光孵育16h，倾去孔中液体，用洗涤液洗涤1次， 静置30s，拍干，然后在每孔中加入200μl封闭液，37℃避光孵育2h，倾去孔 内液体拍干，干燥后用铝膜真空密封保存.
在本发明中，优选的，建立黄曲霉毒素B1标准品标准曲线时选用的底物显 色液由A液和B液组成，A液为过氧化脲，B液为四甲基联苯胺。
在本发明中，优选的，终止液为2mol/L硫酸；洗涤液为含有0.01％吐温-20、 3g/L叠氮化钠防腐剂、0.01mol/L的磷酸盐缓冲液，pH为7.2；复溶液为0.02mol/L 的磷酸盐缓冲液，pH值为7.0。
一种检测黄曲霉毒素B1的酶联免疫检测试剂盒，采用上述检测黄曲霉毒素 B1的酶联免疫检测方法。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明酶联免疫检测方法在15min内显色，检测黄曲霉毒素B1变异系数在 5.3-8.5％之间，精密度较高，且测得黄曲霉毒素B2/G1/G2交叉反应率结果均小 于1％；同时，本试剂盒制备方法简单，可以在2～8℃至少保存12个月以上， 37℃加速老化保存21天或-20℃冰箱冷冻7天，其各项指标完全正常。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所 描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发 明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的 所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
1、黄曲霉毒素B1抗原制备
(1)人工抗原制备：
2mg黄曲霉素B1(以下简称为AFB1)和4mg羧甲基羟半盐酸盐溶于2ml 吡啶甲醇混合溶液(0.5ml吡啶:1.5ml甲醇)中，于25℃搅拌24h，用旋转蒸发 仪蒸干，加入2ml双蒸水溶解，随即用0.2mol/L碳酸氢钠调节pH至8.0，用苯 酚萃取3次，每次2ml萃取未肟化的AFB1，再用0.2mol/L的硫酸调节液相pH 至4.0，用乙酸乙酯分3次，每次1ml，在氮气保护下浓缩，得到黄色油状液体 即为AFB1肟化物黄曲霉毒素B1抗原(以下简称为AFB1-O)；
2)免疫抗原的制备：
将0.5mgAFB1-O溶于0.2mlDMF中，加入1mg碳二亚胺盐酸盐，于25℃ 搅拌4h，取10mgBSA溶解于2ml0.01mol/LPBS缓冲液中，将此溶液加入反应 液中，相同条件继续反应24h，将反应物离心后用0.01mol/LPBS透析3d每12h 换液一次，得到免疫黄曲霉毒素B1抗原(以下简称为免疫AFB1-O)；
3)包被抗原的制备：
将1mg免疫AFB1-O、0.4mgN羟基琥珀亚胺和0.6mg二环己基碳二亚胺溶 解于无水四氢呋喃中30℃震荡反应1h，将反应物4000r/min离心15min，取上 清吹干，加入0.2mlDMF；取10mgOVA溶解于2ml0.01mol/LPBS缓冲液中，加 入到反应物中于25℃反应24h，将反应物离心后用0.01mol/LPBS透析3d每12h 换液一次，得到包被黄曲霉毒素B1抗原，-20℃保存备用。
2、黄曲霉毒素B1单克隆抗体制备
1)动物免疫：将上述步骤得到的免疫包被黄曲霉毒素B1抗原注入到Balb/c (8周)小鼠体内，免疫剂量为100μg/只，使其产生抗血清；
2)细胞融合和克隆化：小鼠血清测定结果较高后，取其脾细胞，按10:1(数 量配比)比例与SP2/0骨髓瘤细胞融合，采用间接竞争ELISA测定细胞上清液， 筛选阳性孔；利用有限稀释法对阳性孔进行克隆化，直到得到分泌黄曲霉毒素 B1单克隆抗体的杂交瘤细胞株；
3)细胞冻存和复苏：将单克隆杂交瘤细胞株用冻存液制成1×86个/mL的 细胞悬液，在液氮中长期保存。复苏时取出冻存管，立即放入37℃水浴中速融， 离心去除冻存液后，移入培养瓶内培养；
4)单克隆抗体的生产与纯化：采用动物体内诱生单克隆抗体方法，7天后 采集腹水；用辛酸-饱和硫酸铵法进行腹水纯化，-20℃保存。
3、酶标二抗的制备
以山羊作为免疫动物，以黄曲霉毒素B1单克隆抗体为免疫原对无病原体山 羊进行免疫，得到黄曲霉毒素B1抗抗体；将黄曲霉毒素B1抗抗体与辣根过氧 化物酶(HRP)进行偶联得到酶标二抗。
4、酶标板的制备
用包被缓冲液(pH9.6碳酸盐)将包被黄曲霉毒素B1抗原稀释成5μg/mL， 每孔加入150μl，4℃避光孵育16h，倾去孔中液体，用洗涤液洗涤1次，静置 30s，拍干，然后在每孔中加入200μl封闭液，37℃避光孵育2h，倾去孔内液体 拍干，干燥后用铝膜真空密封保存。
5、检测黄曲霉毒素B1的酶联免疫试剂盒的组建
组建检测黄曲霉毒素B1的酶联免疫试剂盒，使其包含下述组分：
黄曲霉毒素B1标准品浓缩液溶液6瓶(浓缩液溶剂甲醇)，浓度分别为0 μg/L，1μg/L，3μg/L，9μg/L，27μg/L，81μg/L，使用时用0.02mol磷酸盐 缓冲液(pH7.2)9:1稀释成标准品溶液，稀释后浓度分别为0μg/L，0.1μg/L，0.3μg/L，0.9μg/L，2.7μg/L，8.1μg/L；
1)底物显色液由A液和B液组成，A液为过氧化脲，B液为四甲基联苯胺；
2)终止液为2mol/L硫酸；
3)洗涤液为含有0.01％吐温-20、3g/L叠氮化钠防腐剂、0.01mol/L的磷酸 盐缓冲液(pH值为7.2)，所述百分比为重量体积百分比；
4)复溶液为0.02mol/L的磷酸盐缓冲液(pH值为7.2)，所述百分比为重 量体积百分比。
6、粮食中黄曲霉毒素B1的检测
1)用试剂盒检测
加标准溶液/样本50μl到对应的微孔中，再加入抗体50μl/孔，最后加入酶 标二抗50μl/孔轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置25℃避光环境中反应30min； 小心揭开盖板膜，将孔内液体甩干，用洗涤工作液250μl/孔，充分洗涤4-5次， 每次间隔10s，用吸水纸拍干(拍干后未被清除的气泡可用未使用过的枪头轻轻 戳破)；加入底物液A液50μl/孔，再加底物液B液50μl/孔，轻轻振荡混匀， 用盖板膜盖板后置25℃避光环境中显色15min。加入终止液50μl/孔，轻轻振荡 混匀，设定酶标仪检测波长450nm，参比波长620nm，测定每孔OD值。
2)检测结果分析
标准品或样本的百分吸光率等于标准品或样本的吸光度值除以第一个标准 品(0标准)的吸光度值，再乘以100％，得到标准品或样本的百分吸光度值。以 标准品百分吸光率为纵坐标，以黄曲霉毒素B1标准品浓度(μg/L)的对数为横坐 标，绘制标准曲线图。将样本的百分吸光率代入标准曲线中，从标准曲线上读 出样本所对应的浓度，乘以其对应的稀释倍数即为样本中黄曲霉毒素B1的实际 浓度。
7、特异性检测
分别配置黄曲霉毒素B2/G1/G2不同浓度标准曲线0μg/L，0.1μg/L，0.3 μg/L，0.9μg/L，2.7μg/L，8.1μg/L，使用黄曲霉毒素B1试剂盒检测，通过 吸光光度值得出黄曲霉毒素B2/G1/G2的IC50值。
Figure BDA0002495814320000081
Figure BDA0002495814320000082
Figure BDA0002495814320000083
测得黄曲霉毒素B2/G1/G2交叉反应率结果均小于1％。
8、精密度检测
1)标准溶液的精密度检测
从3个不同试剂盒批次中各抽取10个试剂盒，每个酶标板随即抽取10个 微孔测定标准溶液(含3.5μg/L黄曲霉毒素B1)的吸光光度值，计算变异系数。 实验重复三次结果，检测结果如表1所示，其中黄曲霉毒素B1变异系数在 5.3-8.5％之间。
表1
Figure BDA0002495814320000084
2)样本的精密度检测
将不含黄曲霉毒素B1的玉米粉添加10μg/L黄曲霉毒素B1，从3个不同 试剂盒批次中各抽取10个试剂盒，计算变异系数，检测结果如表2所示：
表2
Figure BDA0002495814320000091
9、试剂盒稳定性试验
试剂盒保存条件为2～8℃，经过12个月的测定，试剂盒的最大吸光度值(零 标准)、50％抑制浓度、黄曲霉毒素B1添加实际测定值均在正常范围之内。考 虑在运输和使用过程中，会有非正常保存条件出现，将试剂盒在37℃保存条件 下放置7天，进行加速老化实验，结果表明该试剂盒各项指标完全符合要求。 考虑到试剂盒冷冻情况发生，将试剂盒放入-20℃冰箱冷冻7天，测定结果也表 明试剂盒各项指标完全正常。
从以上结果可得出试剂盒可以在2～8℃至少保存12个月以上。
上述说明是针对本发明较佳可行实施例的详细说明，但实施例并非用以限 定本发明的专利申请范围，凡本发明所提示的技术精神下所完成的同等变化或 修饰变更，均应属于本发明所涵盖专利范围。

Claims (10)

1.一种检测黄曲霉素B1的酶联免疫检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)以黄曲霉毒素B1单克隆抗体为免疫原对无病原体免疫动物进行免疫，得到黄曲霉毒素B1抗抗体；
(2)将步骤(1)得到的黄曲霉毒素B1抗抗体与辣根过氧化物酶进行偶联得到酶标记的黄曲霉毒素B1抗抗体；
(3)用包被缓冲液将包被黄曲霉毒素B1抗原稀释，注孔，避光孵育，倾去孔中液体，用洗涤液洗涤，静置，拍干，然后在孔中加入封闭液，再避光孵育，倾去孔内液体拍干，干燥后得到酶标板，用铝膜真空密封保存；
(4)建立黄曲霉毒素B1标准品浓度相对吸光度的标准曲线，并根据该标准曲线由待测样品的吸光度推算出待测样品中的黄曲霉毒素B1含量。
2.根据权利要求1所述的一种检测黄曲霉素B1的酶联免疫检测方法，其特征在于，所述免疫动物为山羊。
3.根据权利要求1所述的一种检测黄曲霉素B1的酶联免疫检测方法，其特征在于，所述黄曲霉毒素B1单克隆抗体的制备方法，包括以下步骤：将包被黄曲霉毒素B1抗原注入到Balb/c小鼠体内，取其脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合，采用间接竞争ELISA测定细胞上清液，筛选阳性孔；利用有限稀释法对阳性孔进行克隆化，直到得到分泌黄曲霉毒素B1单克隆抗体的杂交瘤细胞株；注射细胞进小鼠体内诱生腹水；将采集的腹水用辛酸-饱和硫酸铵法进行腹水纯化，-20℃保存。
4.根据权利要求2所述的一种检测黄曲霉素B1的酶联免疫检测方法，其特征在于，所述包被黄曲霉毒素B1抗原的制备方法，包括以下步骤：
1)将黄曲霉素B1和羧甲基羟半盐酸盐溶于吡啶甲醇混合溶液中，搅拌，旋干，加入双蒸水溶解，随即用碳酸氢钠调节pH至8.0，苯酚萃取，再用硫酸调节液相pH至4.0，在氮气保护下浓缩，得到黄色油状液体即为AFB1肟化物黄曲霉毒素B1抗原；
2)将得到的AFB1肟化物黄曲霉毒素B1抗原溶于DMF中，加入碳二亚胺盐酸盐，搅拌，取BSA溶解于LPBS缓冲液中，将此溶液加入反应液中，相同条件继续反应，离心后用PBS透析，得到免疫黄曲霉毒素B1抗原；
3)将免疫黄曲霉毒素B1抗原、N羟基琥珀亚胺和二环己基碳二亚胺溶解于无水四氢呋喃中震荡反应，离心，取上清吹干，加入DMF；取OVA溶解于PBS缓冲液中，加入到反应物中反应，离心后用PBS透析，得到包被黄曲霉毒素B1抗原。
5.根据权利要求1所述的一种检测黄曲霉素B1的酶联免疫检测方法，其特征在于，所述包被缓冲液为pH9.6的碳酸盐溶液。
6.根据权利要求5所述的一种检测黄曲霉素B1的酶联免疫检测方法，其特征在于，在步骤(3)中，用pH9.6碳酸盐将包被黄曲霉毒素B1抗原稀释成5μg/mL。
7.根据权利要求6所述的一种检测黄曲霉素B1的酶联免疫检测方法，其特征在于，在步骤(3)中，每孔加入150μl稀释后的包被黄曲霉毒素B1抗原稀释液，4℃避光孵育16h，倾去孔中液体，用洗涤液洗涤1次，静置30s，拍干，然后在每孔中加入200μl封闭液，37℃避光孵育2h，倾去孔内液体拍干，干燥后用铝膜真空密封保存。
8.根据权利要求1所述的一种检测黄曲霉素B1的酶联免疫检测方法，其特征在于，建立黄曲霉毒素B1标准品标准曲线时选用的底物显色液由A液和B液组成，A液为过氧化脲，B液为四甲基联苯胺。
9.根据权利要求8所述的一种检测黄曲霉素B1的酶联免疫检测方法，其特征在于，终止液为2mol/L硫酸；洗涤液为含有0.01％吐温-20、3g/L叠氮化钠防腐剂、0.01mol/L的磷酸盐缓冲液，pH为7.2；复溶液为0.02mol/L的磷酸盐缓冲液，pH值为7.0。
10.一种检测黄曲霉毒素B1的酶联免疫检测试剂盒，其特征在于，采用权利要求1-9中任一项所述的检测黄曲霉毒素B1的酶联免疫检测方法。
CN202010418170.7A 2020-05-18 2020-05-18 一种检测黄曲霉素b1的酶联免疫检测方法及其试剂盒 Pending CN111521824A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010418170.7A CN111521824A (zh) 2020-05-18 2020-05-18 一种检测黄曲霉素b1的酶联免疫检测方法及其试剂盒

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010418170.7A CN111521824A (zh) 2020-05-18 2020-05-18 一种检测黄曲霉素b1的酶联免疫检测方法及其试剂盒

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN111521824A true CN111521824A (zh) 2020-08-11

Family

ID=71907386

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202010418170.7A Pending CN111521824A (zh) 2020-05-18 2020-05-18 一种检测黄曲霉素b1的酶联免疫检测方法及其试剂盒

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN111521824A (zh)

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103018458A (zh) * 2012-12-06 2013-04-03 北京普赞生物技术有限公司 超灵敏黄曲霉毒素b1酶联免疫检测试剂盒
CN105017411A (zh) * 2015-07-06 2015-11-04 浙江大学 黄曲霉毒素b1-载体蛋白人工偶联抗原的合成方法
CN106290889A (zh) * 2016-08-16 2017-01-04 广东产品质量监督检验研究院 黄曲霉毒素b1的检测方法

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103018458A (zh) * 2012-12-06 2013-04-03 北京普赞生物技术有限公司 超灵敏黄曲霉毒素b1酶联免疫检测试剂盒
CN105017411A (zh) * 2015-07-06 2015-11-04 浙江大学 黄曲霉毒素b1-载体蛋白人工偶联抗原的合成方法
CN106290889A (zh) * 2016-08-16 2017-01-04 广东产品质量监督检验研究院 黄曲霉毒素b1的检测方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
蔡敏等: "黄曲霉毒素B1 人工抗原的制备及鉴定", 《湖南农业科学》 *

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US8507214B2 (en) Elisa kit for detecting lincomycin
CN105388281B (zh) 检测异菌脲的酶联免疫试剂盒及其应用
CN107915774B (zh) 用于检测玉米赤霉烯酮及其代谢产物的单抗及酶联免疫方法与试剂盒
CN110133306B (zh) 检测西马特罗的酶联免疫试剂盒及其应用
CN105675858B (zh) 检测二氯喹啉酸的酶联免疫试剂盒及其应用
CN105403703B (zh) 检测多菌灵的酶联免疫试剂盒及其应用
CN111521824A (zh) 一种检测黄曲霉素b1的酶联免疫检测方法及其试剂盒
CN109061171B (zh) 一种检测氟节胺的酶联免疫试剂盒及其应用
CN104897651B (zh) 一种黄曲霉毒素m1的化学发光试剂盒及其应用
CN111896737B (zh) 一种蛇形菌素人工抗原在酶联免疫试剂盒中的应用
CN112904008B (zh) 检测生物制品中蛋白a等杂质的酶联免疫试剂盒及其应用
CN113788814B (zh) 稻瘟灵含量检测用半抗原、制备方法及其应用
CN111289753B (zh) 一种检测香豆素与茚满二酮类杀鼠剂的酶联免疫试剂盒及其制备和应用
CN111812316B (zh) 一种甲氰菊酯人工抗原在酶联免疫试剂盒中的应用
CN112098641B (zh) 一种互隔交链孢霉素人工抗原在酶联免疫试剂盒中的应用
CN111537724A (zh) 一种胶体金溶液的制备方法及检测黄曲霉素b1的胶体金方法与试剂盒
CN113511992A (zh) 米酵菌酸半抗原及其制备方法和应用
CN111848792A (zh) 疫苗中牛血清白蛋白等杂质的抗体制备方法及检测方法
CN106610431A (zh) 一种检测苯霜灵的酶联免疫试剂盒及其检测方法
CN113049812B (zh) 一种检测克百威的elisa方法及其试剂盒
CN114957141B (zh) 三唑醇含量检测用半抗原及其应用
CN113125729A (zh) 一种检测橘青霉素的酶联免疫试剂盒及其检测方法
CN113698445B (zh) 一种伊维菌素半抗原、人工抗原及其制备方法与应用
CN113281501B (zh) 一种五氯硝基苯人工抗原在酶联免疫试剂盒中的应用
CN113125728A (zh) 一种检测杂色曲霉毒素的酶联免疫试剂盒制备

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20200811