CN113511992B - 米酵菌酸半抗原及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种半抗原及其制备方法和应用，具体涉及一种米酵菌酸半抗原。本发明还公开了所述半抗原的制备方法及其应用。基于米酵菌酸半抗原建立的酶联免疫试剂盒快速检测产品，使用方便、检测成本低、检测方法高效、准确、快速、可同时检测大批量的样本，适用于食品中米酵菌酸的现场监控和大量样本的筛查。

Description

米酵菌酸半抗原及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及一种半抗原及其制备方法和应用，具体涉及米酵菌酸半抗原及其制备方法和应用。

背景技术

米酵菌酸(bongkrekic acid，BA)是由椰毒假单胞菌属酵米面亚种产生的一种可引起食物中毒的毒素。食入该毒素污染的食物后可引起神经系统、消化系统及泌尿系统的损伤，严重情况下将导致全身主要脏器的衰竭，致死率高达40％～100％。米酵菌酸是发酵玉米面制品、变质鲜银耳及其他变质淀粉类制品引起中毒的主要原因。近几年来，我国由米酵菌酸引起的食物中毒事件时有发生，随着经济社会的发展，人们对食品安全越来越重视，公众对米酵菌酸的检测需求随之日益增长，因此，开发一种简单快速、适用于米酵菌酸现场监控检测的分析方法具有重要的现实意义。

目前，检测米酵菌酸主要采用高效液相色谱法、液相色谱-质谱联用法等分析方法，存在样品前处理繁琐、检测时间长、仪器贵重等缺点，所以在我国无法得到广泛应用，并且不符合现场检测“在短时间内低成本对大量样品进行准确检测和筛选”的要求。而免疫学检测分析技术以其高灵敏、高特异性、快速、操作简便等优点在药物残留检测领域已被广泛应用，比起仪器检测方法有很多优势。所以免疫分析为米酵菌酸研究提供了一条新的分析检测方法。

在建立免疫学检测方法并应用该检测方法检测米酵菌酸时，关键技术在于能够获取到特异性强、灵敏度高的抗体，而要实现这一目标，前提条件就是得合成、制备出合适的米酵菌酸半抗原。专利CN110058008A公开了一种食品中米酵菌酸的免疫学检测方法，并提供了米酵菌酸人工抗原及抗米酵菌酸的多克隆抗体，检测灵敏度为50μg/L；刘秀梅等制备了米酵菌酸牛血清白蛋白结合物、卵清蛋白结合物，并获得了抗米酵菌酸的多克隆抗体，建立了检测BA的直接和间接竞争ELISA法，最低检出浓度分别为0.1mg/L和0.01mg/L(刘秀梅,余东敏,文卫华,等.米酵菌酸多克隆抗体的制备[J].卫生研究,1995,24(2):93-95)，后又运用免疫杂交瘤技术获得了能分泌抗米酵菌酸的单克隆抗体细胞株，灵敏度可达10μg/L以下(刘秀梅,文卫华.米酵菌酸单克隆抗体细胞株的建立[J].卫生研究,1996,25(4):239-241)。以上方法都采用将米酵菌酸直接与载体蛋白偶联制备人工抗原来免疫动物获得抗体，虽然都成功获得了抗体，但抗体灵敏度均较低。

发明内容

针对现有技术中存在的不足之处，本发明提供一种能最大程度保留米酵菌酸特征结构的半抗原以及这种半抗原的制备方法；以此半抗原制备的人工抗原、检测灵敏度高和特异性强的抗体；以及此半抗原的应用。

为了实现本发明的目的，第一方面，本发明提供一种米酵菌酸半抗原，它的分子结构式为：

米酵菌酸分子中含有三个羧基，若与载体蛋白直接偶联，一方面米酵菌酸的特征结构易受载体的局部微化学环境或空间位阻的干扰，影响机体免疫系统的识别；另一方面，三个羧基都可能与载体偶联，必定会导致多种产物的产生，降低了人工抗原的收率。本发明提供的米酵菌酸半抗原在米酵菌酸的分子结构上引入巯基，并通过巯基与载体蛋白进行偶联得到人工抗原用于免疫；该米酵菌酸半抗原最大限度保留了米酵菌酸的特征结构，且可以实现定向偶联，提高了人工抗原的收率，为后续刺激动物免疫应答产生特异性更强、灵敏度更高的抗体奠定基础。

第二方面，本发明提供上述米酵菌酸半抗原的制备方法，其包括如下步骤：

取米酵菌酸加甲苯溶解后，加入三乙胺中和至中性；加入氧化铜，搅拌，冷却到0℃，然后加入4,5-二甲基-[1,3]二氧戊环-2-硫酮充分搅拌，再加入四氯化钛，0℃下继续搅拌1h；加1mol/L盐酸淬灭反应，加水，乙酸乙酯萃取三次，合并有机相，加无水硫酸钠干燥，有机相蒸干，得到巯基-米酵菌酸，即为米酵菌酸半抗原。

进一步地，所述米酵菌酸和4,5-二甲基-[1,3]二氧戊环-2-硫酮的物质的量之比为1:1.2。

本发明根据米酵菌酸的结构特点，合理设计米酵菌酸半抗原的制备方法，使用的原料易得，反应操作较为简单，反应条件易于控制，制备的米酵菌酸半抗原的纯度和收率较高。

第三方面，本发明提供上述米酵菌酸半抗原在免疫检测中的应用，具体包括由所述米酵菌酸半抗原与载体蛋白偶联得到的米酵菌酸人工抗原，及由所得米酵菌酸人工抗原免疫动物制备得到的米酵菌酸抗体。

所述米酵菌酸人工抗原的分子结构式为：

所述载体蛋白为牛血清白蛋白、鸡卵清白蛋白、人血清白蛋白或血蓝蛋白。

所述抗体为米酵菌酸单克隆抗体。

第四方面，本发明还提供由上述米酵菌酸抗体制备的酶联免疫试剂盒，及其在检测食品中米酵菌酸的应用。

本发明提供的米酵菌酸半抗原最大程度保留了米酵菌酸的特征结构，使得米酵菌酸半抗原的免疫原性明显增强；用该半抗原作为原料，制备适于动物免疫的人工抗原体系免疫动物，所得抗体的效价、特异性、亲和力都比较好，灵敏度可达到0.1μg/L；所得的抗体用于酶联免疫试剂盒，使用方便、检测成本低、检测方法高效、准确、快速、可同时检测大批量的样本，适于食品中米酵菌酸的现场监控和大量样本的筛查。本发明的米酵菌酸半抗原在米酵菌酸的检测中发挥重要作用。

附图说明

图1：米酵菌酸半抗原合成路线图

图2：米酵菌酸酶联免疫试剂盒标准曲线

具体实施方式

下面结合具体的实施例来进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明，而不用来限制本发明的范围。

实施例1

一种米酵菌酸半抗原的制备方法，其包括如下步骤：

取4mg米酵菌酸加5mL甲苯溶解后，加入0.34mL三乙胺中和至中性；加入2mg氧化铜，搅拌，冷却到0℃，然后加入1.3mg 4,5-二甲基-[1,3]二氧戊环-2-硫酮充分搅拌，再加入0.27mL四氯化钛，0℃下继续搅拌1h；加0.3mL 1mol/L盐酸淬灭反应，加水20mL，乙酸乙酯60mL×3萃取三次，合并有机相，加5g无水硫酸钠干燥，有机相蒸干，得到巯基-米酵菌酸3.2mg，即为米酵菌酸半抗原。

实施例2

一种米酵菌酸人工抗原的制备方法，步骤如下：

取10mg牛血清白蛋白(BSA)加1mL pH 9.1的CB缓冲液溶解，加入含1.5mg 4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯(SMCC)的N,N-二甲基甲酰胺(DMF)溶液0.1mL，室温反应2h，得到A液；取1.6mg实施例1制备的米酵菌酸半抗原，加0.1mL DMF溶解，加入到A液中，室温反应2h；用0.02mol/L PB缓冲液透析纯化3天，每天换液3次，离心，得到与牛血清白蛋白偶联的米酵菌酸人工抗原，分装，-20℃保存。

实施例3

一种米酵菌酸人工抗原的制备方法，步骤如下：

取10mg鸡卵清白蛋白(OVA)加1mL pH 9.1的CB缓冲液溶解，加入含1.3mg SMCC的DMF溶液0.1mL，室温反应2h，得到A液；取1.6mg实施例1制备的米酵菌酸半抗原，加0.1mLDMF溶解，加入到A液中，室温反应2h；用0.02mol/L PB缓冲液透析纯化3天，每天换液3次，离心，得到与鸡卵清白蛋白偶联的米酵菌酸人工抗原，分装，-20℃保存。

实施例4

一种米酵菌酸抗体，其制备方法为：

(1)动物免疫：将实施例2制备的与牛血清白蛋白偶联的米酵菌酸人工抗原注入到Balb/c小鼠体内，免疫剂量为150μg/只，使其产生多克隆抗体血清。

(2)细胞融合和克隆化：小鼠血清测定结果较高后，取其脾细胞，按8:1比例与SP2/0骨髓瘤细胞融合，采用间接竞争ELISA测定细胞上清液，筛选阳性孔。利用有限稀释法对阳性孔进行克隆化，直到得到分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株。

(3)细胞冻存和复苏：将米酵菌酸的单克隆杂交瘤细胞株用冻存液制成1×10⁹个/mL的细胞悬液，在液氮中长期保存。复苏时取出冻存管，立即放入37℃水浴中速融，离心去除冻存液后，移入培养瓶内培养。

(4)单克隆抗体的生产与纯化：将Balb/c小鼠腹腔注入灭菌石蜡油0.5mL/只，7天后腹腔注射米酵菌酸的单克隆杂交瘤细胞株6×10⁵个/只，7天后采集腹水。用辛酸-饱和硫酸铵法进行腹水纯化，-20℃保存。

(5)单克隆抗体效价的测定：用间接竞争ELISA法测定抗体的效价为1:(64000～120000)。

间接竞争ELISA方法：用实施例3制备的与鸡卵清白蛋白偶联的米酵菌酸人工抗原包被酶标板，加入米酵菌酸标准品溶液和单克隆抗体工作液，4℃反应30min，倒出孔内液体，用PBST洗涤液洗涤3～5次，用吸水纸拍干；加入辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠抗抗体，25℃反应30min，取出重复洗板步骤；加入底物显色液，25℃反应15min后，加入终止液终止反应；设定酶标仪于波长450nm处测定每孔吸光度值。

实施例5

一种米酵菌酸酶联免疫试剂盒，其包括：

(1)包被与鸡卵清白蛋白偶联的米酵菌酸人工抗原的酶标板；

(2)用辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠抗抗体；

(3)米酵菌酸单克隆抗体工作液；

(4)米酵菌酸标准品溶液6瓶，浓度分别为0μg/L、0.1μg/L、0.3μg/L、0.9μg/L、2.7μg/L、8.1μg/L；

(5)底物显色液由A液和B液组成，A液为过氧化脲，B液为四甲基联苯胺；

(6)终止液为2mol/L硫酸；

(7)洗涤液为pH7.2，含0.8％～1.2％吐温-20、0.01‰～0.03‰硫柳汞防腐剂、0.1～0.3mol/L的碳酸盐缓冲液；

(8)复溶液为pH7.6，含8％～12％酪蛋白、0.1～0.3mol/L的磷酸盐缓冲液。

本试剂盒的主要试剂以工作液的形式提供，检验方法方便易行，具有特异性高、灵敏度高、精确度高、准确度高等特点。

实施例6

一种米酵菌酸酶联免疫试剂盒检测食品中米酵菌酸的应用，其包括如下步骤：

1.样品前处理

称取1g样本到50mL离心管中，加入10mL甲醇，上下振荡5min，室温4000r/min离心5min；取上层有机相1mL到10mL离心管中，在50℃水浴氮气流下吹干；加入0.5mL复溶液复溶，涡旋1min后即为待检样品溶液(稀释倍数：5)。

2.用试剂盒检测

向包被有与鸡卵清白蛋白偶联的米酵菌酸人工抗原的酶标板微孔中加入米酵菌酸标准品溶液或样品溶液50μL，然后加入米酵菌酸单克隆抗体工作液50μL/孔，用盖板膜盖板后，25℃避光反应30min，倒出孔内液体，每孔加入250μL洗涤液，30s后倒出孔内液体，如此重复操作洗板5次，用吸水纸拍干；加入辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠抗抗体100μL/孔，用盖板膜盖板后，25℃避光反应30min，取出重复洗板步骤；每孔加入底物显色液A液过氧化脲50μL，底物显色液B液四甲基联苯胺(TMB)50μL，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置25℃避光显色15min，每孔加入终止液2mol/L硫酸50μL，轻轻振荡混匀，用酶标仪波长设定在450nm处，测定每孔吸光度值(OD值)。

3.检测结果分析

用所获得的每个浓度的标准品溶液的吸光度平均值(B)除以第一个标准品溶液(0标准)的吸光度值(B₀)再乘以100％，得到百分吸光度值。以米酵菌酸标准品浓度(μg/L)的对数值为X轴，百分吸光度值为Y轴，绘制标准曲线图，如图2所示。用同样的办法计算样品溶液的百分吸光度值，从标准曲线上读出样本所对应的浓度，乘以其对应的稀释倍数即为样本中米酵菌酸的实际浓度。

4.酶联免疫试剂盒技术参数的确定

灵敏度：指应用该法能检出待测物的最低量，定量试剂盒本身的灵敏度通常可以理解为试剂盒标准品中除“0”标准品外，浓度最小的标准品浓度值或建立标准曲线时所对应的最低标准品浓度。因此本方法的灵敏度为0.1μg/L。

检测限：通常指试剂盒产品测定实际样本的最小检出量，其理论定义为：按照合理的前处理方法对20份阴性(空白)样本进行测定，算出平均值X和标准差(SD)，据公式X+3SD得出的结果即为该样本的检测(下)限。因此，根据上述方法测得本试剂盒对银耳、木耳、酸汤子、吊浆粑、河粉、肠粉等食品的检测限为0.5μg/kg。

准确度和精密度：ELISA测定的准确度以回收率表示，精密度以变异系数表示。取空白银耳、木耳、酸汤子、吊浆粑、河粉、肠粉样本，以0.5、1、2μg/kg三个浓度的米酵菌酸对其进行添加回收试验，结果得该方法对银耳、木耳、酸汤子、吊浆粑、河粉、肠粉样本的回收率为90％±20％，批内变异系数＜10％，批间变异系数＜15％。

经测定本发明试剂盒在2～8℃至少可以保存12个月。

以上所述实施例仅表达了本发明的实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制，但凡采用等同替换或等效变换的形式所获得的技术方案，均应落在本发明的保护范围之内。

Claims (5)

1.一种米酵菌酸半抗原，其特征在于，它的分子结构式为：

2.如权利要求1所述的米酵菌酸半抗原的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

取米酵菌酸加甲苯溶解后，加入三乙胺中和至中性；加入氧化铜，搅拌，冷却到0℃，然后加入4,5-二甲基-[1,3]二氧戊环-2-硫酮充分搅拌，再加入四氯化钛，0℃下继续搅拌1h；加1mol/L盐酸淬灭反应，加水，乙酸乙酯萃取三次，合并有机相，加无水硫酸钠干燥，有机相蒸干，得到巯基-米酵菌酸，即为米酵菌酸半抗原。

3.如权利要求2所述的米酵菌酸半抗原的制备方法，其特征在于，所述米酵菌酸和4,5-二甲基-[1,3]二氧戊环-2-硫酮的物质的量之比为1:1.2。

4.一种米酵菌酸人工抗原，其是由权利要求1所述的米酵菌酸半抗原与载体蛋白偶联得到的偶联物，其特征在于，它的分子结构式为：

5.如权利要求4所述的米酵菌酸人工抗原，其特征在于，所述载体蛋白为牛血清白蛋白、鸡卵清白蛋白、人血清白蛋白或血蓝蛋白。

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