CN105807056A - 检测高效氯氟氰菊酯残留的试纸卡 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种检测高效氯氟氰菊酯残留的试纸及应用。试纸包括样品吸收垫(1)、结合物释放垫(2)、反应膜(3)、吸水垫(4)和底板(7)，所述反应膜上具有包被有高效氯氟氰菊酯半抗原‑载体蛋白偶联物的检测线(5)和包被有羊抗鼠抗抗体的质控线(6)，所述结合物释放垫(2)包被有高效氯氟氰菊酯单克隆抗体‑胶体金标记物。本发明还提供了一种应用上述试纸检测高效氯氟氰菊酯残留的方法。本发明所提供的试纸，具有操作简单、灵敏度高、检测速度快、成本低等特点，适合大量样本的筛查和现场监控。

Description

检测高效氯氟氰菊酯残留的试纸卡

技术领域

本发明涉及一种检测高效氯氟氰菊酯残留的试纸卡，具体是一种检测高效氯氟氰菊酯残留的胶体金试纸卡。

背景技术

高效氯氟氰菊酯，英文名Lambda-Cyhalothrin，又称为爱克宁、λ-三氟氯氰菊酯，属拟除虫菊酯类，具有触杀作用的卫生杀虫剂，化学名称：α-氰基-3-苯氧苄基-3-(2-氯-3,3,3-三氯氟-1-丙烯基)-2,2-二甲基环丙烷羧酸酯(Z)-(1R,3R),S-酯及(Z),(1S,3S),R-酯的1:1混合物。具有触杀作用，是对环境卫生害虫极为有效的一种广效杀虫剂，具有击倒速度快、击倒力强，用药量少等优点。能消灭传播疾病的媒介害虫和防治各种卫生害虫。拟除虫菊酯类被称为是杀虫剂农药的一个新突破，是杀虫剂历史上的第三个里程碑。在农业生产上，用途广泛。

对高效氯氟氰菊酯残留的检测，国家制定了严格的残留检测标准，如GB/T5009-2008《植物性食品中有机氯和拟除虫菊酯类农药多种残留的鉴定》、GB/T19649-2006《粮谷中475种农药及相关化学平残留量的测定》、SN/T1117-2008《进出口食品中多种菊酯类农药残留量测定方法气相色谱法》，现行的残留检测方法是气相色谱法和高效液相色谱法，检测方法依赖于大型仪器和专业技术检测人员，检测时间长，检测过程中需要使用有机溶剂，会造成环境污染。寻求一种快速、有效、准确的检测方法和手段，势在必行。胶体金试纸卡具有灵敏度好、精确度高、检测成本低、操作简单、检测时间短、可同时检测多数样品，是理想的快速筛选手段。

高效氯氟氰菊酯是农药小分子化合物，必须与大分子物质连接后才能刺激动物产生特异性抗体，故酶联免疫技术研究的关键是半抗原的分子设计、合成和人工抗原及抗体的制备。拟除虫菊酯农药半抗原设计与合成主要有如下方法：1）以拟除虫菊酯的酸或醇部分衍生化作为半抗原；2）改变拟除虫菊酯分子的活性基团作为半抗原。半抗原就是在无免疫原性的化合物母体结果上通过一定的化学方法连接一个具有一定碳链长度的间隔臂，间隔臂的另一端具有可与载体蛋白质共价偶联的活性基团（如羧基、氨基、羟基等）的小分子物质。半抗原的设计应考虑结构中尽量保留芳香环。

国内外对拟除虫菊酯类的研究较多且已有不少成果报道，如王利兵等人申请了发明专利《一种功夫菊酯半抗原的合成方法》（专利号：201110271124.X），该专利是以羟基苯丙酸作为原料，经过七步反应得到半抗原；中国农业大学许艇等人申请了发明专利《功夫菊酯残留的间接竞争酶联免疫吸附分析试剂盒》（专利号：200810101544.1），以羟基苯丙酸为原料，经六步反应，获得半抗原3-[(±)-(cis)-3-[(Z)-3-氯-4,4,4-三氟-1-乙基-2,2-二甲基]环丙基羰基氧]苯氧基]苯丙酸，上述两个技术方案，存在反应步骤多，转化率相关较低，得到的副产物较多，后续纯化工作量大的缺点。浙江大学程敬丽等人，申请了发明专利《一种高特异性拟除虫菊酯类半抗原化合物》（专利号：200810162533.4），以氯氰菊酯为原料，经调节pH至酸性、提取、水洗和纯化反应，得到半抗原化合物，（RS）-α-氰基-3-苯氧基苯基（RS）-顺,反-2,2-二甲基-3-羧基环丙烷碳酸酯，该专利是针对拟除虫菊酯类设计的半抗原合成路线，而不是针对单一菊酯产品的半抗原合成。福建出入境检验检疫局检验检疫技术中心，获得了发明专利《拟除虫菊酯类农药残留的快速检测方法》（专利号：200410155382.1）的授权，该专利利用强碱试剂将检测物中的拟除虫菊酯农药残留分解成含氰化合物，该发明使用强酸强碱试剂，且生成物为含氰化合物，有毒且对环境不友好。李志茹优秀硕士毕业论文，《拟除虫菊酯类农药通用抗体制备及高效氯氟氰菊酯免疫检测技术研究》，研究以拟除虫菊酯农药的中间体-间苯氧基苯甲酸为半抗原、菊酸为主要原料，获得多克隆通用抗体。现在的研究成果以半抗原合成技术方案居多，暂未见对高效氯氟氰菊酯胶体金检测试纸卡的报道。

针对目前现有技术方案的不足，本发明拟提供一种专门针对高效氯氟氰菊酯残留检测的试纸卡，具有经济、快速、特异性强的特点。

发明内容

本发明的目的是提供一种操作简单、成本低的高效氯氟氰菊酯残留检测胶体金试纸卡及其检测方法。

本发明所提供的检测高效氯氟氰菊酯残留的胶体金试纸卡，包括样品吸收垫、结合物释放垫、反应膜、吸水垫和PVC底板，所述反应膜上有包被有高效氯氟氰菊酯-载体蛋白偶联物构成的检测线和包被有羊抗鼠抗抗体构成的质控线，所述结合物释放垫包被有高效氯氟氰菊酯单克隆抗体-胶体金标记物。

上述反应膜上检测线处包被的高效氯氟氰菊酯-载体蛋白偶联物由高效氯氟氰菊酯半抗原与载体蛋白偶联得到；所述的高效氯氟氰菊酯单克隆抗体-胶体金标记物中的高效氯氟氰菊酯单克隆抗体由高效氯氟氰菊酯-载体蛋白偶联物作为免疫原免疫动物获得；所述的载体蛋白为牛血清白蛋白、鼠血清蛋白、兔血清蛋白、甲状腺蛋白、卵清蛋白、血蓝蛋白或人血清白蛋白；所述羊抗鼠抗抗体是将鼠源抗体免疫羊得到的。

本发明中包被原、免疫原、包被原、单克隆抗体的合成过程为：

1.半抗原合成及鉴定

分别称取0.42g（1mmol）高效氯氟氰菊酯、0.10g（1mmol）琥珀酸酐和0.05g三氯化铝。

1）将0.42g高效氯氟氰菊酯，溶解于经干燥后的二氯甲烷中，通入氮气进行保护，得到溶液I；

2）在溶液I中加入0.10g琥珀酸酐，常温下搅拌溶解；

3）加入0.01g三氯化铝固体进行催化反应；

4）TLC薄层板监测反应进行，直至没有原料或原料点很浅，停止反应；

5）硅胶柱净化，浓缩得到产物，即为半抗原，如式I所示，得到产物0.205g，收率48.8%，

（式I），

化学反应技术路线如下：

高效氯氟氰菊酯半抗原鉴定

取上述式I化合物，经核磁共振氢谱进行结构分析，如图4所示，发现图谱中11ppm(mg/L)附近的峰为羟基上的H，同时，经核磁共振碳谱进行结构分析，如图5所示，碳谱图中177ppm附近的峰为羧基上的C，说明高效氯氟氰菊酯半抗原合成成功。

2.免疫原的合成免疫原的合成

称取27.5mg半抗原溶解于4mLDMF溶液中，加入各60mgEDC和60mgNHS（溶于2mL水中）进行活化30分钟，加入到110-264mg载体蛋白BSA（溶于5mL含30%DMF水溶液中）进行偶联制备出免疫原，用0.02mol/LPB缓冲液透析3天，每天早晚更换透析液，以除去未反应的小分子物质，透析完成后，将得到的免疫原分装，于-20℃保存备用。

3.包被原的合成

称取27.5mg半抗原溶解于4mLDMF溶液中，加入各60mgEDC和60mgNHS（溶于2mL水中）进行活化30分钟，加入到100-240mg载体蛋白OVA（溶于5mL含30%DMF水溶液中）进行偶联制备出免疫原，用0.02mol/LPB缓冲液透析3天，每天早晚更换透析液，以除去未反应的小分子物质，透析完成后，将得到的免疫原分装，于-20℃保存备用。

4.高效氯氟氰菊酯抗原的鉴定

将载体蛋白、高效氯氟氰菊酯半抗原、高效氯氟氰菊酯半抗原-载体蛋白偶联物用pH7.4的PB配成0.5mg/ml的溶液，以0.01mol/LpH7.4PB调零，用紫外分光光度计在波长260~750nm范围内进行扫描，绘制载体蛋白、高效氯氟氰菊酯半抗原、高效氯氟氰菊酯半抗原-载体蛋白偶联物的吸收曲线，并计算其结合比。结果显示，三者出现不同的吸收曲线，证明高效氯氟氰菊酯半抗原与载体蛋白偶联成功，高效氯氟氰菊酯半抗原与牛血清蛋白的结合比为15-21:1，高效氯氟氰菊酯半抗原与卵清白蛋白的结合比为20-25:1。分子结构式如式II所示：

（式II）。

5.高效氯氟氰菊酯单克隆抗体制备

动物免疫：高效氯氟氰菊酯半抗原与载体蛋白偶联物免疫8-10周龄Balb/c小鼠。

细胞融合与克隆化：取免疫后的鼠脾细胞，与SP2/0骨髓瘤细胞在融合剂聚乙二醇(PEG)4000的作用下融合，筛选获得能稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株。

经筛选得到高效氯氟氰菊酯的单克隆杂交瘤细胞株。高效氯氟氰菊酯的单克隆杂交瘤细胞株可以无限量的产生高效氯氟氰菊酯特异性抗体，该抗体特异性是针对高效氯氟氰菊酯的，灵敏度达到1μg/L。

细胞冻存和复苏：将杂交瘤细胞用冻存液制成1×10⁹个/ml的细胞悬液，在液氮中长期保存。复苏时取出冻存管，立即放入37℃水浴中速融，离心去除冻存液后，移入培养瓶内培养。

本发明提供了一种制备上述胶体金试纸卡的方法，主要包括如下步骤：

(1)制备包被有高效氯氟氰菊酯单克隆抗体-胶体金标记物的结合物释放垫；

(2)制备具有包被有高效氯氟氰菊酯-载体蛋白偶联物构成的检测线和包被有羊抗鼠IgG构成的质控线的反应膜；

(3)将(1)和(2)制备好的结合物释放垫、反应膜与样本吸收垫、吸水垫和背衬组装成试纸卡。

具体的说，步骤包括：

1)制备获得高效氯氟氰菊酯半抗原；

2)将高效氯氟氰菊酯半抗原与载体蛋白偶联，制备高效氯氟氰菊酯包被原和免疫原；

3)用高效氯氟氰菊酯免疫原免疫小鼠，将小鼠脾细胞和小鼠骨髓瘤细胞通过融合、筛选，得到分泌高效氯氟氰菊酯单克隆抗体的杂交瘤细胞株；

4)提取小鼠IgG免疫健康山羊，得到羊抗鼠IgG抗体；

5)用柠檬酸三钠与氯金酸反应制备胶体金；

6)将制备的高效氯氟氰菊酯单克隆抗体加入到制备的胶体金中，得到高效氯氟氰菊酯单克隆抗体-胶体金标记物；

7)将结合物释放垫浸泡于含有牛血清白蛋白(牛血清白蛋白在缓冲液中的浓度为0.5％)和pH7.2，0.5mol/L磷酸盐缓冲液中浸湿1h，37℃烘3h备用，然后将高效氯氟氰菊酯单克隆抗体-胶体金标记物包被到结合物释放垫上；

8)将高效氯氟氰菊酯-卵清蛋白偶联物包被到反应膜上构成检测线，将羊抗鼠抗抗体包被在反应膜上构成质控线；

9)将样品吸收垫置于pH为7.2，含小牛血清2％，1％活性剂，0.02mol/L磷酸盐缓冲液浸泡2h，37℃下烘干2h后备用；

10)将上述样品吸收垫、结合物释放垫、反应膜、吸水垫依次按顺序黏贴在PVC底板上；结合物释放垫从起始端有1/3区域被样品吸收垫覆盖，结合物释放垫的末端与反应膜的始端连接，反应膜的末端与吸水垫的始端相连，样品吸收垫的始端与PVC底板的始端对齐，吸水垫的末端与PVC底板的末端对齐；所述反应膜上有检测区和质控区，检测区(T)线和质控区(C)线均为与所述试纸的长相垂直的条状带；检测区位于靠近结合物释放垫的末端的一侧；质控区位于远离结合物释放垫的末端的一侧；将试纸用机器切成3mm宽的小条，装在特制的塑料制卡中，形成试纸卡，2～8℃条件下保存12个月。

本发明还提供了一种应用上述胶体金试纸卡检测高效氯氟氰菊酯的方法，包括的步骤有：

(1)样品的前处理

称取1.0±0.05g样本至50ml聚苯乙烯离心管中；

加入3ml乙酸乙酯，用振荡器振荡至样本全部溶解，5000r室温（20-25℃）离心5min；

移取上清1ml至4ml洁净干燥聚苯乙烯离心管中，吹至近干后，加入1ml复溶工作液，用涡旋仪震荡1min得到涡旋液，静置。

加入180ul复溶工作液后，取20μl上述涡旋液用于分析。

(2)用胶体金试纸卡检测

用吸管吸取待检样品溶液垂直滴加3～4滴(约80μl)于加样孔，反应10min，根据示意图判定结果。

(3)分析检测结果

本发明将高效氯氟氰菊酯-载体蛋白偶联抗原固化于反应膜上检测线处，结合物释放垫上含有高效氯氟氰菊酯单克隆抗体-胶体金标记物，在层析过程中样品中残留的高效氯氟氰菊酯药物和反应膜上预包被的偶联抗原竞争胶体金标记的高效氯氟氰菊酯单克隆抗体，通过检测线是否显色判断样品中是否有高效氯氟氰菊酯药物的残留，当检测线(T线)和质控线(C线)都显色时为阴性，当检测线不显色，质控线显色时为阳性，如图7。

阴性(-)：T线和C线都显色，表示样品中高效氯氟氰菊酯浓度低于检测限，如图7(a)。

阳性(+)：T线无显色C线显色，表示样品中高效氯氟氰菊酯浓度高于检测限，如图7(b)。

无效：未出现C线，表明不正确的操作过程或试纸卡已变质失效，如图7(c)。在此情况下，应再次仔细阅读说明书，并用新的试纸卡重新测试。

本发明的胶体金试纸卡采用的样品前处理方法省时、简便，有效地降低了前处理工作量，整体地提高了检测效率，胶体金试纸卡具有特异性高、灵敏度高、操作简单、检测时间短等特点，能够对大批量样品进行定性筛查。

附图说明

图1高效氯氟氰菊酯半抗原结构图式I。

图2高效氯氟氰菊酯抗原结构图式II。

图3高效氯氟氰菊酯半抗原合成反应路线。

图4高效氯氟氰菊酯半抗原鉴定图（氢谱图）。

图5高效氯氟氰菊酯半抗原鉴定图（碳谱图）。

图6试纸剖面结构示意图。

图7试纸检测结果判定图。

具体实施方式

下面结合具体的实施例来进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明，而不用来限制本发明的范围。

实施例1高效氯氟氰菊酯胶体金检测试纸的制备

该试纸的制备方法主要包括以下几个步骤：

1）制备包被有高效氯氟氰菊酯单克隆抗体-胶体金标记物的结合物释放垫；

2）制备具有包被有高效氯氟氰菊酯半抗原-载体蛋白偶联物的检测线和包被有羊抗鼠抗抗体的质控线的反应膜；

3）将1）和2）制备好的结合物释放垫、反应膜与样品吸收垫、吸水垫和PVC底板组装成试纸。

下面分步详细叙述：

1、高效氯氟氰菊酯半抗原的制备

分别称取0.42g（1mmol）高效氯氟氰菊酯、0.10g（1mmol）琥珀酸酐和0.05g三氯化铝。

1）将0.42g高效氯氟氰菊酯，溶解于经干燥后的二氯甲烷中，通入氮气进行保护，得到溶液I；

2）在溶液I中加入0.10g琥珀酸酐，常温下搅拌溶解；

3）加入0.01g三氯化铝固体进行催化反应；

4）TLC薄层板监测反应进行，直至没有原料或原料点很浅，停止反应；

5）硅胶柱净化，浓缩得到产物，即为半抗原，如式II所示，得到产物0.205g，收率48.8%。

分别称取0.42g（1mmol）高效氯氟氰菊酯、0.10g（1mmol）琥珀酸酐和0.05g三氯化铝。

1）将0.42g高效氯氟氰菊酯，溶解于经干燥后的二氯甲烷中，通入氮气进行保护，得到溶液I；

2）在溶液I中加入0.10g琥珀酸酐，常温下搅拌溶解；

3）加入0.01g三氯化铝固体进行催化反应；

4）TLC薄层板监测反应进行，直至没有原料或原料点很浅，停止反应；

5）硅胶柱净化，浓缩得到产物，即为半抗原，得到产物0.205g，收率48.8%，反应合成技术路线如下：

2、免疫原制备——高效氯氟氰菊酯半抗原与牛血清白蛋白（BSA）偶联得到免疫原。

称取27.5mg高效氯氟氰菊酯半抗原溶解于4mLDMF溶液中，加入各60mgEDC和60mgNHS（溶于2mL水中）进行活化30分钟，加入到110-264mg载体蛋白BSA（溶于5mL含30%DMF水溶液中）进行偶联制备出免疫原，用0.02mol/LPB缓冲液透析3天，每天早晚更换透析液，以除去未反应的小分子物质，透析完成后，将得到的免疫原分装，于-20℃保存备用。

3、包被原的合成

称取27.5mg高效氯氟氰菊酯半抗原溶解于4mLDMF溶液中，加入各60mgEDC和60mgNHS（溶于2mL水中）进行活化30分钟，加入到100-240mg载体蛋白OVA（溶于5mL含30%DMF水溶液中）进行偶联制备出免疫原，用0.02mol/LPB缓冲液透析3天，每天早晚更换透析液，以除去未反应的小分子物质，透析完成后，将得到的免疫原分装，于-20℃保存备用。

4、高效氯氟氰菊酯单克隆抗体的制备方法

动物免疫：高效氯氟氰菊酯半抗原与载体蛋白偶联物免疫8-10周龄Balb/c小鼠。

细胞融合与克隆化：取免疫后的鼠脾细胞，与SP2/0骨髓瘤细胞在融合剂聚乙二醇(PEG)4000的作用下融合，筛选获得能稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株。

经筛选得到高效氯氟氰菊酯的单克隆杂交瘤细胞株。高效氯氟氰菊酯的单克隆杂交瘤细胞株可以无限量的产生高效氯氟氰菊酯特异性抗体，该抗体特异性是针对高效氯氟氰菊酯的，灵敏度达到1μg/L。

细胞冻存和复苏：将杂交瘤细胞用冻存液制成1×10⁶个/ml的细胞悬液，在液氮中长期保存。复苏时取出冻存管，立即放入37℃水浴中速融，离心去除冻存液后，移入培养瓶内培养。

单克隆抗体的生产与纯化：将Balb/c小鼠腹腔注入灭菌石蜡油0.5ml/只，7天后腹腔注射稳定的单克隆杂交瘤细胞株5×10⁵个/只，7天后采集腹水。用辛酸-饱和硫酸铵法进行腹水纯化，-20℃保存。

5、羊抗鼠抗抗体的制备

以羊作为免疫动物，以鼠源抗体为免疫原对无病原体羊进行免疫，得到羊抗鼠抗抗体。

6、单克隆抗体-胶体金标记物的制备

（1）胶体金的制备

用双蒸去离子水将1%氯金酸稀释成0.01%（质量百分含量），取100ml置于锥形瓶中，用恒温电磁搅拌器加热至沸腾，在持续高温、持续搅拌下加入2.5ml1%柠檬酸三钠，继续匀速搅拌加热至溶液呈透亮的红色时停止，冷却至室温后用去离子水恢复到原体积，4℃保存。制备好的胶体金外观纯净、透亮、无沉淀和漂浮物。

（2）金标抗体的制备

在磁力搅拌下，用0.2mol/L碳酸钾溶液调胶体金的pH值至7.0，按每毫升胶体金溶液中加入20-50ug抗体的标准向胶体金溶液中加入高效氯氟氰菊酯抗体，继续搅拌混匀30min，加入10%BSA，使其在胶体金溶液中的终浓度为1%（体积百分含量），静置10min。12000r/min、4℃离心40min，弃上清液，沉淀用复溶缓冲液洗涤两次，用体积为初始胶体金体积1/10的复溶缓冲液将沉淀重悬，置4℃备用。

复溶缓冲液：含牛血清白蛋白（BSA）0.1%-0.3%（体积百分含量）、吐温-800.05%-0.2%（质量百分含量）、pH7.2的0.02mol/L磷酸盐缓冲液。

7、结合物释放垫的制备

将结合物释放垫浸泡于含有牛血清白蛋白（牛血清白蛋白在缓冲液中的浓度为0.5%）和pH7.20.5mol/L磷酸盐缓冲液中，均匀浸湿1h，37℃烘3h备用。用百道公司生产ZX1000型喷膜仪，将制备好的高效氯氟氰菊酯单克隆抗体-胶体金标记物均匀包被在结合物释放垫上，每1cm结合物释放垫包被0.01ml高效氯氟氰菊酯单克隆抗体-胶体金标记物后，置于37℃环境中（湿度＜20%）60min后取出，密封置于干燥环境（湿度＜20%）中保存备用。

8、反应膜的制备

将高效氯氟氰菊酯半抗原-牛血清蛋白偶联物包被到反应膜上构成检测线（T线），将羊抗鼠抗抗体包被在反应膜上构成质控线（C线）。

包被过程：用磷酸缓冲液将高效氯氟氰菊酯半抗原-牛血清蛋白偶联物稀释到10mg/ml，用百道公司生产ZX1000型点膜仪，将其包被于硝酸纤维素膜上的检测线（T线），包被量为1.0ug/cm²；用0.01mol/L、pH7.4的磷酸盐缓冲液将兔抗羊抗抗体稀释到200ug/ml，用点膜仪将其包被于硝酸纤维素膜上的质控线（C线），包被量为1.0ug/cm²。将包被好的反应膜置于37℃条件下干燥2h，备用。

9、样品吸收垫的制备

将样品吸收垫置于含0.5%牛血清白蛋白（体积百分含量）、pH7.20.1mol/L磷酸盐缓冲液中浸泡2h，37℃烘2h备用。

10、试纸的组装

将样品吸收垫、结合物释放垫、反应膜、吸水垫依次按顺序粘贴在PVC底板上；结合物释放垫从起始端有1/3区域被样品吸收垫覆盖，结合物释放垫的末端与反应膜的始端连接，反应膜的末端与吸水垫的始端相连，样品吸收垫的始端与PVC底板的始端对齐，吸水垫的末端与PVC底板的末端对齐；所述反应膜上有检测线和质控线，检测线（T线）和质控线（C线）均为与所述试纸的长相垂直的条状带；检测线位于靠近结合物释放垫的末端的一侧；质控线位于远离结合物释放垫的末端的一侧；将试纸用机器切成3mm宽的小条，装在特制的塑料制卡中，形成试纸卡，4-30℃条件下可保存12个月。

实施例2样品中高效氯氟氰菊酯残留的检测

1、样品的前处理

新鲜烟叶样本前处理方法：

（1）检测前将样本剪碎成小于1cm的碎片；

（2）称取1.0±0.05g剁碎的样本，放入5ml甲醇至液面全部浸满；

（3）盖上盖子，振荡1min；

（4）静置后移取0.1ml上清液加入到900ul0.1MPBS中混匀。

干烟叶样本前处理方法：

（1）检测前将样本粉碎；

（2）称取0.5±0.05g粉碎的样本，加入5ml甲醇；

（3）盖上盖子，振荡1min；

（4）静置后移取0.1ml上清液加入到900ul0.1MPBS中混匀。

2、用试纸进行检测

用吸管吸取待检样品溶液垂直滴加2-3滴于加样孔，液体流动时开始计时，反应10min，判定结果，其他时间判定无效。

3、分析检测结果

阴性（-）：T线和C线都显色，表示样品中高效氯氟氰菊酯药物浓度低于检测限，如图7（a）。

阳性（+）：T线无显色C线显色，表示样品中高效氯氟氰菊酯药物浓度等于或高于检测限，如图7（b）。

无效：未出现C线，表明不正确的操作过程或试纸已变质失效，如图7（c）。在此情况下，应再次仔细阅读说明书，并用新的试纸卡重新测试。

实施例3样品检测实例

1、检测限试验

取空白干烟草样本，在其中分别添加高效氯氟氰菊酯至终浓度为0.1、0.5、1、1.5、3mg/kg，取试纸进行检测，每个样本重复测定三次。

用试纸检测干烟草样本时，当其中高效氯氟氰菊酯添加浓度为0.1、0.5mg/kg时，试纸上显示出肉眼可见的两条红色线条，成阴性；当其中高效氯氟氰菊酯添加浓度为1、1.5、3mg/kg时，试纸质控线显示，但检测线不显示，成阳性；表明本试纸对干烟草样本中，高效氯氟氰菊酯的检测线为1.0mg/kg。

取新鲜烟草样本，在其中分别添加高效氯氟氰菊酯至终浓度为0.1、0.5、1、1.5、3mg/kg，取试纸进行检测，每个样本重复测定三次。

用试纸检测新鲜烟草样本时，当其中高效氯氟氰菊酯添加浓度为0.1、0.5mg/kg时，试纸上显示出肉眼可见的两条红色线条，成阴性；当其中高效氯氟氰菊酯添加浓度为1、1.5、3mg/kg时，试纸质控线显示，但检测线不显示，成阳性；表明本试纸对新鲜烟草中，高效氯氟氰菊酯的检测线为1mg/kg。

2、假阳性率、假阴性率试验

取已知高效氯氟氰菊酯含量大于1.0mg/kg的干烟草阳性样本20份和含量小于1.0mg/kg干烟草阴性样本20份；已知高效氯氟氰菊酯含量大于1.0mg/kg的新鲜烟草阳性样本20份和含量小于1.0mg/kg新鲜烟草阴性样本20份用三批试纸进行检测，计算其阴阳性率。结果见表1、表2。

表1检测阳性样本结果

表2检测阴性样本结果

结果表明：用3个批次生产的试纸检测阳性样本时，结果全为阳性，可知阳性样本符合率为100%，假阴性率为0；检测20份阴性样本时，结果全为阴性，可知阴性符合率为100%。说明本发明的检测高效氯氟氰菊酯残留的胶体金试纸可以对烟草中高效氯氟氰菊酯的残留进行快速检测。

3、特异性试验

特异性常用交叉反应率表示，是指抗体与结构不同的抗原决定簇发生结合的能力。将常检的多菌灵、三唑醇、三唑酮、甲霜灵100ug/L的样品，用高效氯氟氰菊酯胶体金试纸进行检测。结果显示，用该试纸检测多菌灵、三唑醇、三唑酮、甲霜灵100ug/L时，试纸质控线和检测线均显色，呈现阴性，说明本试纸对这些药物无交叉反应。

Claims (5)

1.一种检测高效氯氟氰菊酯残留的胶体金试纸卡，包括样品吸收垫、结合物释放垫、反应膜、吸水垫和PVC底板，其特征在于所述反应膜上有包被有高效氯氟氰菊酯-载体蛋白偶联物构成的检测线和包被有羊抗鼠抗抗体构成的质控线，所述结合物释放垫包被有高效氯氟氰菊酯单克隆抗体-胶体金标记物，所述高效氯氟氰菊酯-载体蛋白偶联物由高效氯氟氰菊酯半抗原与载体蛋白偶联得到，所述高效氯氟氰菊酯半抗原的制备方法如下：

（1）以高效氯氟氰菊酯为原料，溶于经干燥后的二氯甲烷中，通氮气保护，加入琥珀酸酐常温搅拌溶解，加入三氯化铝固体进行催化反应，用TLC薄层板监测反应进行，直至没有原料或原料点很浅，停止反应，硅胶柱净化，浓缩得产物，即为式I所示化合物；高效氯氟氰菊酯与琥珀酸酐的反应摩尔比为1：（1-3），优选为1:2，催化剂与高效氯氟氰菊酯质量比为1%-5%;

（2）称取适量高效氯氟氰菊酯半抗原溶解于DMF溶液中，加入EDC和NHS进行活化30分钟，得到溶液I；将载体蛋白溶于含30%DMF水溶液中,得到溶液II;将溶液I加入到溶液II中，进行偶联，得到溶液III;用0.02mol/LPB缓冲液透析溶液III，获得高效氯氟氰菊酯抗原。

2.如权利要求1所述的胶体金试纸卡，其特征在于所述的高效氯氟氰菊酯单克隆抗体-胶体金标记物中的高效氯氟氰菊酯单克隆抗体由高效氯氟氰菊酯半抗原-载体蛋白偶联物作为免疫原免疫动物获得；所述的载体蛋白为牛血清白蛋白、鼠血清蛋白、兔血清蛋白、甲状腺蛋白、卵清蛋白、血蓝蛋白或人血清白蛋白；所述羊抗鼠抗抗体是将鼠源抗体免疫羊得到的。

3.如权利要求1所述的胶体金试纸卡，其特征在于所述的结合物释放垫的部分区域被覆盖于样品吸收垫之下。

4.一种权利要求1～3任一项所述的胶体金试纸卡的制备方法，主要包括如下步骤：

(1)制备包被有高效氯氟氰菊酯单克隆抗体-胶体金标记物的结合物释放垫；

(2)制备具有包被有高效氯氟氰菊酯-载体蛋白偶联物构成的检测线和包被有羊抗鼠IgG构成的质控线的反应膜；

(3)将(1)和(2)制备好的结合物释放垫、反应膜与样本吸收垫、吸水垫和PVC底板组装成试纸卡。

5.一种应用权利要求1～4任一项所述的高效氯氟氰菊酯胶体金试纸卡检测高效氯氟氰菊酯残留的方法，其特征在于包括如下步骤：

(1)样品的前处理；

(2)用胶体金试纸卡进行检测；

(3)分析检测结果。