CN102286103A - 莱克多巴胺单克隆抗体的制备方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种特异性单克隆抗体的制备方法及其应用，涉及检测技术领域，通过对盐酸莱克多巴胺结构改造，合成莱克多巴胺人工抗原，制备特异性莱克多巴胺单克隆抗体，并通过制备的莱克多巴胺单克隆抗体为核心试剂制备检测莱克多巴胺的胶体金免疫试纸条。本发明制备的莱克多巴胺抗体是高特异性的单克隆抗体，具有特异性强、灵敏度高、准确度高等特点；本发明利用该高特异性单克隆抗体为基础制备的试纸条，用于检测莱克多巴胺残留，具有简便、快速、灵敏、准确、廉价的特点，其应用具有广阔前景。

Description

莱克多巴胺单克隆抗体的制备方法及其应用

技术领域：

本发明涉及一种莱克多巴胺的特异性单克隆抗体的制备，并用于对饲料及动物性食品中克伦特罗的快速测定，属于检测技术领域。

背景技术：

莱克多巴胺(Ractopamine，Rac)属β-肾上腺素受体激动剂类(简称β-激动剂)药物，具有促进动物肌肉生长，减少胴体脂肪含量，改善饲料利用率，显著提高瘦肉率的作用，是最为实用的β-激动剂之一。然而莱克多巴胺在动物体内的蓄积性残留会对食用者的安全构成潜在威胁，常引起食用者发生心悸、肌肉震颤、恶心呕吐、发热寒颤等临床症状，特别对心脏病、糖尿病、高血压等病人危害更大。早在1986年欧洲就颁布禁用β-激动剂的禁令。我国农业部与质检总局也全面禁止该类物质的使用。此外，莱克多巴胺可增强运动员肌肉能力，提高运动成绩，国际奥委会也已将其列为禁用药物。

近年来由于加大了打击非法使用盐酸克伦特罗(“瘦肉精”)的力度，在经济利益的驱使下，属于同一类药物的莱克多巴胺的非法添加日趋严重。为了打击非法使用违禁药物，除了健全法律法规，建立有效的监督管理体系外，还需要健全相应的检测方法。申请人通过检索发现，目前国内报道所制备的莱克多巴胺单克隆抗体的特异性不强，在以单抗为核心所制备的胶体金试纸条的应用中，未见对不同检测样品的处理方法及最低检测浓度的报道，且目前市场上的试纸条假阳性率偏高。因此莱克多巴胺的检测远远不能满足快速、廉价、稳定和准确等方面的要求。

发明内容：

本发明的目的在于提供一种莱克多巴胺单克隆抗体的制备方法及其在检测莱克多巴胺上的应用。

为实现本发明的目的，技术方案通过如下方式实现：

一种莱克多巴胺单克隆抗体的制备方法及其应用，其特征在于：对盐酸莱克多巴胺进行结构改造，使其含有羧基，再将其与匙孔蓝蛋白进行偶联，以该偶联物为免疫原免疫小鼠，通过细胞融合技术获得杂交瘤细胞，诱生腹水制备出莱克多巴胺单克隆抗体。

所述偶联物是利用混合酸酐法将结构改造后的盐酸莱克多巴胺与匙孔蓝蛋白进行偶联的。

一种莱克多巴胺单克隆抗体的应用，其特征在于：以莱克多巴胺单克隆抗体为核心试剂制备检测莱克多巴胺的胶体金免疫试纸条。

所述胶体金免疫试纸条由PVC底板、样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜和吸水垫几部分组成，其中金标垫包被有莱克多巴胺的胶体金标记物，硝酸纤维素膜上包被有莱克多巴胺-载体蛋白偶联物构成的检测线(T)和包被羊抗鼠IgG构成的质控线(C)。

1.人工免疫抗原和包被抗原的制备

通过对盐酸莱克多巴胺结构改造，使其含有羧基，再应用混合酸酐法，将其分别与匙孔蓝蛋白(KLH)、鸡血清白蛋白(OVA)进行偶联，合成免疫原和包被原。

2.莱克多巴胺单克隆抗体制备及其鉴定

(1)动物免疫程序：将500μg·ml^-1Rac-KLH的PBS溶液(0.22μm滤膜过滤除菌)与等体积弗氏完全佐剂混合成乳剂，皮下分点注射健康6周龄雌性BALB/C小鼠，每只0.4mL(含Rac-KLH 100μg)，首免3周后同样剂量加强免疫，佐剂为弗氏不完全佐剂，共免3次，每次间隔2周，间接ELISA法监测血清抗体效价，选择效价最高的小鼠进行细胞融合，融合前三天以Rac-KLH对小鼠进行加强免疫注射。

(2)细胞融合与克隆化：取经过加强免疫的小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞进行细胞融合，经过多次亚克隆获得稳定分泌抗莱克多巴胺的单克隆抗体细胞株6E5。

(3)单克隆抗体制备、纯化及鉴定：取8～10周龄的BALB/c小鼠，用灭菌石蜡对小鼠进行免疫，10天后腹腔注射所述单克隆抗体细胞株6E5，注射量为5×10⁵个/只，待小鼠腹部明显膨大，采集腹水，用辛酸-硫酸铵盐析法及Protein A免疫层析法对腹水纯化，即得莱克多巴胺单克隆抗体。通过亚型鉴定得出本发明单克隆抗体的亚型为IgG1型。采用间接竞争ELISA测定抗体特异性及其与同类其它化合物的交叉反应性。

本发明的有益效果是：通过小鼠杂交瘤细胞珠6E5产生特异性强的莱克多巴胺单克隆抗体，与其它类药物交叉反应率低，能够大量生产，可用于制备检测莱克多巴胺的胶体金试纸条，具有灵敏度高、特异性强和操作简便的特点，适合于对大量样品的筛检，应用前景十分广阔。

附图说明：

图1为本发明纯化后莱克多巴胺抗体SDS-PAGE电泳图谱；

图2为本发明单克隆抗体与莱克多巴胺标准品的反应曲线示图；

图3为本发明胶体金试纸条的敏感性示图。

具体实施方式：

为对本发明进行详细说明，下面结合具体实施例做进一步说明，

实施例1人工免疫抗原和包被抗原的合成

称取34mg盐酸莱克多巴胺，加入到用2mL吡啶溶解的含10mg丁二酸酐溶液中，置于通风橱室温条件下搅拌24h后，通氮气吹干吡啶，得到莱克多巴胺-半丁二酸酐化合物。用4mL溶解液(N，N-二甲基甲酰胺与1，4-二氧六环等量混合)将莱克多巴胺-半丁二酸酐溶解，加入26.2μL的三正丁胺，冰浴搅拌10min后，再加氯甲酸异丁酯15μL，室温下搅拌反应1h后，将此混合物置于冰浴中，逐滴加入预先冷冻的蛋白质溶液(100mg蛋白质溶解于0.1M硼酸钠溶液中，pH8.5)中，后置于室温下反应过夜，将上述反应产物装入透析袋(截留分子量3500)在PBS中透析72h以上(每隔6-8小时换液1次)。对透析后的免疫原Rac-KLH，包被原Rac-OVA在220nm-400nm之间进行紫外扫描，结果表明Rac-KLH、Rac-OVA的紫外吸收曲线与偶联前的紫外吸收曲线相比发生了明显的变化，可以判定偶联成功。免疫原Rac-KLH的偶联比为13∶1，包被原的偶联比为21∶1。

实施例2 单克隆抗体的制备

将500μg·mL^-1Rac-KLH的PBS溶液(0.22μm滤膜过滤除菌)与等体积弗氏完全佐剂混合成乳剂，皮下分点注射健康6周龄雌性BALB/C小鼠，每只0.4mL(含Rac-KLH 100μg)，首免后3周后同样剂量加强免疫，佐剂为弗氏完佐剂，共免3次，每次间隔2周，间接ELISA法检测血清抗体效价，选择效价最高的小鼠进行细胞融合，融合前三天以Rac-KLH对小鼠进行加强免疫注射。取小鼠脾细胞和骨髓瘤细胞SP2/0进行融合，加入HAT培养基，37℃、6％CO2培养箱中培养。5天后用新鲜HAT培养基换出一半的培养基，10天后用HT培养基换出HAT培养基。每天观察杂交瘤细胞的生长情况，待其分布至孔底面积1/10以上时，取上清液采用间接ELISA筛选特异性抗体，再用有限稀释法进行3次亚克隆，检测细胞培养上清，阳性率达到100％，得到稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株6E5。

取8～10周龄的BALB/c小鼠8只，用灭菌石蜡对小鼠进行免疫，10天后腹腔注射所述单克隆抗体细胞株6E5，注射量为5×10⁵个/只，待小鼠腹部明显膨大，采集腹水，腹水中即含有大量单克隆抗体。

以上所述步骤中采用的间接ELISA方法以及竞争间接ELISA方法参照Shelver等的方法[Shelver WL，Smith DJ，Berry ES.Production andCharacterization of a Monoclonal Antibody against the β-Adrenergic AgonistRactopanfine.[J]J.Agric.FoodChem，2000，48(9)：4020-4026]进行。

实施例3 单克隆抗体的纯化及其鉴定

1.抗体纯化

腹水采用辛酸-硫酸铵盐析法及Protein A免疫层析法进行纯化，用SDS-PAGE电泳鉴定纯化物，出现51KD的抗体重链条带和26KD的抗体轻链条带，经测定纯度为98.2％(图1)。

2.抗体敏感性测定

采用间接竞争ELISA法测定纯化的抗体的阻断率。用PBS溶解盐酸莱克多巴胺标准品，再稀释成一系列浓度梯度(20ng·mL^-1、10ng·mL^-1、5ng·mL^-1、2.5ng·mL^-1、1ng·mL^-1、0.5ng·mL^-1、0ng·mL^-1)，每种浓度标准品50μL分别加入工作浓度6E5抗体50μL，同时设置0标准孔和空白对照孔，37℃水浴作用1h，加入到包被Rac-OVA的酶标板中，37℃水浴作用2h后洗涤拍干，加入1∶6000稀释的HRP标记的羊抗鼠IgG，50μL/孔，37℃水浴作用30min后同前洗涤拍干，加TMB底物显色液50μL/孔，37℃水浴避光反应10～15min。最后，每孔加入50μL 2mol·L-1硫酸终止反应后，每孔加入终止液50μL终止反应后，读取OD₄₅₀值，共重复三次，得出莱克多巴胺各浓度的标准品溶液的吸光度值(B)，以吸光度值(B)除以零标准品吸光度值(B₀)再乘以100％，得到百分吸光度值，以莱克多巴胺标准品浓度(ng·mL^-1)为x轴，百分吸光率为Y轴，绘制标准曲线，得出本发明中抗体的50％的抑制率浓度(IC50)为3.15ngmL^-1，回归方程为y＝-0.1461x+0.9602，R²为0.9929，结果见图2。

3.抗体特异性

采用间接竞争性ELISA法进行测定，参试物为盐酸克伦特罗、沙丁胺醇、肾上腺素、去甲肾上腺素、异丙肾上腺素，以单抗对莱克多巴胺的IC50与对竞争物的IC50之比的百分数为其交叉反应率(CR％)。单克隆抗体6E5与所选参试物交叉反应率均小于1％，结果见表1。

表1单克隆抗体6E5特异性测定结果

4.单抗的分型鉴定

按鼠类单克隆抗体亚类鉴定试剂盒说明书取细胞上清进行操作。对比不同亚类二抗下的显色结果，以OD₄₅₀值明显高于其它孔则判定该细胞株分泌的单抗所属亚类，单克隆抗体6E5的亚类为IgG1，轻链为κ，结果见表2。

表2单克隆抗体6E5亚类鉴定结里

抗体亚型	6E5
		IgG1	0.815
IgG2a	0.032
		IgG2b	0.022
IgG3	0.060
		IgA	0.031
IgM	0.030
		κ	0.735
λ	0.038
		NRS	0.021
buffer	0.019

实施例4莱克多巴胺快速检测试纸条的制备及应用

1.胶体金制备

采用柠檬酸三钠改良法制备胶体金，配制1％氯金酸溶液(1g氯金酸溶于100mL双蒸水中)。取5mL1％氯金酸溶液加入一个装有495mL超纯水的圆底烧瓶中，用电热恒温器加热煮沸2min，加入1％柠檬酸三钠溶液6mL。当溶液的颜色变为透明的酒红色时，继续搅拌煮沸10min，冷却后用双蒸水定容至500mL，用0.22urn微孔滤膜过滤后4℃贮存备用。

2.金标抗体的制备

取10mL胶体金溶液，用0.2MK₂CO₃溶液调节胶体金溶液的pH值为8.2，缓慢加入提纯的莱克多巴胺单克隆抗体，使单克隆抗体的浓度为5μg.mL^-1，继续搅拌30min，加入10％BSA溶液至终浓度为1％，继续搅拌30min；4℃、1000g离心10min，取上清；4℃、4000g离心30min，小心吸去上清，沉淀用缓冲液(25％蔗糖、1.0％BSA、0.1％PEG、0.05％Tween20、0.1％NaN₃的0.01mol·L^-1的PBS)重悬。

3.胶体金免疫层析试纸的制备

将玻璃纤维浸置于7％蔗糖中，37℃干燥2h。用BioDot XYZ3050试纸条三维喷点平台以5μL·cm^-1将胶体金标记的莱克多巴胺单克隆抗体6E5点喷在玻璃纤维上，37℃干燥2h，即为金标垫。用BioDot XYZ3050试纸条三维喷点平台以0.74μL·cm^-1将Rac-OVA偶联抗原(0.3mg·mL^-1)点喷在硝酸纤维素膜上，即为检测线；在离检测线4mm处喷上羊抗鼠IgG(0.5mg·mL^-1)，即为质控线，37℃干燥2h。取出一块PVC底板，将喷有检测线和质控线的硝酸纤维素膜粘贴在中央区；分别将吸水纸和金标垫粘贴于硝酸纤维素膜的上方和下方，两者之间重叠约2mm；再在金标垫的下方粘贴玻璃纤维作为样品垫，组装成胶体金免疫层析试纸条。

4.检测方法

将试纸条放于干净平整的台面上，用滴管吸取待测样品溶液，滴加1～2滴于样品垫上，等待紫红色条带的出现，静置反应3～5分钟时读取测试结果，30分钟以后判定无效。结果判断为C线(质控线)显色，T线(检测线)不显色为阳性；C、T线均显色为阴性；无论T线是否显色，若C线不显色则说明试纸条无效。

5.试纸条的灵敏度和特异性

配制终浓度为0、2、3、4、5、10、20、50、100ng.mL^-1莱克多巴胺溶液和100ng·mL^-1的克伦特罗、沙丁胺醇溶液。分别取50μL上述溶液加入胶体金免疫层析试纸的样品垫，每个浓度重复5次。结果显示，胶体金免疫层析试验对4ng·mL^-1以下的莱克多巴胺溶液检测为阴性，对4ng·mL^-1及以上莱克多巴胺的溶液检测为阳性，100ng·mL^-1的克伦特罗和沙丁胺醇溶液检测均为阴性，表明胶体金免疫层析检测试纸条具有良好的敏感性和特异性，结果如图3所示。

6.试纸条的批内和批间重复实验

将同批和不同批次的试纸条分别检测0、2、3、4、5、10、20、50、100ng·mL^-1的莱克多巴胺溶液标准品，每个浓度重复3次，观察其重复性。经验证莱克多巴胺快速检测试纸条的批内和批间重复性为100％，假阳性率和假阴性率均为0。

8.试纸条稳定实验

将包装好的试纸条分别保存于4℃和60℃，观察其稳定性。保存于4℃的试纸条每隔7天取出15条分别检测o、3、4、10、20ng·mL^-1的莱克多巴胺标准系列溶液，每个浓度3个重复。保存于45℃的试纸条每天取出15条，分别检测o、3、4、10、20ng·mL^-1的莱克多巴胺标准系列溶液，每个浓度3个重复。4℃保存的试纸条在每隔7天的检验中，显色程度无明显改变，金标垫释放金标抗体较完全。而45℃保存的试纸条在第9天检测时出现样液迁移时间减慢、金标垫释放金标抗体不完全、灵敏度降低等现象。根据试纸条在45℃稳定7天，相当于室温下稳定1年，可以推算该试纸条在常温下至少可以保存12个月。

9.样品处理方法及最低检测线测定

(1)饲料样品

取2g饲料试样加入6mL提取液(甲醇与PBS缓冲液按4∶1比例混合)，混匀以4000g的转速离心10min，取上清加入450μlPBS缓冲液，混匀后取50μl样品用胶体金免疫层析试验进行检测。模拟测定时分别在确认的阴性的饲料试样中添加不同浓度的莱克多巴胺，得出饲料样品中莱克多巴胺最低检测浓度为0.005mg·kg^-1。

(2)动物组织样品

称取样品3g置于离心管中，加乙腈6mL，振荡10min，4000g离心10min；取上清液3mL，50℃水浴下氮气吹干；加正己烷1mL，涡动30s；再加样本缓冲工作液1mL，涡动1min，4000g离心5min，肌肉组织取下层液100μL与样本缓冲工作液100μL混合；肝组织取下层液50μL与样本缓冲工作液150μL混合，取50μL用胶体金免疫层析试验进行检测。模拟测定时分别在确认的阴性的动物组织试样中添加不同浓度的莱克多巴胺，得出动物组织样品中莱克多巴胺最低检测浓度为15ng·g^-1

(3)尿液或血清样品

尿液或血液可直接测试，若尿液浑浊，则需要以3000g离心5min，再取上清液进行测试。模拟测定时分别在确认的阴性的尿液中添加不同浓度的莱克多巴胺，得出尿液样品中莱克多巴胺最低检测浓度为4ng·mL^-1。

以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的仅为本发明的优选例，并不用来限制本发明，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。

Claims (4)

1.一种莱克多巴胺单克隆抗体的制备方法，其特征在于：对盐酸莱克多巴胺进行结构改造，使其含有羧基，再将其与匙孔蓝蛋白进行偶联，以该偶联物为免疫原免疫小鼠，通过细胞融合技术获得杂交瘤细胞，诱生腹水制备出莱克多巴胺单克隆抗体。

2.根据权利要求1所述的莱克多巴胺单克隆抗体的制备方法，其特征在于：所述偶联物是利用混合酸酐法将结构改造后的盐酸莱克多巴胺与匙孔蓝蛋白进行偶联的。

3.一种用权利要求1所述的制备方法制备出的莱克多巴胺单克隆抗体的应用，其特征在于：以莱克多巴胺单克隆抗体为核心试剂制备检测莱克多巴胺的胶体金免疫试纸条。

4.根据权利要求3所述的莱克多巴胺单克隆抗体的应用，其特征在于：所述胶体金免疫试纸条由PVC底板、样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜和吸水垫几部分组成，其中金标垫包被有莱克多巴胺的胶体金标记物，硝酸纤维素膜上包被有莱克多巴胺-载体蛋白偶联物构成的检测线(T)和包被羊抗鼠IgG构成的质控线(C)。

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