CN106589034A - 一种地塞米松人工半抗原及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种地塞米松人工半抗原，所述的地塞米松人工半抗原为以下结构式a：本发明的目的在于提供两种地塞米松两种半抗原，同时本发明还提供上述两种地塞米松两种半抗原的制备方法，该制备方法可以有效的降低能耗，提高制备效率。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及地塞米松两种半抗原及其制备方法。
背景技术
中国专利申请CN201210157636.8公开了一种半抗原及其制备方法和应用，其采用地塞米松和丙二胺作为反应原料，在DMSO中反应，其半抗原的制备过程中要旋蒸除去高沸点溶剂DMSO，和过剩反应物1,3-丙二胺。设备要求较高，耗能，耗时。
发明内容
针对上述不足，本发明的目的在于提供两种地塞米松两种半抗原，结构a，充分暴露了地塞米松分子中电子云密度大的部分，作为决定簇；结构b，从地塞米松的另一点位接上连接臂，作为包被原，与抗体的亲和力，较地塞米松与抗体的亲和力低，从而产生抑制，同时本发明还提供上述两种地塞米松两种半抗原的制备方法，该制备方法可以有效的降低能耗，提高制备效率。
为了解决上述技术问题，本发明提供的技术方案为：一种地塞米松人工半抗原，所述的地塞米松人工半抗原为以下结构式a：
同时本发明还提供另外一种地塞米松人工半抗原，所述的地塞米松人工半抗原为以下结构式b：
需要说明的是，结构式a和b在其加成结构的尾端都具有羧基，其具有其作用是把地塞米松小分子通过活化羧基后连接到蛋白质大分子上。一般来说物质的相对分子量小于3000da，只有反应性，没有免疫原性。而蛋白质是很好的免疫原。
从理论上来讲：结构a，充分暴露了地塞米松分子中电子云密度大的部分，作为决定簇；结构b，从地塞米松的另一点位接上连接臂，作为包被原，与抗体的亲和力，较地塞米松与抗体的亲和力低，从而产生抑制。
在上述结构式a的地塞米松人工半抗原的制备方法中，所述的方法具体为：以地塞米松和丁二酸酐为反应物，在吡啶存在的条件下于挥发性有机溶剂中反应，反应结束后除去有机溶剂并加用水稀释浓缩物，调节pH值使结构式a所示的产物析出，收集即可。
在上述结构式a的地塞米松人工半抗原的制备方法中，所述的方法具体为：称量450-550mg地塞米松，150-170mg丁二酸酐；量取挥发性有机溶剂9-11ml，吡啶180-220μl于反应容器中，于室温搅拌反应5-7小时，通过硅胶薄层柱层析，控制反应终点；然后减压旋蒸，浓缩得到浓缩物，加入纯化水稀释，用冰醋酸调pH为4.5-5.5，析出白色固体，抽滤并鼓风干燥白色固体，得结构式a所示产物。
具体来说，挥发性有机溶剂可选为水溶性的非醇类、非胺类有机溶剂均为可选的；通过硅胶薄层柱层析主要是收集原料点(Rf＝0.5)的下面Rf＝0.3的层析物。
在上述结构式a的地塞米松人工半抗原的制备方法中，所述的挥发性有机溶剂为体积比为1:1的乙腈、四氢呋喃混合物。
同时，本发明还提供上述结构式b的地塞米松人工半抗原的制备方法，所述的方法具体为：以地塞米松反应物，在碘化钾存在的条件下于DMF中反应，然后加入4-胺基丁酸反应，反应结束后用水稀释，调节pH值使结构式b所示的产物析出，收集即可。
在上述结构式b的地塞米松人工半抗原的制备方法中，所述的方法为称量450-550mg地塞米松，1.8-2.2g碳酸钾,4-6mg碘化钾；量取DMF9-11ml；于反应容器中，于室温搅拌反应0.4-0.6小时，然后加入9-11ml含170-190mg4-胺基丁酸的水溶液，于48-52℃反应11-13小时，硅胶薄层柱层析，控制反应终点，加水50ml，用冰醋酸调pH为5.8-6.2，析出白色固体，抽滤，鼓风干燥，得结构式b所示的产物。
与现有技术相比，本发明提供的技术方案有以下优点：
本发明的结构式a和结构式b的地塞米松半抗原的优点为：结构a，充分暴露了地塞米松分子中电子云密度大的部分，作为决定簇；结构b，从地塞米松的另一点位接上连接臂，作为包被原，与抗体的亲和力，较地塞米松与抗体的亲和力低，从而产生抑制。2.制备半抗原的工艺较简单，避免了除去高沸点的有机溶剂。
本发明的结构式a的制备方法的优势在于：采用低沸点的有机溶剂作为反应连续相，可以通过减压旋转蒸发除去有机溶剂，通过硅胶薄层柱层析除去反应物，这样可以较为轻松和节能的进行反应和产物收集，并且本发明采用调节pH值的方式使产物析出，其产物收集方法更为简单，产物纯度更高。
本发明的结构式b的制备方法优势在于：本发明采用调节pH值的方式使产物析出，其产物收集方法更为简单，产物纯度更高。
附图说明
图1是地塞米松免疫原紫外光谱扫描结果；
图2是地塞米松包被原紫外光谱扫描结果；
图3是多克隆抗体在不同浓度标准品溶液的吸光值。
具体实施例
下面结合具体实施方式，对本发明的权利要求做进一步的详细说明，但不构成对本发明的任何限制，任何在本发明权利要求范围内所做的有限次的修改，仍在本发明的权利要求保护范围内。
实施例1
称量500mg地塞米松，160mg丁二酸酐；量取乙腈、四氢呋喃(体积比1:1)混合液10ml；吡啶200μl于100ml单口圆底烧瓶中，磁力搅拌。于室温反应6小时。硅胶薄层柱层析，控制反应终点。减压旋蒸，浓缩。加入50ml纯化水，用冰醋酸调pH为5，析出白色固体，抽滤，鼓风干燥，得320mg产物即为结构式a。
实施例2
称量450mg地塞米松，170mg丁二酸酐；量取乙腈、四氢呋喃(体积比1:1)混合液11ml；吡啶220μl于100ml单口圆底烧瓶中，磁力搅拌。于室温反应5小时。硅胶薄层柱层析，控制反应终点。减压旋蒸，浓缩。加入45ml纯化水，用冰醋酸调pH为4.5，析出白色固体，抽滤，鼓风干燥，得288mg产物即为结构式a。
实施例3
称量550mg地塞米松，150mg丁二酸酐；量取乙腈、四氢呋喃(体积比1:1)混合液9ml；吡啶180μl于100ml单口圆底烧瓶中，磁力搅拌。于室温反应5小时。硅胶薄层柱层析，控制反应终点。减压旋蒸，浓缩。加入55ml纯化水，用冰醋酸调pH为5.5，析出白色固体，抽滤，鼓风干燥，得352mg产物即为结构式a。
实施例4
称量500mg地塞米松，2g碳酸钾,碘化钾5mg；量取DMF10ml；于100ml单口圆底烧瓶中，磁力搅拌。于室温反应0.5小时。加入10ml含180mg 4-胺基丁酸的水溶液，于50℃反应12小时，硅胶薄层柱层析，控制反应终点。加水50ml，用冰醋酸调pH为6左右，析出白色固体，抽滤，鼓风干燥，得425mg,即为结构式b。
实施例5
称量450mg地塞米松，1.8g碳酸钾,碘化钾4mg；量取DMF9ml；于100ml单口圆底烧瓶中，磁力搅拌。于室温反应0.4小时。加入10ml含190mg 4-胺基丁酸的水溶液，于48℃反应12小时，硅胶薄层柱层析，控制反应终点。加水50ml，用冰醋酸调pH为6.2左右，析出白色固体，抽滤，鼓风干燥，得383mg,即为结构式b。
实施例6
称量550mg地塞米松，2.2g碳酸钾,碘化钾6mg；量取DMF11ml；于100ml单口圆底烧瓶中，磁力搅拌。于室温反应0.6小时。加入10ml含170mg 4-胺基丁酸的水溶液，于52℃反应13小时，硅胶薄层柱层析，控制反应终点。加水50ml，用冰醋酸调pH为5.8左右，析出白色固体，抽滤，鼓风干燥，得467mg,即为结构式b。
为了证明本发明提供的地塞米松人工半抗原，下面给出采用发明结构式a或b制备的地塞米松人工抗原：
1、地塞米松免疫原的制备
取结构式a所示化合物50mg溶于1ml N,N-二甲基甲酰胺中，加入12mg N-羟基琥珀酰亚胺和20mg 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐，室温下磁力搅拌2h，得到溶液A。
将94mg鲎血清白蛋白加入8ml去离子水中，室温下磁力搅拌，充分溶解，即为溶液B。
取溶液A,330微升缓慢滴加至溶液B中，室温缓慢搅拌8h,后入透析袋，在0.01M的PBS中，4℃透析72h(中间换水5次)，然后于4℃条件下，4000rmp离心10min，取上清，即地塞米松免疫原溶液，分装于安培瓶中，-20℃保存。紫外光谱扫描结果见图1。
2、地塞米松包被原的制备
取结构式b所示化合物50mg溶于1ml N,N-二甲基甲酰胺中，加入12mg N-羟基琥珀酰亚胺和20mg 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐，室温下磁力搅拌2h，得到溶液C。
将66mg牛血清白蛋白加入8ml去离子水中，室温下磁力搅拌，充分溶解，即为溶液D。
取溶液C，330微升缓慢滴加至溶液D中，室温缓慢搅拌8h,后入透析袋，在0.01M的PBS中，4℃透析72h(中间换水5次)，然后于4℃条件下，4000rmp离心10min，取上清，即地塞米松包被原溶液，分装于安培瓶中，-20℃保存，紫外光谱扫描结果见图2。
3、动物免疫
一、动物免疫
新西兰大白兔：购于广东省实验动物中心。
将新西兰大白兔用地塞米松免疫原进行免疫，免疫方式为脊柱两侧背部皮下多点免疫，免疫间隔为两周，每次免疫剂量为1mg/只，从第二次免疫开始，每次免疫后第七天，耳缘静脉采血检测血清效价及抑制，共免疫八次，八免后心脏采全血，离心收集血清即为多克隆抗体。将收集到的血清放于-20℃保存。
二、多克隆抗体的鉴定
将步骤一得到的多克隆抗体分别进行如下鉴定：
1、抗体效价的测定
(1)包被：用地塞米松包被原进行包被，采用pH 9.6的碳酸盐缓冲液进行包被，100μL/孔，包被浓度为5μg/mL；4℃过夜包被。
(2)洗板并封闭：PBST洗板一次，拍干后200μL/孔封闭液37℃封闭两小时。
(3)弃去封闭液，拍干；
(4)每孔加入50μL抗体稀释液(采用PBS进行梯度稀释)，及50μL辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔二抗，室温孵育30min。
(5)PBST洗板三次；
(6)加入TMB显色液，避光显色15min。
(7)每孔加入50μL2moL/L硫酸终止反应；OD450及OD630双波长读数。
以OD值达到1.0左右时判定为阳性。地塞米松多克隆抗体效价为1：5000。
3、多克隆抗体灵敏度的测定
(1)包被：用地塞米松包被原进行包被，采用pH 9.6的碳酸盐缓冲液进行包被，100μL/孔，包被浓度为5μg/mL；4℃过夜包被。
(2)洗板并封闭：PBST洗板一次，拍干后200μL/孔封闭液37℃封闭两小时。
(3)弃去封闭液，拍干；
(4)每孔加入50μL不同浓度的地塞米松标准品溶液(由地塞米松和PBS缓冲液组成)，地塞米松的浓度分别为0.1μg/L、0.3μg/L、0.9μg/L、2.7μg/L、8.1μg/L；将只加入PBS缓冲液的孔作为对照空；每个浓度设置3个重复孔。
(5)每孔加入50μL步骤一得到的多血清；
(6)每孔加入50μL辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔二抗，室温孵育30min。
(7)PBST洗板三次；
(8)加入TMB显色液，避光显色15min。
(9)每孔加入50μL2moL/L硫酸终止反应；OD450及OD630双波长读数。
将采用不同浓度标准品溶液得到的吸光值(三个重复孔的平均值)除以对照孔的吸光值(平均值)再乘以100作为纵坐标，以各个标准品溶液中的地塞米松浓度(μg/L)的自然对数值为横坐标绘制曲线图，见图3。
对照图，得到纵坐标值等于50％对应的地塞米松浓度(μg/L)，即为IC50值。IC50为1ppb。
4、交叉反应率的测定
(1)包被：用地塞米松包被原进行包被，采用pH 9.6的碳酸盐缓冲液进行包被，100μL/孔，包被浓度为5μg/mL；4℃过夜包被。
(2)洗板并封闭：PBST洗板一次，拍干后200μL/孔封闭液37℃封闭两小时。
(3)弃去封闭液，拍干；
(4)每孔加入50μL不同浓度的结构类似物标准品溶液(由结构类似物和PBS缓冲液组成)，结构类似物的浓度分别为0.1μg/L、0.3μg/L、0.9μg/L、2.7μg/L、8.1μg/L；将只加入PBS缓冲液的孔作为对照空；每个浓度设置3个重复孔。
结构类似物为：乙酸地塞米松、醋酸泼尼松、氢化可的松、氯地米松。
乙酸地塞米松：中检所产品，货号150363。醋酸泼尼松：中检所产品，货号150652。氢化可的松:中检所产品，货号150861。氯地米松：中检所产品，货号150986。
(5)每孔加入50μL步骤一得到的多克隆抗体，
(6)每孔加入50μL辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔二抗，室温孵育30min。
(7)PBST洗板三次；
(8)加入TMB显色液，避光显色15min。
(9)每孔加入50μL2moL/L硫酸终止反应；OD450及OD630双波长读数。
将采用各个浓度的结构类似物得到的吸光值(三个复孔的平均值)除以对照孔的吸光值(平均值)再乘以100作为纵坐标，以各个标准品溶液中的结构类似物浓度(μg/L)的自然对数值为横坐标绘制曲线图3。对照曲线图，得到纵坐标值等于50％对应的结构类似物浓度(μg/L)，即为IC50值
用以下公式计算多克隆抗体对其它结构类似物的交叉反应率。
结果见表1。
表一多克隆抗体特异性
结果表明本发明制备的地塞米松多克隆抗体与肾上腺皮质激素类药物的醋酸地塞米松及氢化可的松有一定的交叉反应，与其它结构类似物无交叉反应。
5、稳定性
将步骤三得到的多克隆抗体溶液-20℃放置，不同时间取样，用PBS缓冲液稀释后检测效价，具体步骤同步骤2抗体效价的测定。
OD450及OD630值见表2。结果表明，在-20℃保存16周多克隆抗体效价不变。
表2多克隆抗体的稳定性
6、非竞争酶免疫法测定亲和常数
(1)用地塞米松包被原进行包被酶标板
将地塞米松包被原用碳酸盐缓冲液进行包被，100μL/孔；分别设置以下包被浓度：10μg/mL、5μg/mL、2.5μg/mL、1.25μg/mL。4℃过夜包被。
(2)洗板并封闭
(3)每孔加入100μL多克隆抗体溶液的稀释液(用PBS缓冲液进行稀释)；稀释液中的蛋白浓度分别为2.5、1.25、0.625、0.3125、1.5625×10-1、7.8×10-2、3.9×10-2、1.95×10-2、9.75×10-3、4.88×10-3mg/L；室温孵育1h。
(4)洗板，拍干。
(5)每孔加入100μL辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG，室温孵育1h。
(6)洗板拍干。
(7)加入TMB显色液，避光显色15min。
(8)每孔加入100μL2mol/L硫酸终止反应；读OD450及OD630双波长值。
以多克隆抗体中的蛋白浓度(mol/L)的自然对数值为横坐标，以其对应的吸光值为纵坐标制作标准曲线。每个抗原包被浓度得到1条S型曲线，共得到4条S型曲线。找出S型曲线的顶部，对应的OD450及OD630双波长值设为ODMAX。分别找出各条曲线50％ODMAX对应的抗体浓度。将4个浓度两两一组，根据公式计算多克隆抗体的亲和常数
Ka＝(n-1)/2(n[Ab]t1-[Ab]t2)
公式中，n为每组中两个包被浓度的倍数，[Ab]t1、[Ab]t2分别为每组中两个50％ODMAX对应的抗体浓度(mol/L)。最终取6个Ka值的平均值得出多克隆抗体的亲和常数为4.18×109M-1。。
以上所述的仅为本发明的较佳实施例，凡在本发明的精神和原则范围内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (7)
1.一种地塞米松人工半抗原，其特征在于，所述的地塞米松人工半抗原为以下结构式a：
2.一种地塞米松人工半抗原，其特征在于，所述的地塞米松人工半抗原为以下结构式b：
3.根据权利要求1所述的地塞米松人工半抗原的制备方法，其特征在于，所述的方法具体为：以地塞米松和丁二酸酐为反应物，在吡啶存在的条件下于挥发性有机溶剂中反应，反应结束后除去有机溶剂并加用水稀释浓缩物，调节pH值使结构式a所示的产物析出，收集即可。
4.根据权利要求1所述的地塞米松人工半抗原的制备方法，其特征在于，所述的方法具体为：称量450-550mg地塞米松，150-170mg丁二酸酐；量取挥发性有机溶剂9-11ml，吡啶180-220μl于反应容器中，于室温搅拌反应5-7小时，通过硅胶薄层柱层析，控制反应终点；然后减压旋蒸，浓缩得到浓缩物，加入纯化水稀释，用冰醋酸调pH为4.5-5.5，析出白色固体，抽滤并鼓风干燥白色固体，得结构式a所示产物。
5.根据权利要求1所述的地塞米松人工半抗原的制备方法，其特征在于，所述的挥发性有机溶剂为体积比为1:1的乙腈、四氢呋喃混合物。
6.根据权利要求2所述的地塞米松人工半抗原的制备方法，其特征在于，所述的方法具体为：以地塞米松反应物，在碘化钾存在的条件下于DMF中反应，然后加入4-胺基丁酸反应，反应结束后用水稀释，调节pH值使结构式b所示的产物析出，收集即可。
7.根据权利要求6所述的地塞米松人工半抗原的制备方法，其特征在于，所述的方法为称量450-550mg地塞米松，1.8-2.2g碳酸钾,4-6mg碘化钾；量取DMF9-11ml；于反应容器中，于室温搅拌反应0.4-0.6小时，然后加入9-11ml含170-190mg 4-胺基丁酸的水溶液，于48-52℃反应11-13小时，硅胶薄层柱层析，控制反应终点，加水50ml，用冰醋酸调pH为5.8-6.2，析出白色固体，抽滤，鼓风干燥，得结构式b所示的产物。
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