CN113698445B - 一种伊维菌素半抗原、人工抗原及其制备方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物技术领域，具体地说，涉及一种伊维菌素半抗原、人工抗原以及制备方法与应用。所述的伊维菌素半抗原的结构如式1所示。本发明的伊维菌素半抗原合成方法简单，易于操作，制备的人工抗原可用于伊维菌素的定性或定量分析，还可用于免疫分析技术，具有高灵敏度、高特异性、简单快捷、易于操作和无需任何大型仪器与设备的优点。

Description

一种伊维菌素半抗原、人工抗原及其制备方法与应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体地说，涉及一种伊维菌素半抗原、人工抗原及其制备方法与应用。

背景技术

伊维菌素（Ivermectin）是一个大环内酯类抗生素，它能使氯离子穿过细胞膜汇集起来，从而造成多种线虫及节肢动物麻痹，在兽医领域中有多种用途，伊维菌素对节肢动物及线虫具有毒性。但高剂量的使用伊维菌素能使宿主对血液中的线虫或节肢动物产生快速清除炎症应答，产生治疗的不良反应。早在2002年12月我国农业部公告第235号文就已经规定在所有食品动物的肌肉中最高残留量为10μg/kg，在脂肪中的最高残留量为40μg/kg。因此，在兽药中检测伊维菌素的残留量非常重要。

残留检测方法是准确判断药物残留是否超标的重要手段，必须具有较高的精确度和准确度。目前用于伊维菌素检测的方法主要有仪器分析法和免疫学检测方法。仪器分析法主要有液相色谱-荧光（HPLC-FLD）、液相色谱法-紫外（HPLC-UV）和超液相色谱法-质谱法（LC/MS）等。这些仪器分析方法灵敏度高，能够多残留检测。但是检测时间长、成本高、样品前处理繁杂，需要使用大量有机试剂，且对操作人员要求较高，很难做到现场、低成本、快速、大批量的检测。

免疫学检测方法，尤其是ELISA方法具有灵敏、特异、简单、快速、稳定及易于自动化操作等特点，能够克服仪器分析的缺陷，许多经典的分析方法在灵敏度和特异性方面都不能与之相比，是一种有效的大批量残留筛选方法，但是现有的免疫学方法存在检测种类少、特异性不高、灵敏度差等缺点。

如CN1811440A公开了一种伊维菌素半抗原，它是在伊维菌素的分子结构上直接把突出的4-羟基酯化成羧基，该半抗原制备的抗体仅用于伊维菌素的检测，最低检测限为0.5μgL^-1。

CN103675287A公开了一种伊维菌素的检测试剂盒，它以伊维菌素代谢物为半抗原制备单克隆抗体，但没有公开是何种代谢物，且只能检测伊维菌素，最低检测限为0.01ngmL^-1。

可见，现有技术中针对伊维菌素的免疫检测，大多数半抗原的设计都在IVM的C₄-OH位置链接琥珀酸酐或戊二酸酐得到含有4或5个C的间接臂的半抗原，再与载体蛋白偶联作为免疫原，获得的抗体光谱差，且检测样品种类单一，使得该类方法的应用受到一定局限。

为此，CN109180760A公开了一种新型伊维菌素半抗原，它是在伊维菌素C₄-OH位置，与羧甲基羟胺半盐酸盐反应，将C₄上的羟基取代为羧甲基羟胺基，该衍生物与载体蛋白偶联后作为免疫原，可用于制备抗伊维菌素类药物的单克隆抗体。然而，该抗原依旧存在特异性不高、灵敏度差的缺陷。

有鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的目的在于提供一种伊维菌素半抗原、人工抗原及其制备方法与应用。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种伊维菌素半抗原，其结构如式1所示：

式1

本发明还提供所述的伊维菌素半抗原的制备方法，该方法包括如下步骤：

步骤一、化合物1的制备

将伊维菌素溶于DMF中，加入咪唑与叔丁基二甲基氯硅烷，反应得到5-位羟基保护的化合物1，反应式如下：

步骤二、化合物2的制备

将化合物1溶于醋酸异丙酯中，加入二甲亚砜和三乙胺搅拌，再加入二氯磷酸苯酯反应，得到化合物2，反应式如下：

步骤三、化合物3的制备

将化合物2溶于四氢呋喃中，加入4-氨基丁酸搅拌反应，再加入三乙酰氧基硼氢化钠和冰醋酸继续反应，得到化合物3，反应式如下：

步骤四、伊维菌素半抗原的制备

将化合物3脱保护得到伊维菌素半抗原，反应式如下：

进一步地，步骤一中，伊维菌素、咪唑与叔丁基二甲基氯硅烷的投料摩尔比为1：6：3，所述的反应为在-5～5℃下反应15～25h。

进一步地，步骤二中，加入二甲亚砜和三乙胺时控制温度在-25～0℃范围内，所述反应的反应时间为1.5～3h；化合物1、二甲亚砜、三乙胺和二氯磷酸苯酯的投料摩尔比为1：4：5：1.5～2。

进一步地，步骤三中，搅拌的时间为3.5～4.5h，化合物2、4-氨基丁酸与冰醋酸的投料摩尔比为1：1.0～1.2：1.0～1.2。

本发明还提供一种伊维菌素人工抗原，其中，所述的伊维菌素人工抗原为由所述的伊维菌素半抗原与载体蛋白偶联得到，其结构式如式2所示：

式2

其中，

为载体蛋白。

本发明中，所述的载体蛋白为本领域常用的载体蛋白，如牛血清白蛋白（BSA）、钥孔血蓝蛋白（KLH）、血蓝蛋白（LPH）、鸡卵血清白蛋白（OVA）或人血清白蛋白（HAS）中的一种。

本发明还提供所述的伊维菌素人工抗原的制备方法，其中，所述的制备方法为将伊维菌素半抗原与载体蛋白进行偶联。

具体为：可通过混合酸酐法或活性酯法将伊维菌素半抗原和载体蛋白进行偶联。

本发明还提供一种伊维菌素抗体，该抗体是由所述的伊维菌素半抗原或伊维菌素人工抗原免疫动物得到的。

本发明还提供一种用于检测伊维菌素的酶联免疫检测试剂盒，该试剂盒含有所述的伊维菌素人工抗原和/或所述的伊维菌素抗体。

本发明还提供所述的伊维菌素半抗原、伊维菌素人工抗原或所述的伊维菌素抗体在制备检测伊维菌素产品中的应用。

与现有技术相比，本发明具有如下优点：

本发明的伊维菌素半抗原合成方法简单，易于操作，制备的人工抗原可用于伊维菌素的定性或定量分析，还可用于免疫分析技术，具有高灵敏度、高特异性、简单快捷、易于操作和无需任何大型仪器与设备的优点。

具体实施方式

以下为本发明的具体实施方式，所述的实施例是为了进一步描述本发明，而不是限制本发明。

实施例1、伊维菌素半抗原的合成

步骤一、化合物1的制备

称取1.0g伊维菌素溶于6mlDMF中，搅拌，冰浴降温，依次加入0.47g咪唑和0.52g叔丁基二甲基氯硅烷，完毕，反应液继续在0℃反应20h。加入100ml乙醚，50ml水，分液，水相再用50ml乙醚萃取4次，合并乙醚相，用饱和食盐水100ml洗涤两次，无水硫酸钠干燥，减压浓缩，残余物上样硅胶柱层析（二氯甲烷：四氢呋喃=50：1），得到5-O-叔丁基二甲基硅基-IVM（化合物1）。反应式如下：

步骤二、化合物2的制备

称取5g化合物1溶于60ml醋酸异丙酯中，冷浴降温至-25～0℃，加入1.6g二甲亚砜和2.5g三乙胺，搅拌15min。称取1.8g二氯磷酸苯酯溶于5ml醋酸异丙酯中，将该溶液缓慢滴入反应液，完毕，反应2h。将反应液倾入40ml1%的磷酸溶液中，分液，水相用25ml醋酸异丙酯萃取2次，合并有机相，无水硫酸钠干燥，浓缩得5-O-叔丁基二甲基硅基-4-羰基IVM（化合物2）。反应式如下：

步骤三、化合物3的制备

称取90mg化合物2溶于10ml四氢呋喃中，加入9.4mg4-氨基丁酸和5.5mg冰乙酸，室温搅拌4h。加入1N碳酸氢钠溶液淬灭反应，随后加入50ml二氯甲烷与25ml水分液，水相用30ml二氯甲烷萃取三次，合并有机相，无水硫酸钠干燥，减压浓缩，残余物上样硅胶柱层析[乙酸乙酯：甲醇=1：2]得5-O-叔丁基二甲基硅基-4″-羧丙基氨基IVM（化合物3）。反应式如下:

步骤四、伊维菌素半抗原的制备

称取100mg化合物3溶于20ml乙腈中，室温下搅拌，加入70mg对甲苯磺酸，继续搅拌1h，加入100ml乙酸乙酯，用50ml2%碳酸氢钠洗涤，50ml水洗3次，饱和食盐水50ml洗涤1次。浓缩乙酸乙酯相，薄层色谱纯化[二氯甲烷：甲醇：乙酸=90:3:0.2]的伊维菌素半抗原。反应式如下。对所制得的伊维菌素半抗原进行结构确认：Ms:[M+H]⁺=960.6。

实施例2、伊维菌素半抗原的合成

步骤一、化合物1的制备

同实施例1，所不同的是伊维菌素、咪唑、叔丁基二甲基氯硅烷的投料摩尔比为1：6：3，反应液继续在-5℃下反应25h。

步骤二、化合物2的制备

同实施例1，所不同的是反应时间为1.5h；化合物1、二甲亚砜、三乙胺和二氯磷酸苯酯的投料摩尔比为1：4：5：1.5。

步骤三、化合物3的制备

同实施例1，所不同的是搅拌的时间为3.5h，化合物2、4-氨基丁酸与冰醋酸的投料摩尔比为1：1.0：1.0。

步骤四、伊维菌素半抗原的制备

同实施例1。

实施例3、伊维菌素半抗原的合成

步骤一、化合物1的制备

同实施例1，所不同的是伊维菌素、咪唑、叔丁基二甲基氯硅烷的投料摩尔比为1：6：3，反应液继续5℃下反应15h。

步骤二、化合物2的制备

同实施例1，所不同的是反应时间为3h；化合物1、二甲亚砜、三乙胺和二氯磷酸苯酯的投料摩尔比为1：4：5：2。

步骤三、化合物3的制备

同实施例1，所不同的是搅拌的时间为4.5h，化合物2、4-氨基丁酸与冰醋酸的投料摩尔比为1：1.0～1.2：1.2。

步骤四、伊维菌素半抗原的制备

同实施例1。

实施例4、伊维菌素BSA人工抗原的合成

1）称取10mg实施例1制得的伊维菌素半抗原溶于400ulDMF中，依次加入4.3mgDCC和2.4mgNHS，室温反应16h，离心取上清得伊维菌素半抗原的活性酯溶液；

2）取50mgBSA溶于5ml硼酸盐缓冲溶液（pH=8.7）中，得到蛋白溶液；

3）将步骤1）所得的活性酯溶液逐滴滴入步骤2）所得的蛋白溶液中，滴加结束后，室温避光反应1h，4℃继续反应12h，将反应液离心，取上清4℃冰箱透析3天，得伊维菌素BSA人工抗原。

实施例5、伊维菌素OVA人工抗原的合成

1）称取10mg实施例1制得的伊维菌素半抗原溶于300μlDMF中，冰浴冷却，然后加入2.5μl三正丁胺，再加入1.4μl氯甲酸异丁酯，继续冰浴反应1h，得伊维菌素半抗原活性溶液；

2）称取30mgOVA，溶于3ml硼酸盐缓冲溶液（pH=8.7）中，得到蛋白溶液；

3）将步骤1）所得的伊维菌素半抗原活性溶液缓慢滴入步骤2）所得的蛋白溶液中，完毕，4℃避光反应16h，反应液于4℃冰箱透析三天，得伊维菌素OVA人工抗原。

实施例6、伊维菌素KLH人工抗原的合成

制备方法参照实施例4，所不同的是将BSA替换为KLH。

实施例7、伊维菌素LPH人工抗原的合成

制备方法参照实施例4，所不同的是将BSA替换为LPH。

实施例8、伊维菌素HAS人工抗原的合成

制备方法参照实施例5，所不同的是将OVA替换为HAS。

实施例9、伊维菌素BSA单克隆抗体的制备

1）动物免疫

将实施例4制得的伊维菌素BSA人工抗原注入到Balb/c（6周）小鼠体内，免疫剂量为100μg/只，使其产生抗血清。

2）细胞融合和克隆化

小鼠血清测定结果较高后，取其脾细胞，按8:1(数量配比)比例与SP2/0骨髓瘤细胞融合，采用间接竞争ELISA测定细胞上清液，筛选阳性孔。利用有限稀释法对阳性孔进行克隆化，直到得到分泌伊维菌素单克隆抗体的杂交瘤细胞株。

3）细胞冻存和复苏

将单克隆杂交瘤细胞株用冻存液制成1×10⁶个/mL的细胞悬液，在液氮中长期保存。复苏时取出冻存管，立即放入37℃水浴中速融，离心去除冻存液后，移入培养瓶内培养。

4）单克隆抗体的生产与纯化

采用动物体内诱生单克隆抗体方法，7天后采集腹水。用protein G纯化柱进行腹水纯化，-20℃保存。

可将伊维菌素BSA人工抗原替换为伊维菌素OVA人工抗原、伊维菌素KLH人工抗原、伊维菌素LPH人工抗原或伊维菌素HAS人工抗原，制备其他伊维菌素单克隆抗体。

实施例10、检测伊维菌素的酶联免疫试剂盒的组建

1）酶标二抗的制备

以山羊作为免疫动物，以实施例9制得的伊维菌素BSA单克隆抗体为免疫原对无病原体山羊进行免疫，得到伊维菌素抗体。将伊维菌素抗体与辣根过氧化物酶(HRP)进行偶联得到酶标二抗。

2）酶标板的制备

用包被缓冲液（pH9.6碳酸盐）将包被原稀释成2μg/mL，每孔加入100μl，4℃避光孵育16h，倾去孔中液体，用洗涤液洗涤1次，静置30s，拍干，然后在每孔中加入200μl封闭液，37℃避光孵育2h，倾去孔内液体拍干，干燥后用铝膜真空密封保存。

3）检测伊维菌素的酶联免疫试剂盒的组建

组建检测伊维菌素的酶联免疫试剂盒，使其包含下述组分：

①包被伊维菌素偶联抗原的酶标板；

②伊维菌素标准品浓缩液溶液6瓶（浓缩液溶剂甲醇），浓度分别为0μg/L，5μg/L，15μg/L，45μg/L，135μg/L，405μg/L，使用时用0.02mol/L磷酸盐缓冲液（pH7.2）9:1稀释成标准品溶液，稀释后浓度分别为0μg/L，0.5μg/L，1.5μg/L，4.5μg/L，13.5μg/L，40.5μg/L；

③用辣根过氧化物酶标记的伊维菌素抗体；

④底物显色液由A液和B液组成，A液为过氧化脲，B液为四甲基联苯胺；

⑤终止液为2mol/L硫酸；

⑥洗涤液为pH值为7.2，含有0.01％吐温-20、3g/L叠氮化钠防腐剂、0.01mol/L的磷酸盐缓冲液，所述百分比为重量体积百分比；

⑦复溶液为pH值为7.0、0.02mol/L的磷酸盐缓冲液，所述百分比为重量体积百分比。

可将伊维菌素BSA单克隆抗体替换为其他伊维菌素单克隆抗体，如伊维菌素OVA单克隆抗体、伊维菌素KLH单克隆抗体、伊维菌素LPH单克隆抗体或伊维菌素HAS单克隆抗体中的一种制备其他不同试剂盒。

对比例、按照现有技术的方法制备伊维菌素半抗原

按照CN109180760A实施例1中“1.1半抗原4″-CMO-IVM的制备”的方法制备半抗原4″-CMO-IVM。

试验例1、伊维菌素试剂盒特异性的检测

交叉反应率是指抗体与结构不同的抗原决定簇发生结合的能力。该试验例考察了不同伊维菌素试剂盒的特异性。

试验用试剂盒：按照实施例10的方法组建的以伊维菌素BSA单克隆抗体为免疫原的酶联免疫试剂盒；

对照用试剂盒：先将对比例制得的伊维菌素半抗原按照实施例4的方法制备伊维菌素BSA人工抗原，然后按照实施例9的方法制备伊维菌素BSA单克隆抗体，再按照实施例10的方法组建的以伊维菌素BSA单克隆抗体为免疫原的酶联免疫试剂盒。

特异性检测方法：分别配置多拉菌素、泰乐菌素和红霉素不同浓度标准曲线0μg/L、0.5μg/L、1.5μg/L、4.5μg/L、13.5μg/L和40.5μg/L，使用伊维菌素试剂盒检测，通过吸光光度值得出多拉菌素、泰乐菌素和红霉素的IC₅₀值，通过如下公式计算交叉反应率，结果如表1所示。

从上述试验结果可以看出，与对比例相比，采用本发明制备的伊维菌素半抗原制得的伊维菌素试剂盒测得的多拉菌素、泰乐菌素和红霉素的交叉反应率明显较低，表明本发明的伊维菌素试剂盒检测伊维菌素的特异性较高。

试验例2、伊维菌素试剂盒精密度的检测

（1）检测用试剂盒

（1.1）试验用试剂盒

批次1：按照实施例10的方法组建的以伊维菌素BSA单克隆抗体为免疫原的酶联免疫试剂盒；

批次2：按照实施例10的方法组建的以伊维菌素OVA单克隆抗体为免疫原的酶联免疫试剂盒；

批次3：按照实施例10的方法组建的以伊维菌素KLH单克隆抗体为免疫原的酶联免疫试剂盒。

（1.2）对照用试剂盒

批次1：先将对比例制得的伊维菌素半抗原按照实施例2的方法制备伊维菌素BSA人工抗原，然后按照实施例9的方法制备伊维菌素BSA单克隆抗体，再按照实施例10的方法组建酶联免疫试剂盒；

批次2：先将对比例制得的伊维菌素半抗原按照实施例3的方法制备伊维菌素OVA人工抗原，然后按照实施例9的方法制备伊维菌素OVA单克隆抗体，再按照实施例10的方法组建酶联免疫试剂盒；

批次3：先将对比例制得的伊维菌素半抗原按照实施例4的方法制备伊维菌素KLH人工抗原，然后按照实施例9的方法制备伊维菌素KLH单克隆抗体，再按照实施例10的方法组建酶联免疫试剂盒。

（2）用试剂盒检测

加标准溶液/样本50μl到对应的微孔中，再加入抗体50μl/孔，最后加入酶标二抗50μl/孔轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置25℃避光环境中反应45min。小心揭开盖板膜，将孔内液体甩干，用洗涤工作液250μl/孔，充分洗涤4-5次，每次间隔10s，用吸水纸拍干(拍干后未被清除的气泡可用未使用过的枪头轻轻戳破)。加入底物液A液50μl/孔，再加底物液B液50μl/孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置25℃避光环境中显色15min。加入终止液50μl/孔，轻轻振荡混匀，设定酶标仪检测波长450nm，参比波长620nm，测定每孔OD值。

（3）检测结果分析

标准品或样本的百分吸光率等于标准品或样本的吸光度值除以第一个标准品(0标准)的吸光度值，再乘以100％，得到标准品或样本的百分吸光度值。以标准品百分吸光率为纵坐标，以伊维菌素标准品浓度(μg/L)的对数为横坐标，绘制标准曲线图。将样本的百分吸光率代入标准曲线中，从标准曲线上读出样本所对应的浓度，乘以其对应的稀释倍数即为样本中伊维菌素的实际浓度。

（3）精密度检测

从试验用和对照用3个不同试剂盒批次中各抽取10个试剂盒，每个酶标板随即抽取10个微孔测定标准溶液（含5μg/L伊维菌素）的吸光光度值，计算变异系数。实验重复三次结果，结果如下表2所示，伊维菌素变异系数在5.1～8.4%之间。

从上述试验结果可以看出，采用本发明的伊维菌素半抗原制得的伊维菌素试剂盒能够有效提高伊维菌素含量检测的准确度。

试验例3、伊维菌素试剂盒灵敏度检测

（1）检测用试剂盒

试验用试剂盒：按照实施例10的方法组建的以伊维菌素BSA单克隆抗体为免疫原的酶联免疫试剂盒；

对照用试剂盒：先将对比例制得的伊维菌素半抗原按照实施例4的方法制备伊维菌素BSA人工抗原，然后按照实施例9的方法制备伊维菌素BSA单克隆抗体，再按照实施例10的方法组建的以伊维菌素BSA单克隆抗体为免疫原的酶联免疫试剂盒。

（2）最低检出限检测

对试验用和对照用伊维菌素试剂盒进行最低检出限检测，结果如下表3所示。

从上述试验结果可以看出，与对照用试剂盒相比，本发明制备的试验用试剂盒的最低检出限较低，为0.1μg/L，表明本发明的伊维菌素试剂盒的灵敏度较高。

Claims (9)

1.一种伊维菌素半抗原，其结构如式1所示：

式1。

2.一种权利要求1所述的伊维菌素半抗原的制备方法，其特征在于，所述的制备方法包括如下步骤：

步骤一、化合物1的制备

将伊维菌素溶于DMF中，加入咪唑与叔丁基二甲基氯硅烷，反应得到5-位羟基保护的化合物1，反应式如下：

步骤二、化合物2的制备

将化合物1溶于醋酸异丙酯中，加入二甲亚砜和三乙胺搅拌，再加入二氯磷酸苯酯反应，得到化合物2，反应式如下：

步骤三、化合物3的制备

将化合物2溶于四氢呋喃中，加入4-氨基丁酸和冰醋酸室温下搅拌，得到化合物3，反应式如下：

步骤四、伊维菌素半抗原的制备

将化合物3脱保护得到伊维菌素半抗原，反应式如下：

。

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤一中，伊维菌素、咪唑与叔丁基二甲基氯硅烷的投料摩尔比为1：6：3，所述的反应为在-5～5℃下反应15～25h。

4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤二中，加入二甲亚砜和三乙胺时控制温度在-25～0℃范围内，所述反应的反应时间为1.5～3h；化合物1、二甲亚砜、三乙胺和二氯磷酸苯酯的投料摩尔比为1：4：5：1.5～2。

5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤三中，搅拌的时间为3.5～4.5h，化合物2、4-氨基丁酸与冰醋酸的投料摩尔比为1：1.0～1.2：1.0～1.2。

6.一种伊维菌素人工抗原，其特征在于，所述的伊维菌素人工抗原为由权利要求1所述的伊维菌素半抗原与载体蛋白偶联得到，其结构式如式2所示：

式2

其中，

为载体蛋白。

7.一种权利要求6所述的伊维菌素人工抗原的制备方法，其特征在于，所述的制备方法为将伊维菌素半抗原与载体蛋白进行偶联。

8.一种用于检测伊维菌素的酶联免疫检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒含有权利要求6所述的伊维菌素人工抗原。

9.一种如权利要求1所述的伊维菌素半抗原或权利要求6所述的伊维菌素人工抗原在制备检测伊维菌素产品中的应用。