CN116462729B - 醋酸泼尼松半抗原、人工抗原及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了醋酸泼尼松半抗原、人工抗原及其应用。本发明提供了全新的醋酸泼尼松半抗原，用此半抗原制备得到醋酸泼尼松的人工抗原，以该人工抗原免疫动物所得的抗体效价高，对醋酸泼尼松的LOD为0.078ng/mL，IC₅₀为4.449ng/mL，定量检测范围为0.347ng/mL～56.94ng/mL。本发明提供的醋酸泼尼松抗体及检测方法具有简便快速、特异性强、线性范围广和灵敏度高的特点，在醋酸泼尼松的快速有效检测中具有良好的应用前景和广阔的发展空间。

Description

醋酸泼尼松半抗原、人工抗原及其应用

技术领域

本发明涉及领域，具体地，涉及醋酸泼尼松半抗原、人工抗原及其应用。

背景技术

醋酸泼尼松(Prednisone 21-acetate)，学名2-(17-羟基-10，13-二甲基-3，11-二氧代-6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17-十二氢-3H-环戊并[a]菲-17-基)-2-氧代乙酸乙酯，是肾上腺皮质束状带分泌的糖皮质激素(glucocorticoids,GCs)，具有消炎及免疫抑制等药理作用，可抑制纤维细胞增生，减少5-羟色胺、过敏性慢反应物质和缓激肽形成，从而减轻皮肤过敏性症状，因而可以使皮肤短时间内出现快速嫩白的现象。使用了含糖皮质激素化妆品，停用后易产生激素依赖性皮炎和皮肤不可逆萎缩，甚至可能起骨质疏松、高血压和糖尿病等严重的系统性损伤，因此我国的《化妆品安全技术规范》(2015年版)及欧盟化妆品规范等均明确规定糖皮质激素类物质为化妆品禁用成分。

糖皮质类激素是一种类固醇激素类，具有强大的抗炎、抗过敏、免疫抑制和抗增生的作用。在养殖业方面，糖皮质激素能促进动物的非正常生长，可以大幅提高动物养殖的经济效应，所以在养殖业中被大量使用。糖皮质类激素的泛用和滥用会使其在动物组织中及农副制品中存在不同程度的残留，存在食品安全隐患。

目前应用于食品中醋酸泼尼松的测定多为液相色谱及其质谱联用技术，然而，色谱及其联用技术虽然灵敏度和准确度较高，但大多需要大型仪器，专业性强，分析成本高，无法满足现场快速检测的需要。现有技术仅公开了一种快速检测醋酸泼尼松及其衍生物的胶体金层析试纸条及制备方法，并未公开醋酸泼尼松半抗原、人工抗原和抗体。因此，急需建立一种快速简便检测醋酸泼尼松的方法。

发明内容

为了解决现有技术中缺少快速、灵敏且简便的醋酸泼尼松免疫检测方法的问题，本发明提供了醋酸泼尼松半抗原、人工抗原及其应用。

本发明的第一个目的是提供2种醋酸泼尼松半抗原。

本发明的第二个目的是提供上述醋酸泼尼松半抗原的制备方法。

本发明的第三个目的是提供上述醋酸泼尼松半抗原在制备醋酸泼尼松人工抗原中的应用。

本发明的第四个目的是提供2种醋酸泼尼松人工抗原。

本发明的第五个目的是提供上述醋酸泼尼松人工抗原在制备醋酸泼尼松抗体中的应用。

本发明的第六个目的是提供一种醋酸泼尼松人工抗原组合。

本发明的第七个目的是提供上述醋酸泼尼松人工抗原组合在制备检测醋酸泼尼松的试剂盒中的应用。

为了实现上述目的，本发明是通过以下方案予以实现的：

本发明简化了醋酸泼尼松半抗原的合成步骤，提供了全新的醋酸泼尼松半抗原结构，与待测物的骨架结构重叠度高，进一步提高抗体亲和力，利用该人工抗原作为免疫原免疫新西兰大白兔能降低抗体的检测限，提高抗体的特异性。

一种醋酸泼尼松半抗原，即醋酸泼尼松半抗原C-PH，其结构式如式(I)所示，

所述醋酸泼尼松半抗原C-PH采用系统命名法命名为：4-((2-(17-hydroxy-10,13-dimethyl-3,11-dioxo-6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-dodec ahydro-3H-cyclopenta[a]phenanthren-17-yl)-2-oxoethoxy)methyl)benzoic acid即4-((2-(17-羟基-10，13-二甲基-3，11-二氧代-6，7，8，9，10，11，，12，13，14，15，16，17-十二氢-3H-环戊[a]菲-17-基)-2-氧代乙氧基)甲基)苯甲酸。

另一种醋酸泼尼松半抗原，即醋酸泼尼松半抗原C-2C，其结构式如式(Ⅱ)所示，

所述醋酸泼尼松半抗原C-2C采用系统命名法命名为：2-(2-(17-hydroxy-10,13-dimethyl-3,11-dioxo-6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-dodeca hydro-3H-cyclopenta[a]phenanthren-17-yl)-2-oxoethoxy)acetic acid即2-(2-(17-羟基-10，13-二甲基-3，11-二氧代-6，7，8，9，10，11，12，13，14，，15，16，17-十二氢-3H-环戊[a]菲-17-基)-2-氧代乙氧基)乙酸。

上述醋酸泼尼松半抗原C-PH的制备方法，将泼尼松、N,N-二甲基甲酰胺、氢化钠和4-(2-溴甲基)苯甲酸甲酯充分反应得到产物1；将产物1在碱性条件下充分水解，将pH调节至酸性，得到产物2；产物2经过乙酸乙酯萃取，即得到所述醋酸泼尼松半抗原C-PH。

优选地，所述泼尼松、N,N-二甲基甲酰胺、氢化钠和4-(2-溴甲基)苯甲酸甲酯的摩尔比为(1moL～1.2moL)：(5mL～10mL)：(1～1.5moL)：(1.5moL～1.8moL)。

更优选地，所述泼尼松、N,N-二甲基甲酰胺、氢化钠和4-(2-溴甲基)苯甲酸甲酯的摩尔比为1moL：5mL：1.5moL：1.5moL。

具体地，将泼尼松溶解于5mL N,N-二甲基甲酰胺中，再加入1.5moL氢化钠和1.5moL 4-(2-溴甲基)苯甲酸甲酯充分反应得到产物1；将产物1在碱性条件下充分水解，将pH调节至酸性，得到产物2；产物2经过乙酸乙酯萃取，即得到所述醋酸泼尼松半抗原C-PH。

上述醋酸泼尼松半抗原C-2C的制备方法，将泼尼松、N,N-二甲基甲酰胺、氢化钠和溴乙酸乙酯充分反应得到产物3；将产物3在碱性条件下充分水解，将pH调节至酸性，得到产物4；产物4经过乙酸乙酯萃取，即得到所述醋酸泼尼松半抗原C-2C。

优选地，所述将泼尼松、N,N-二甲基甲酰胺、氢化钠和溴乙酸乙酯的摩尔比为(1moL～1.2moL)：(5mL～10mL)：(1～1.5moL)：(1.5moL～1.8moL)。

更优选地，所述将泼尼松、N,N-二甲基甲酰胺、氢化钠和溴乙酸乙酯的摩尔比为1moL：5mL：1.5moL：1.5moL。

具体地，将泼尼松溶解于5mL N,N-二甲基甲酰胺,再加入1.5moL氢化钠和1.5moL溴乙酸乙酯充分反应得到产物3；将产物3在碱性条件下充分水解，将pH调节至酸性，得到产物4；产物4经过乙酸乙酯萃取，即得到所述醋酸泼尼松半抗原C-2C。

任一上述醋酸泼尼松半抗原在制备醋酸泼尼松人工抗原中的应用也应在本发明的保护范围之内。

一种醋酸泼尼松人工抗原，由所述醋酸泼尼松半抗原C-PH偶联载体蛋白得到，其结构式如式(Ⅲ)所示，

其中，Z为载体蛋白。

优选地，所述载体蛋白为鸡卵白蛋白、牛血清白蛋白中的任意一种。

更优选地，所述载体蛋白为牛血清白蛋白。

另一种醋酸泼尼松人工抗原，由所述醋酸泼尼松半抗原C-2C偶联载体蛋白得到，其结构式如式(Ⅳ)所示，

其中，Z为载体蛋白。

优选地，所述载体蛋白为鸡卵白蛋白、牛血清白蛋白中的任意一种。

更优选地，所述载体蛋白为鸡卵白蛋白。

任一上述醋酸泼尼松人工抗原在制备醋酸泼尼松抗体中的应用也应在本发明的保护范围之内。

任一上述醋酸泼尼松人工抗原在检测醋酸泼尼松中的应用也应在本发明的保护范围之内，所述检测以非疾病治疗诊断为目的。

一种制备醋酸泼尼松人工抗原的方法，将任一上述醋酸泼尼松半抗原通过活泼酯法偶联载体蛋白。载体蛋白通过活泼酯法偶联在醋酸泼尼松半抗原C-PH或C-2C的羧基上。

优选地，所述活泼酯法包括以下步骤：

S1.将所述醋酸泼尼松半抗原、N-羟基丁二酰亚胺、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N,N-二甲基甲酰胺充分反应，得到溶液A；载体蛋白溶于磷酸盐缓冲液得到溶液B；

S2.溶液A与溶液B充分反应后，经过透析，即得到醋酸泼尼松抗原。

更优选地，步骤S1中，所述醋酸泼尼松半抗原、N-羟基丁二酰亚胺、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐的摩尔比为(1～1.5)：(0.5～1.5)：(1～3)。

进一步优选地，步骤S1中，所述醋酸泼尼松半抗原、N-羟基丁二酰亚胺、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐的摩尔比为1mol：0.8mol：1.9mol。

更优选地，步骤S1中，所述载体蛋白与磷酸盐缓冲液的质量体积比为(10mg～20mg)：(2mL～4mL)。

进一步优选地，步骤S1中，所述载体蛋白与磷酸盐缓冲液的质量体积比为10mg：2mL。

更优选地，步骤S1中，所述载体蛋白为鸡卵白蛋白或牛血清白蛋白。

进一步优选地，步骤S1中，所述醋酸泼尼松半抗原为C-PH，则所述载体蛋白为牛血清白蛋白。

进一步优选地，步骤S1中，所述醋酸泼尼松半抗原为C-2C，则所述载体蛋白为鸡卵白蛋白。

更优选地，步骤S1中，将醋酸泼尼松半抗原、N-羟基丁二酰亚胺和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐溶解于N,N-二甲基甲酰胺，25℃下避光搅拌2h～4h。

进一步优选地，步骤S1中，将1mol醋酸泼尼松半抗原C-PH与0.8mol N-羟基丁二酰亚胺(NHS)和1.9mol 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)溶解于200μL N,N-二甲基甲酰胺(DMF)中，25℃下避光搅拌4h，

更优选地，步骤S2中，所述溶液A和溶液B的体积比为(1～2)：(5～10)。

进一步优选地，步骤S2中，所述溶液A和溶液B的体积比为1：5。

更优选地，步骤S2中，将溶液A逐滴加到溶液B中，3℃～5℃反应10h～14h。

进一步优选地，步骤S2中，将溶液A逐滴加到溶液B中，4℃反应12h。

更优选地，步骤S2中，所述透析的方法为溶液A与溶液B反应结束后，用磷酸盐缓冲液透析所得反应液。

进一步优选地，步骤S2中，所得反应液装入透析袋中，用磷酸盐缓冲液透析2天～4天，每天更换2次～4次磷酸盐缓冲液。

最优选地，步骤S2中，所得反应液装入透析袋中，用磷酸盐缓冲液透析3天，每天更换3次磷酸盐缓冲液。

上述任一方法制备得到的醋酸泼尼松人工抗原也应在本发明的保护范围之内。

任一上述醋酸泼尼松人工抗原在检测醋酸泼尼松中的应用也应在本发明的保护范围之内，所述检测以非疾病治疗诊断为目的。

任一上述醋酸泼尼松人工抗原在制备醋酸泼尼松抗体中的应用也应在本发明的保护范围之内。

一种醋酸泼尼松抗体，由上述醋酸泼尼松人工抗原免疫动物制备得到。

优选地，所述醋酸泼尼松抗体为单克隆抗体，则由偶联牛血清白蛋白的所述醋酸泼尼松半抗原C-PH免疫动物得到杂交瘤细胞，培养所得杂交瘤细胞并收集细胞进行动物免疫获得腹水，经过鉴定纯化，即得到醋酸泼尼松单克隆抗体。

优选地，所述醋酸泼尼松抗体为多克隆抗体，则由偶联牛血清白蛋白的所述醋酸泼尼松半抗原C-PH免疫动物，收集血清，得到多克隆抗体。

任一上述醋酸泼尼松抗体在检测醋酸泼尼松中的应用也应在本发明的保护范围之内，所述检测以非疾病治疗诊断为目的。

任一上述醋酸泼尼松抗体在制备检测醋酸泼尼松的试剂盒中的应用也应在本发明的保护范围之内。

一种醋酸泼尼松人工抗原组合，包含免疫原和包被原，所述免疫原由所述醋酸泼尼松半抗原C-PH偶联牛血清白蛋白得到；所述包被原由所述醋酸泼尼松半抗原C-2C偶联鸡卵白蛋白得到。

优选地，所述包被原由所述醋酸泼尼松半抗原C-2C偶联鸡卵白蛋白得到。

任一上述醋酸泼尼松人工抗原组合在检测醋酸泼尼松中的应用也应在本发明的保护范围之内，所述检测以非疾病治疗诊断为目的。

任一上述醋酸泼尼松人工抗原组合在制备检测醋酸泼尼松的试剂盒中的应用也应在本发明的保护范围之内。

一种检测醋酸泼尼松的免疫分析方法，使用任一上述醋酸泼尼松人工抗原组合进行检测，所述检测以非疾病治疗诊断为目的。

一种检测醋酸泼尼松的试剂盒，包含醋酸泼尼松人工抗原组合，所述醋酸泼尼松人工抗原组合包含免疫原和包被原，所述免疫原由所述醋酸泼尼松半抗原C-PH偶联牛血清白蛋白得到；所述包被原由所述醋酸泼尼松半抗原C-2C偶联鸡卵白蛋白得到。

优选地，所述试剂盒包含抗体，所述抗体由所述免疫原免疫动物得到。

更优选地，所述抗体为多克隆抗体，由偶联牛血清白蛋白的所述醋酸泼尼松半抗原C-PH免疫动物，收集血清，得到多克隆抗体。后续可采用辛酸-硫酸铵法进一步纯化血清后得到抗体。

优选地，所述试剂盒还包含酶标板、醋酸泼尼松标准品和底物显色液。

更优选地，所述酶标板上包被有所述包被原。

更优选地，所述醋酸泼尼松标准品包括11个浓度，分别为10000ng/mL、5000ng/mL、2000ng/mL、285.71429ng/mL、40.81633ng/mL、5.8309ng/mL、0.83299ng/mL、0.119ng/mL、0.017ng/mL、0.00243ng/mL和0.00034714ng/mL。

进一步优选地，所述酶标板上包被有由所述醋酸泼尼松半抗原C-2C偶联鸡卵白蛋白得到的包被原。

更优选地，所述底物显色液包含过氧化脲和四甲基联苯胺。

更优选地，所述试剂盒还包含终止液、洗涤液、封闭液、酶结合物浓缩液和酶结合物稀释液。

进一步优选地，所述终止液体积分数为8％～12％ H₂SO₄。

最优选地，所述终止液体积分数为10％ H₂SO₄。

进一步优选地，所述洗涤液为含有体积分数为0.5％～1.0％吐温-20、质量分数为0.01％～0.03％叠氮化钠防腐剂、0.1mol/L～0.3mol/L的磷酸盐缓冲液，pH值为7.2～7.6。

最优选地，所述洗涤液为含有体积分数为0.8％吐温-20、质量分数为0.02％叠氮化钠防腐剂、0.2mol/L的磷酸盐缓冲液，pH值为7.4。

进一步优选地，所述封闭液为含有质量分数为1％～3％酪蛋白、0.1mol/L～0.3mol/L的磷酸盐缓冲液，pH值为7.1～7.5。

最优选地，所述封闭液为含有质量分数为2％酪蛋白、0.2mol/L的磷酸盐缓冲液，pH值为7.3。

进一步优选地，所述酶结合物浓缩液为辣根过氧化物酶标记的羊抗兔抗体或羊抗鼠抗体。

进一步优选地，所述酶结合物稀释液为0.1mol/L～0.3mol/L磷酸盐缓冲液。

最优选地，所述酶结合物稀释液为0.2mol/L磷酸盐缓冲液。

一种检测醋酸泼尼松的胶体金试纸条，包括PVC底板和依次排列在PVC底板上的样品垫、纤维素膜和吸水垫，所述纤维素膜上设有检测线和质控线，所述检测线包被胶体金标记的醋酸泼尼松人工抗原C-2C-OVA，所述质控线包被羊抗兔IgG抗体。

所述胶体金试纸条的使用方法如下：

将待测样品用磷酸盐缓冲液稀释后，滴加至胶体金试纸条的样品垫，静置直至待测样品充分渗入吸水垫，进行结果判定；

具体判定方法为：

质控线不显色，则检测效果无效，需重新检测；质控线显示红色，则检测效果有效，进一步判读检测线：检测线不显色或者显色很弱，即表示待测样品中含有醋酸泼尼松，判读结果为阳性或者弱阳性；检测线显示红色，即表示待测样品中不含醋酸泼尼松，判读结果为阴性。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明提供了全新的醋酸泼尼松半抗原，用此半抗原制备得到醋酸泼尼松的人工抗原，以该人工抗原免疫动物所得的抗体效价高，对醋酸泼尼松的LOD为0.078ng/mL，IC₅₀为4.449ng/mL，定量检测范围为0.347ng/mL～56.94ng/mL。本发明提供的醋酸泼尼松抗体及检测方法具有简便快速、特异性强、线性范围广和灵敏度高的特点，在醋酸泼尼松的快速有效检测中具有良好的应用前景和广阔的发展空间。

附图说明

图1为醋酸泼尼松半抗原C-PH的合成路线图。

图2为醋酸泼尼松半抗原C-2C的合成路线图。

图3为醋酸泼尼松人工抗原C-PH-BSA的紫外扫描图。

图4为醋酸泼尼松人工抗原C-2C-OVA的紫外扫描图。

图5为醋酸泼尼松ELISA标准曲线图。

具体实施方式

下面结合说明书附图及具体实施例对本发明作出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。

实施例1醋酸泼尼松半抗原的合成与鉴定

一、醋酸泼尼松半抗原的C-PH合成与鉴定

1、醋酸泼尼松半抗原C-PH的合成

醋酸泼尼松半抗原C-PH的合成路线如图1所示，具体步骤如下：

以600mg的泼尼松(CAS号：53-03-2)为原料，充分溶解于5mL N,N-二甲基甲酰胺中，先加入与原料摩尔比为1:1.5的氢化钠在室温(25℃)下搅拌反应1h，再加入与原料摩尔比为1:1.5的4-(2-溴甲基)苯甲酸甲酯，在室温(25℃)下搅拌反应。

以TLC检测反应的进展，展开剂为甲醇-乙酸乙酯(1:5，v/v)。反应12h后，将反应物经液相萃取后以硅胶柱层析分离纯化，以甲醇-乙酸乙酯(1:5，v/v)作为流动相梯度洗脱，得到产物1；减压蒸馏，去除产物1中的溶剂，再以甲醇溶解，再加入与甲醇体积比为1:1的超纯水，与3mol/L的氢氧化钠水溶液在室温下搅拌反应3h，得到产物2。

以浓度为3mol/L的盐酸调节产物2的pH至6～7，以超纯水与乙酸乙酯体积比为1:1进行萃取，收集水相重复萃取，共萃取3次，合并有机相，通过无水Na₂SO₄除水干燥过滤，减压蒸馏除去溶剂后得到黄色油状物质，即得半抗原C-PH。

2、醋酸泼尼松半抗原C-PH的鉴定

醋酸泼尼松半抗原C-PH的核磁共振氢谱结果为：1H NMR(400MHz,CDCl₃)δ7.98(m,2H),7.27(m,2H),6.75(d,J＝8.7Hz,1H),6.28(d,J＝8.7Hz,1H),6.03(s,1H),4.8(s,J＝7.4Hz,2H),4.53(s,1H),4.42(s,2H),2.42(m,1H),2.38(s,1H),2.32(m,1H),2.13(s,1H),2.08(d,1H),2.02(dd,J＝3.5Hz,J＝13.5Hz,1H),1.97(dd,J＝3.0Hz，J＝14.8Hz，1H),1.90(dd，J＝2.4Hz,J＝13.5Hz，1H),1.77(dd,J＝3.5Hz,J＝13.5Hz，1H),1.72(dd,J＝3.0Hz，J＝14.8Hz，1H),1.65(dd,J＝2.4Hz,J＝13.5Hz,1H),1.50(dd,J＝3.4Hz,J＝11.2Hz,1H),1.42(s,3H),1.11(dd,J＝3.1Hz,J＝12.6Hz,1H),0.96(s,3H)。

醋酸泼尼松半抗原C-PH的质谱结果为：MS：C₂₉H₃₂O₇：494.58，ESI⁺[M-H]⁺：495.68。

由质谱核磁结果可以看出，494.58为半抗C-PH的正离子分子峰，计算得其相对分子质量为495.68，与实际的相对分子质量相符，说明成功制备得到了醋酸泼尼松半抗原C-PH，其结构式如式(Ⅰ)所示，

醋酸泼尼松半抗原C-PH采用系统命名法命名为：4-((2-(17-hydroxy-10,13-dimethyl-3,11-dioxo-6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-dodec ahydro-3H-cyclopenta[a]phenanthren-17-yl)-2-oxoethoxy)methyl)benzoic acid即4-((2-(17-羟基-10，13-二甲基-3，11-二氧代-6，7，8，9，10，11，，12，13，14，15，16，17-十二氢-3H-环戊[a]菲-17-基)-2-氧代乙氧基)甲基)苯甲酸。

二、醋酸泼尼松半抗原C-2C的合成与鉴定

1、醋酸泼尼松半抗原C-2C的合成

醋酸泼尼松半抗原C-2C的合成路线如图2所示，具体步骤如下：

以600mg的泼尼松(CAS号：53-03-2)为原料充分溶解于5mL N,N-二甲基甲酰胺中，先加入与原料摩尔比为1:1.5的氢化钠在室温(25℃)下搅拌反应1h，再加入与原料摩尔比为1:1.5的溴乙酸乙酯，在室温(25℃)下搅拌反应。

以TLC检测反应情况，展开剂为甲醇-乙酸乙酯(1:5，v/v)。反应10h后，然后经液相萃取后以硅胶柱层析分离纯化，以甲醇-乙酸乙酯(1:5，v/v)作为流动相梯度洗脱，得产物3，减压蒸馏，去除产物3中的溶剂；再以甲醇溶解，再加入与甲醇体积比为1:1的超纯水，与3mol/L的氢氧化钠水溶液在室温下搅拌反应3h，得到产物4。

以浓度为3mol/L的盐酸调节产物4的pH至6～7，，以超纯水与乙酸乙酯体积比为1:1进行萃取，收集水相重复萃取，共萃取3次，，合并有机相，通过无水Na₂SO₄除水干燥过滤，减压蒸馏除去溶剂，减压浓缩滤液后得到黄色油状物质，即半抗原C-2C。

2、醋酸泼尼松半抗原C-2C的鉴定

醋酸泼尼松半抗原C-2C的核磁共振氢谱结果为：1H NMR(400MHz,CDCl₃)δ6.57(d,J＝8.6Hz,1H),6.15(d,J＝8.7Hz,1H),5..96(s,1H),4.63(s,J＝7.2Hz,2H),4.35(s,2H),3.92(s,1H),2.32(m,1H),2.25(s,1H),2.27(m,1H),2.05(s,1H),1.97(d,1H),1.93(dd,J＝3.5Hz,J＝13.5Hz,1H),1.87(dd,J＝3.0Hz，J＝14.8Hz，1H),1.76(dd，J＝2.4Hz,J＝13.5Hz，1H),1.63(dd,J＝3.5Hz,,J＝13.5Hz，1H),1.58(dd,J＝3.0Hz，J＝14.8Hz，1H),1.50(dd,J＝2.4Hz,J＝13.5Hz,1H),1.46(dd,J＝3.4Hz,J＝11.2Hz,1H),1.34(s,3H),1.02(dd,J＝3.1Hz,J＝12.6Hz,1H),0.87(s,3H)。

醋酸泼尼松半抗原C-2C的质谱结果为：MS：C₂₃H₂₈O₇：416.47，ESI+[M-H]+：417.91。

由质谱核磁结果可以看出，416.47为半抗原C-2C的正离子分子峰，计算得其相对分子质量为417.91，与实际的相对分子质量相符，说明成功制备得到了醋酸泼尼松半抗原C-2C，其结构式如式(Ⅱ)所示，

醋酸泼尼松半抗原C-2C采用系统命名法命名为：2-(2-(17-hydroxy-10,13-dimethyl-3,11-dioxo-6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-dodeca hydro-3H-cyclopenta[a]phenanthren-17-yl)-2-oxoethoxy)acetic acid即2-(2-(17-羟基-10，13-二甲基-3，11-二氧代-6，7，8，9，10，11，12，13，14，，15，16，17-十二氢-3H-环戊[a]菲-17-基)-2-氧代乙氧基)乙酸。

实施例2醋酸泼尼松人工抗原的合成与鉴定

1、人工抗原的合成

将实施例1制备的醋酸泼尼松半抗原C-PH和C-2C，通过活泼酯法分别偶联牛血清白蛋白(BSA)和鸡卵白蛋白(OVA)。具体包括如下步骤：

将1mol醋酸泼尼松半抗原C-PH与0.8mol N-羟基丁二酰亚胺(NHS)和1.9mol 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)溶解于200μL N,N-二甲基甲酰胺(DMF)中，室温下(25℃)避光搅拌4h，得到半抗原C-PH活化液，记为A液；将10mg BSA加入到1mLPBS缓冲液(0.01moL/L，pH＝7.4)中完全溶解，记为B液。

将200μL A液缓慢逐滴加入1mL B液中，4℃反应12h将反应液装入透析袋中，用PBS缓冲液透析3天，每天3次，透析结束后，收集透析袋中的溶液，即得醋酸泼尼松人工抗原C-PH-BSA，分装于离心管中，于-20℃保存，以供使用。

2、人工抗原的鉴定

取上述BSA、OVA、C-2C、C-PH、C-PH-BSA和C-2C-OVA，分别用紫外全波长法(150～400nm)进行鉴定。

紫外全波长扫描鉴定结果如图3和图4所示，比较偶联前后的BSA、OVA、C-2C、C-PH、C-2C-OVA和C-PH-BSA的最高吸光值可知，C-PH-BSA的吸收曲线与BSA吸收曲线明显不同，C-2C-OVA的吸收曲线和OVA的吸收曲线明显不同；C-PH-BSA和C-2C-OVA的吸收曲线在280nm处出现了与BSA和OVA吸收曲线不同的偏移；因此，C-PH-BSA和C-2C-OVA的吸收曲线是BSA和OVA分别与醋酸泼尼松的半抗原C-PH和C-2C的累加吸收峰；由此可见，醋酸泼尼松的半抗原分别与BSA和OVA成功偶联，本发明成功制备得到了C-PH-BSA人工抗原和C-2C-OVA人工抗原。

醋酸泼尼松半抗C-PH的人工抗原的结构式如式(Ⅲ)所示，

醋酸泼尼松半抗原C-2C的人工抗原的结构式如式(Ⅳ)所示，

其中，Z为载体蛋白OVA或BSA。

实施例3用于检测醋酸泼尼松的多克隆抗体的制备

1、动物免疫

将实施例2制备的醋酸泼尼松人工抗原C-PH-BSA与免疫佐剂(初次免疫用弗氏完全佐剂；加强免疫用弗氏不完全佐剂)按照比例1：1混合乳化均匀，备用。

初次免疫时通过颈背部对大白兔进行皮下注射，共免疫五次，每次间隔3周，每次免疫剂量为0.5mg/只。免疫期间，通过从大白兔的耳缘静脉取少量血进行抗体质量鉴定，用于检测免疫效果。

2、多克隆抗体获得

第五次免疫后的第十天进行采血，将所得兔血在37℃温育2h后，在4℃条件下放置过夜(12h)，第二天将水层清液取出，然后在4℃条件下，3000r/min离心10min，去除沉淀，获得上清液，即得用于检测醋酸泼尼松的多克隆抗体，分装，标记，-20℃保存。后续可采用辛酸-硫酸铵法进一步纯化血清后得到抗体。

实施例4用于检测醋酸泼尼松的单克隆抗体的制备

1、动物免疫

取实施例2制备的醋酸泼尼松人工抗原C-PH-BSA作为免疫原，用PBS稀释至50μL，与50μL佛氏佐剂(首次免疫为弗氏完全佐剂，后续免疫为弗氏不完全佐剂)混合均匀，含免疫蛋白50μg当量/只，用乳化器乳化至乳化物水面试验不扩散为止，备用。

注射量为100μL/只，免疫Balb/C雌性小鼠，首次免疫时通过腹和背部皮下多点注射，4周后加强免疫，之后每隔3周进行一次加强免疫，共免疫5次。

2、动物抗体产生情况检测

在第二次加强免疫及往后的每次免疫的1周后，对小鼠进行尾静脉采血，离心，获取抗血清。采用icELISA的方式检查抗血清的抗体滴度及抑制率。

3、细胞融合

(1)骨髓瘤细胞复苏及培养

将骨髓瘤细胞复苏后进行扩大培养。细胞融合当天，将收集贴壁生长的骨髓瘤细胞，1000r/min离心8min。离心后弃上清，得到骨髓瘤细胞，备用。

(2)冲刺免疫

在进行细胞融合的前3天，对小鼠进行一次冲刺免疫，不用佐剂，只注射免疫原，注射量为100μL，注射浓度为1mg/mL。

(3)小鼠的免疫脾细胞获取

处死完成冲刺免疫后的小鼠，收集血液，取出脾脏分离得到免疫脾细胞。

(4)细胞融合

将骨髓瘤细胞和免疫脾细胞混合后，于37℃水浴，缓慢加入1mL 37℃的聚乙二醇(PEG2000)混合均匀，静置0.5min，再加入20mL 37℃基础培养基，混合均匀，即得到融合细胞，封口，1000rpm离心7min，弃上清，所得融合细胞于37℃、5％CO₂细胞培养箱中继续培养。

(5)杂交瘤细胞筛选及鉴定

在融合细胞培养的第7天起每天观察细胞生长情况及培养基状态；第10天时或者细胞生长过快时，用HAT培养基半换液；第13天时，用HAT全换液；第15天时，用HT培养基半换液，此时对细胞上清进行第1次icELISA检测，判断细胞是否发生融合上以及细胞的融合程度；第17天时，用HT培养基全换液，此时进行第2次icELISA检测；第19天时，用HT培养基全换液，此时进行第3次icELISA检测，对比前三次上清检测结果，挑出高效价的孔进行有限稀释。对有限稀释的细胞上清进行icELISA检测时，以效价和抑制率做为衡量指标，选出阳性孔后，再进行一轮有限稀释，直至每板每个孔的融合细胞都为阳性，效价和抑制相近。此时，由杂交瘤细胞分泌的抗体即为用于检测醋酸泼尼松的单克隆抗体。

实施例5免疫原和包被原的组合

按照实施例2的方法，区别仅在于用乳铁蛋白(LF)和OVA代替BSA，制备得到醋酸泼尼松人工抗原C-PH-LF和C-PH-OVA；用LF代替OVA，制备得到醋酸泼尼松人工抗原。

利用实施例3制备的多克隆抗体，以上述C-PH-LF、C-2C-LF和C-PH-OVA以及实施例2制得的C-2C-OVA作为包被原，通过间接竞争ELISA方法获得的血清效价和抑制率来选择最佳的免疫原和包被原的组合。

具体操作步骤如下：

1、将醋酸泼尼松人工抗原C-PH-LF、C-2C-LF、C-PH-OVA和C-2C-OVA分别用包被液(0.05M碳酸盐缓冲溶液，pH 9.6)稀释至250ng/mL的浓度，100μL/孔包被96孔酶标板，37℃恒温水浴箱温育过夜，弃包被液，用PBST(0.01M PBS，0.06％ Tween-20(v/v))洗涤2次；

2、每孔加入120μL封闭液(pH值为7.3，含有质量分数为2％酪蛋白、0.2mol/L的磷酸盐缓冲液)，37℃封闭3h，弃去封闭液，拍板，在干燥箱37℃烘干备用；

3、将实施例3制得的多克隆抗体用PBST稀释为1:4000、1:8000、1:16000、1:32000、1:64000、1:128000、1:256000，同时设置空白对照孔(用PBST代替)；用PBST将1mg/mL醋酸泼尼松标准品稀释至浓度为1μg/mL；

4、效价列为先每孔加50μL的PBST，然后不同稀释比例的多克隆抗体按每孔50μL依次加入孔内，最后一个孔不加抗体，用50μL PBST代替；

5、抑制列为先每孔加50μL的醋酸泼尼松标准品，然后将不同稀释比例的多克隆抗体按每孔50μL依次加入孔内，最后一个孔不加抗体，用50μL PBST代替；

6、37℃下温育40min，洗涤5次，拍板；

7、加入羊抗兔二抗-HRP(5000倍稀释)，37℃温育30min，洗涤5次，拍板；

8、加入显色液，在37℃下温育显色10min；

9、加入体积分数为10％ H₂SO₄终止反应，并在450nm处读取OD值；统计效价和抑制率，效价是OD₄₅₀为1.0左右所对应的抗体稀释倍数，抑制率＝(效价的OD值-抑制的OD值)/抑制的OD值×100％。

不同免疫原和包被原的组合结果如表3所示。

表1免疫原和包被原的筛选结果

从表1中可以看出，醋酸泼尼松人工抗原C-PH-BSA作为免疫原产生的抗血清均有一定的效价，所得抗血清对目标分析物醋酸泼尼松均有不同程度的抑制效果。其中，编号4的免疫原和包被原结构组合所示的抗血清效价1:256000和抑制率89.72％为最佳组合；在该组合下，醋酸泼尼松多克隆抗体不仅能特异性识别目标分析物醋酸泼尼松，而且抗体灵敏度好；抗血清效价和抑制率均高于编号1、2和3的免疫原和包被原组合，故编号4的免疫原和包被原结构组合为最佳组合。即将C-PH-BSA作为免疫原，C-2C-OVA作为包被原。

实施例6醋酸泼尼松间接竞争ELISA检测方法的建立

1、一种检测醋酸泼尼松的间接竞争ELISA方法，包括以下步骤：

(1)将实施例2制得的醋酸泼尼松人工抗原C-2C-OVA作为包被原，用包被液(0.05M碳酸盐缓冲溶液，pH 9.6)稀释至62.5ng/mL，100μL/孔包被96孔酶标板，37℃孵育过夜(12h)；

(2)弃去包被液，洗涤2次，拍干；

(3)每孔加入120μL封闭液(pH值为7.3，含有质量分数为2％酪蛋白、0.2mol/L的磷酸盐缓冲液)，37℃封闭3h；

(4)弃去封闭液，拍板，37℃烘干30min后取出，用自封袋装好备用；

(5)用PBST按照体积比1：4000倍稀释实施例3制得的多克隆抗体，并将醋酸泼尼松标准品稀释至10000ng/mL、5000ng/mL、2000ng/mL、285.71429ng/mL、40.81633ng/mL、5.8309ng/mL、0.83299ng/mL、0.119ng/mL、0.017ng/mL、0.00243ng/mL和0.00034714ng/mL；

(6)每行加入50μL醋酸泼尼松稀释液(三组平行)，再加50μL/孔稀释的实施例3制得的多克隆抗体，37℃孵育40min，洗涤5次，拍干；

(7)加入羊抗兔二抗-HRP(5000倍稀释)，37℃温育30min，洗涤5次，拍干；

(8)加入显色液，每孔100μL，显色10min；

(9)加入50μL体积分数为10％ H₂SO₄终止反应，并在450nm处读取OD值。

(10)根据OD值绘制ELISA标准曲线：

以B/B₀作为纵坐标(B为不同浓度醋酸泼尼松标准品的吸光值OD₄₅₀，B₀为空白对照孔的吸光值OD₄₅₀)，标准品浓度的对数为横坐标，采用Logistic函数进行曲线拟合，得到标准曲线的公式，并制得标准曲线。

2、实验结果

用于检测醋酸泼尼松的抗体间接竞争ELISA标准曲线如图5所示，可知用于检测醋酸泼尼松的抗体半抑制浓度(IC₅₀)为4.449ng/mL，定量检测范围为0.347～56.94ng/mL，最低检测限为0.078ng/mL；说明本发明制备得到的用于检测醋酸泼尼松的多克隆抗体可以满足检测要求，成功建立检测醋酸泼尼松的竞争ELISA方法，对醋酸泼尼松的识别能力高，特异性强，且检测灵敏度高。

实施例7醋酸泼尼松抗体的特异性评价

1、实验方法

乙酸氟氢可的松和甲基泼尼松均为醋酸泼尼松的类似物，过交叉反应实验来确定本发明制备的抗体对检测醋酸泼尼松的特异性。

按照实施例6的方法，区别仅在于将醋酸泼尼松标准品替换为乙酸氟氢可的松和甲基泼尼松，以同样的稀释倍数进行检测，得到各结构类似物的IC₅₀值。

按照以下公式计算醋酸泼尼松交叉反应率(CR)：CR(％)＝IC₅₀(醋酸泼尼松)/IC₅₀(结构类似物)×100％，交叉反应率越小，则表示特异性越强。

2、实验结果

表2醋酸泼尼松与其类似物的交叉反应结果

醋酸泼尼松与其结构类似物的交叉反应结果如表2所示，可知用于检测醋酸泼尼松的多克隆抗体对醋酸泼尼松的交叉反应率为100％，IC₅₀为4.449ng/mL，对乙酸氟氢可的松和甲基泼尼松的交叉反应率分别为8.89％和2.52％；说明用于检测醋酸泼尼松的多克隆抗体的特异性强，可以有效的排除其类似物对醋酸泼尼松检测的干扰，能够专门用于对醋酸泼尼松的检测。

实施例8一种检测醋酸泼尼松的ELISA试剂盒

1、组成

(1)包被有包被原的酶标板：

所述酶标板由如下方法制备得到：

将实施例2制备得到的醋酸泼尼松人工抗原C-2C-OVA作为包被原，用包被缓冲液(0.05M碳酸盐缓冲溶液，pH 9.6)稀释至125ng/mL，以100μL/孔加入酶标板，37℃避光孵育过夜，除去孔中液体，用本试剂盒中的洗涤液洗涤2次，每次30s，拍干，然后在每孔中加入120μL封闭液(pH值为7.3，含有质量分数为2％酪蛋白、0.2mol/L的磷酸盐缓冲液)，37℃避光孵育3h，倾去孔内液体拍干，干燥后用铝膜真空密封保存；

(2)标准品：

11个不同浓度的醋酸泼尼松标准品溶液，浓度分别为10000ng/mL、5000ng/mL、2000ng/mL、285.71429ng/mL、40.81633ng/mL、5.8309ng/mL、0.83299ng/mL、0.119ng/mL、0.017ng/mL、0.00243ng/mL和0.00034714ng/mL；

(3)抗体：

实施例3以醋酸泼尼松人工抗原C-PH-BSA为免疫原制备的多克隆抗体，实施例4以醋酸泼尼松人工抗原C-PH-BSA为免疫原制备的单克隆抗体；

(4)酶标二抗：

辣根过氧化物酶标记的羊抗兔抗体或羊抗鼠抗体；

(5)底物显色液：

由A液和B液组成，A液为过氧化脲，B液为四甲基联苯胺；

(6)终止液

体积分数为10％ H₂SO₄；

(7)洗涤液

pH值为7.4，含有体积分数为0.8％吐温-20、质量分数为0.02％叠氮化钠防腐剂和0.2mol/L的磷酸盐缓冲液。

(8)酶结合物稀释液

0.2mol/L磷酸盐缓冲液。

2、使用方法

(1)样品检测

将样品和本试剂盒的标准品对应微孔按序编号，每个样品和标准品做2孔平行，并记录标准孔和样品孔所在的位置。根据需要量将酶结合物浓缩液用酶结合物稀释液按1:10体积比进行稀释(即一份酶结合物浓缩液加入10份酶结合物稀释液，现配现用)，得到酶结合物工作液。

加入标准品或样品50μL到对应的微孔中，然后加入酶结合物工作液50μL，轻轻震荡混匀，用盖板膜盖板后置25℃避光环境中反应30min。

将孔内液体甩干，加入洗涤工作液250μL/孔。充分洗涤4～5次，每次间隔10s，弃掉板孔内洗涤液，用吸水纸拍干(拍干后未被清除的气泡可使用未使用过的枪头戳破)。

加入底物显色液A液50μL/孔，再加入底物显色液B液50μL/孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置25℃避光环境中反应10min。加入终止液50μL/孔，轻轻振荡混匀，设定酶标仪于450nm处，测定每孔OD值。

(2)标准曲线的绘制

根据醋酸泼尼松标准品450nm处的OD值绘制ELISA标准曲线，具体方法如下：

以B/B₀作为纵坐标(B为不同浓度醋酸泼尼松标准品的吸光值OD₄₅₀，B₀为空白对照孔的吸光值OD₄₅₀)，标准品浓度的对数为横坐标，采用Logistic函数进行曲线拟合，得到标准曲线的公式，并制得标准曲线。

(3)样品浓度的计算

将样品OD₄₅₀的平均值代入上述标准曲线的公式，得到样品的浓度，再乘以其对应的稀释倍数即得到检测样本中醋酸泼尼松的实际浓度。

实施例9一种检测醋酸泼尼松的胶体金试纸条

1、金标抗体和金标结合物垫的制备

采用柠檬酸三钠还原氯金酸的方法，制备平均直径在40nm的胶体金悬浮液。

先将胶体金用0.2mol的K₂CO₃溶液调节pH至8.5，然后采用经典NaCl滴定法确定抗体标记量，最终选择将20μg实施例3所制备的醋酸泼尼松抗体和1mL胶体金溶液进行标记，即得到金标抗体，4℃保存。

用XYZ-3000三维喷膜仪把4％的BSA溶液以8μL/cm的量喷在玻璃棉上，使用干燥箱42℃干燥50min，再把金标抗体以6μL/cm的量喷在玻璃棉上，用干燥箱42℃干燥50min后，即得到金标结合物垫，真空干燥保存。

2、偶联抗原羊抗兔包被的纤维素膜

用XYZ-3000三维喷膜仪把浓度为1mg/mL的包被抗原(C-2C-OVA)以1.2μL/cm的量，以垂直于纤维素膜的长边的方向喷在纤维素膜的右侧，作为检测线(即T线)。用XYZ-3000三维喷膜仪把浓度为120μg/L的羊抗兔IgG以1.2μL/cm的量，以垂直于纤维素膜的长边的方向喷在纤维素膜的左侧，作为对照线(即C线)，两线间隔8mm，即得到偶联抗原羊抗兔包被的纤维素膜。

3、快速试纸条的组装

把纤维素膜粘贴在衬板的中间部位上；吸水垫粘贴在纤维素膜的左侧，并有1mm宽的重叠；金标结合物垫粘贴在纤维素膜的右侧，并有1mm宽的重叠；样品垫粘贴在金标结合物垫的右侧，并有2mm宽的重叠，即得到胶体金试纸条。用斩切机将胶体金试纸条切成3.05mm宽。

5、待测液的制备

吸取0.5mL待测样品，与9.5mL 0.2mol/L pH 7.4的磷酸盐缓冲溶液充分混合均匀，涡旋混合30s，即得到待测液。

6、快速检测试纸条检测及判断

将待测液滴加至样品垫，静置，待测液通过虹吸作用带动待测物及金标结合物垫3中的金标抗体一起向纤维素膜扩散，并最终渗入吸水垫。

金标抗体与纤维素膜上的隐形的质控线(即C线)结合，使质控线(即C线)显红色，表示检测结果的有效，质控线(即C线)不显色则表示检测结果无效；如果样品中有醋酸泼尼松时，醋酸泼尼松和金标抗体结合，进而占据了金标抗体上的抗原结合点，阻止金标抗体与纤维素膜上隐形检测线(半抗原与载体蛋白的结合物)的结合，使隐形的检测线(即T线)不显色或者显色很弱，即表示检测样品阳性或者弱阳性；如果样品中没有醋酸泼尼松时，金标抗体在上移过程中，遇隐形检测线(即T线)显示一条清晰红线，即表示检测样品阴性。

最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，对于本领域的普通技术人员来说，在上述说明及思路的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种醋酸泼尼松半抗原，其特征在于，其结构式如式(I)所示，

2.一种醋酸泼尼松半抗原，其特征在于，其结构式如式(Ⅱ)所示，

3.结构式如式(I)所示化合物的制备方法，其特征在于，将泼尼松、N,N-二甲基甲酰胺、氢化钠和4-(2-溴甲基)苯甲酸甲酯充分反应得到产物1；将产物1在碱性条件下充分水解，将pH调节至酸性，得到产物2；产物2经过乙酸乙酯萃取，即得到；

所述产物1的结构式为

4.结构式如式(Ⅱ)所示化合物的制备方法，其特征在于，将泼尼松、N,N-二甲基甲酰胺、氢化钠和溴乙酸乙酯充分反应得到产物3；将产物3在碱性条件下充分水解，将pH调节至酸性，得到产物4；产物4经过乙酸乙酯萃取，即得；

所述产物3的结构式为

5.权利要求1或权利要求2所述醋酸泼尼松半抗原在制备醋酸泼尼松人工抗原中的应用。

6.一种醋酸泼尼松人工抗原，其特征在于，由权利要求1所述醋酸泼尼松半抗原偶联载体蛋白得到，其结构式如式(Ⅲ)所示，

其中，Z为载体蛋白，所述载体蛋白为卵白蛋白、牛血清白蛋白中的任意一种。

7.一种醋酸泼尼松人工抗原，其特征在于，由权利要求2所述醋酸泼尼松半抗原偶联载体蛋白得到，其结构式如式(Ⅳ)所示，

其中，Z为载体蛋白，所述载体蛋白为卵白蛋白、牛血清白蛋白中的任意一种。

8.权利要求6或7所述醋酸泼尼松人工抗原在制备醋酸泼尼松抗体中的应用。

9.一种醋酸泼尼松人工抗原组合，其特征在于，包含免疫原和包被原，所述免疫原由权利要求1所述醋酸泼尼松半抗原偶联牛血清白蛋白得到；所述包被原由权利要求2所述醋酸泼尼松半抗原偶联鸡卵白蛋白得到。

10.权利要求9所述醋酸泼尼松人工抗原组合在制备检测醋酸泼尼松的试剂盒中的应用。