CN103911348A - 一种细胞株16号及其产生的单克隆抗体和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种细胞株16号及其产生的单克隆抗体和应用；细胞株16号的制备步骤为：首先，将半抗原1即H1:3-[氰[顺-3-[2-氯-3，3，3-三氟乙基-2，二甲基]环丙烷-苯氧基]苯丙酸，通过活性酯法和血蓝蛋白KLH偶联；然后将半抗原2即H2:氰基-[3-（4-氨基苯氧基）苯基-顺-3-[2-氯-3，3，3-三氟乙烯基-2，2-二甲基]环丙烷酸酯，通过重氮化法和牛血清白蛋白偶联，用作包被原；最后通过动物免疫、血清测定、细胞融合、筛选和亚克隆技术得到细胞株16号。采用小鼠体内诱生法生产腹水，然后通过辛酸-硫酸铵沉淀法纯化得到相应的单克隆抗体；该抗体灵敏度高，半数抑制浓度（IC50）为13.26±1.23ng/mL；特异性强，为国内农产品中高效氯氟氰菊酯的残留检测提供了技术，具有较好的市场前景。

Description

一种细胞株16号及其产生的单克隆抗体和应用

技术领域

    本发明涉及一种细胞株，具体的说是一种细胞株16号、其产生的抗高效氯氟氰菊酯单克隆抗体及其应用。 

背景技术

高效氯氟氰菊酯又名功夫菊酯（cyhalothrin，CAS号 91465-08-6），化学名：(IR/IS)-顺式-(Z)-2,2-二甲基-3-(2-氯-3,3,3-三氟-1-丙烯基)环丙烷羧酸-(S)-a-氰基-3-苯氧基苄酯(1：1的混合物)，是一种拟除虫菊酯类杀虫、杀螨剂，具有趋避、击倒及毒杀作用，杀虫谱广，活性高，药效迅速，喷洒后耐雨水冲刷，广泛地用于果树、蔬菜、棉花、烟草、玉米等作物。随着高效氯氟氰菊酯的广泛应用，现已对生态环境造成了一定的影响。毒理学研究表明，高效氯氟氰菊酯对于鱼类和水生节肢动物具有高毒性，半数致死量（LC50, 50% lethal concentration）小于3 ppb。同时，农产品中高效氯氟氰菊酯的残留问题也日益突出；通过食物链，最终会影响人类健康。因此，研究高效氯氟氰菊酯的残留检测具有十分重要的意义。 

目前，检测高效氯氟氰菊酯最常用的方法是气相色谱法，但该法需要昂贵的仪器设备、专业的操作技术和繁琐的样品净化，不适用于现场的快速检测。随着农产品中拟除虫菊酯类农药最大残留限量越来越严格，迫切需要建立操作简单、成本低的快速检测技术。而免疫分析技术正好具有上述的优点，如酶联免疫法具有低成本和高通量的优势；胶体金免疫层析试纸条具有简单、快速和现场检测的优势；便携式免疫传感器具有灵敏度高的优势。 

建立高效氯氟氰菊酯免疫检测的关键在于抗体的制备。在生产抗体的过程中，首先进行半抗原设计和合成，高效氯氟氰菊酯的半抗原合成步骤多，过程繁琐，并且含有多种旋光异构体，因此说，高效氯氟氰菊酯的抗体制备难度大。到目前为止，仅有关于氯氟氰菊酯多克隆抗体制备的报道[1]；和多克隆抗体相比，单克隆抗体制备过程长，成本高，但容易重复生产，质量相对稳定，特异性强，因此在市场上更受欢迎。然而迄今为止，尚没有关于高效氯氟氰菊酯单克隆抗体制备的报道。 

发明内容

本发明目的是为解决上述技术问题的不足，提供一种细胞株16号，分类命名为单克隆细胞株，已于2013年1月23日保藏中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），保藏编号为CGMCC No.7216。其所产生的单克隆抗体，可以实现农产品中高效氯氟氰菊酯残留的快速检测，用于制备检测高效氯氟氰菊酯的酶联免疫法和胶体金试纸条。 

本发明为解决上述技术问题所采用的技术方案是： 

一种细胞株16号，按照如下步骤获得：首先，将半抗原1（H1，3 - [氰[顺- 3 - [ 2-氯-3，3，3-三氟乙基-2，二甲基]环丙烷-苯氧基]苯丙酸）通过活性酯法和血蓝蛋白(KLH)偶联，用作免疫原，过程如下：

然后将半抗原2(H2，氰基- [3 -（4 - 氨基苯氧基）苯基-顺-3 - [2 -氯-3 ，3 ， 3 - 三氟乙烯基-2，2-二甲基] 环丙烷酸酯)通过重氮化法和牛血清白蛋白(BSA)偶联，用作包被原，过程如下：

然后通过动物免疫、血清测定、细胞融合、筛选和亚克隆技术得到细胞株16号。

一种所述的细胞株16号产生的抗高效氯氟氰菊酯单克隆抗体，重链为IgG_2b型，轻链为Kappa 链，亲和常数为2.810⁶ L/mol；按照如下步骤产生： 

采用小鼠体内诱生法生产腹水，然后通过辛酸-硫酸铵沉淀法纯化得到相应的单克隆抗体，即为抗高效氯氟氰菊酯单克隆抗体。

有益效果 

本发明细胞株16号将细胞株产生的单克隆抗体，用于高效氯氟氰菊酯残留的检测；灵敏度高，半数抑制浓度（IC50）为13.26±1.23ng/mL；特异性强，仅与氟胺氰菊酯和苯醚氰菊酯有低于5%的交叉反应；可以用于制备高效氯氟氰菊酯残留检测的酶联免疫法和免疫层析试纸条法，为国内农产品中高效氯氟氰菊酯的残留检测提供了技术，具有较好的市场前景。

生物材料的保藏

一种细胞株16号，保藏日期为2013年1月23日，保藏单位及其简称为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），保藏编号CGMCC No. 7216，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

附图说明

图1为抗高效氯氟氰菊酯单克隆抗体的亚型鉴定图； 

图2为抗高效氯氟氰菊酯单克隆抗体的亲和常数测定图；

图3为抗高效氯氟氰菊酯单克隆抗体的酶联免疫法的灵敏度测定结果；

图4为抗高效氯氟氰菊酯单克隆抗体的胶体金免疫层析试纸条的测定结果实例图。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明做进一步的说明，实施例中如无特殊说明均为常规方法。 

一种细胞株16号，按照如下步骤获得： 

步骤一、首先，将半抗原1（H1，3 - [氰[顺- 3 - [ 2-氯-3，3，3-三氟乙基-2，二甲基]环丙烷-苯氧基]苯丙酸）通过活性酯法和血蓝蛋白(KLH)偶联，用作免疫原，过程如下：

然后将半抗原2(H2，氰基- [3 -（4 - 氨基苯氧基）苯基-顺-3 - [2 -氯-3 ，3 ， 3 - 三氟乙烯基-2，2-二甲基] 环丙烷酸酯)通过重氮化法和牛血清白蛋白(BSA)偶联，用作包被原；过程如下：

步骤二、 动物免疫和血清筛选：选择6-8周龄BALB/c小鼠（购自扬州的比较医疗中心）为试验动物，购买的小鼠先适应环境一周，然后开始免疫；每6只BALB/c小鼠为一组，共3组；免疫原由半抗原1和血蓝蛋白通过活性酯法相偶联；将快免佐剂和免疫原按照1:1比例混合后，采用肌肉注射方式，每只BALB/c小鼠免疫快免佐剂和免疫原的混合物50μg（以蛋白含量计算），免疫间隔2周，四次免疫后7-10天，采用间接竞争酶联免疫法测定血清的效价和抑制，选择效价高并抑制好的小鼠作为融合小鼠；

步骤三、 细胞融合：融合前一周，开始SP2/0骨髓瘤细胞的复苏和培养；融合前3天，对选出的融合小鼠采用腹腔注射免疫原25μg（以蛋白含量计算）后，备用；

融合整个过程，包括4步：

1）收集SP2/0骨髓瘤细胞，融合前一天对瘤细胞换液，目的是为了调整SP2/0 骨髓瘤细胞的状态和数量，使大部分SP2/0骨髓瘤细胞处于对数生长期，这一点对于整个融合成败至关重要，如果SP2/0骨髓瘤细胞的状态不佳，会导致融合率显著下降；同时保证足够SP2/0骨髓瘤细胞总数达到1-510⁷；将SP2/0骨髓瘤细胞收集到的无菌50 mL离心管中，离心（1200 rpm，6 min）, 弃上清，再用RPMI 1640培养基进行重悬，计数，备用；

2）收集脾细胞 采用颈椎脱臼法处死小鼠后，立即放入75%酒精中消毒，浸泡5 min左右，采用无菌操作取出BALB/c小鼠的脾脏，用注射器的胶头适度用力地在筛网上研磨脾脏，脾细胞漏出筛网得到脾细胞悬液，用RPMI-1640培养基离心洗涤脾细胞三次，最后一次离心后，将脾细胞稀释到10 mL，计数，备用；   

3）融合 先将聚乙二醇1500（PEG1500）、RPMI-1640培养基和HAT培养基置于37℃的水浴锅中进行预热；将脾细胞和SP2/0骨髓瘤细胞按照5-10:1比例进行混合，离心（1200 rpm，6 min），弃上清；采用PEG 1500对脾细胞和SP2/0 瘤细胞采用常规的方法进行融合；结束后，将融合后的细胞悬液置于在37℃，5% CO₂培养箱中，静置5 min；离心（800 rpm，6 min），弃上清；

4）培养 用预热的HAT培养基重悬融合后的细胞，按照200 mL/孔注入到96孔细胞板；最后，置于37℃，5% CO₂培养箱中培养；

步骤四、融合后的细胞的亚克隆和筛选 ：融合后的细胞经过2次换液后，采用间接竞争酶联免疫法对细胞上清进行测定；根据测定结果选择阳性值高并且抑制效果好的孔；接着采用有限稀释法对选出孔进行亚克隆；通常进行3-4次亚克隆过程，获得细胞株16号；

步骤五、细胞株16号的扩培和冻存：将获得的细胞株16号在六孔板中生长5-6天，隔天换液，细胞密度达到1-0.510⁵个/mL；可以冻存；通常每块六孔板可以冻存2管；需要注意的是，在冻存管上，标记好目标物种类，细胞编号，冻存日期；放入冻存盒中，由于冻存盒中含有异丙醇溶剂，延缓温度的下降速度，因此，直接将冻存盒从4℃转移到-80℃，24 h后，转入到液氮罐中长期保存。

一种所述的细胞株16号产生的抗高效氯氟氰菊酯单克隆抗体，其特征在于：单克隆抗体的重链为IgG_2b型，轻链为Kappa 链，亲和常数为2.810⁶ L/mol；按照如下步骤产生： 

步骤一、选择健康的BALB/c小鼠，每只小鼠注射无菌石蜡油0.5-0.8 mL；10天后，每只小鼠腹腔注射110⁶个细胞株16号细胞；每天观察小鼠的活动状态，如果小鼠的腹部明显增大，用手触摸有紧绷感，并且不愿活动时，可以收集腹水；然后以6000 rpm离心12 min除去红细胞等杂质；

步骤二、采用辛酸-硫酸铵沉淀法纯化腹水，即得到抗高效氯氟氰菊酯单克隆抗体。

步骤三、亚型鉴定 

采用美国的EnviroLogix公司的单抗亚型鉴定的快速检测试纸条测定细胞上清，根据亚型鉴定的标准图谱，判断单克隆抗体重链和轻链的类型。根据图1的检测结果和亚型鉴定的标准图谱对照，得出单克隆抗体的重链为IgG_2b型，轻链为Kappa 链。

步骤四、亲和常数的测定 

包被原（H2-BSA）从1 mg/mL 开始倍比稀释五个不同的浓度进行测定，每个孔做五次平行；单克隆抗体从10 mg/mL开始倍比稀释8-10个浓度，采用间接竞争酶联免疫方法测定单克隆抗体（mAb）的效价；然后以单克隆抗体浓度（mAb浓度，mg/mL）对数值为横坐标，以Abs（450nm）为纵坐标在origin 8.5软件中绘制出4条曲线，根据绘制曲线计算出Abs（450nm）抑制50%时对应的抗体浓度，换算抗体浓度的单位mol/L，然后两两一组，根据下式计算亲和常数（Ka）

Ka=(n-1)/2(n[Ab’]t-[Ab]t)

其中，n为2个包被浓度的比值（大于1）；[Ab’]t 和[Ab]t分别为对应Abs（450nm）抑制一半时对应的抗体浓度（mol/L）。

根据图2的测定结果，计算出抗体的亲和常数为2.810⁶ L/mol。 

实施实例1基于抗高效氯氟氰菊酯单克隆抗体的酶联免疫法对水样中高效氯氟氰菊酯残留的检测应用 

1、抗高效氯氟氰菊酯单克隆抗体灵敏度的测定

采用间接竞争酶联免疫法（ic-ELISA）测定单克隆抗体对高效氯氟氰菊酯的抑制效果，选择包被原H2-BSA浓度为0.5mg/mL，抗体的蛋白浓度为0.06mg/mL，测定结果用origin 8.5软件进行四参数回归拟合，结果见图4。根据拟合的回归方程，计算抗体IC50为13.26±1.23ng/mL； 标准曲线的线性范围在1-100 ng/mL之间；检测限达到了1.83ng/mL。

2、样品前处理及测定 选择太湖水作为水样，太湖水采用定性滤纸过滤，除去固性物，通过简单稀释后，采用ic-ELISA进行检测；根据图3标准曲线，算出样品中高效氯氟氰菊酯含量为12.8 ng/mL； 

实施实例2 基于抗高效氯氟氰菊酯单克隆抗体的胶体金免疫层析试纸条对果蔬中高效氯氟氰菊酯残留的检测应用

1、抗高效氯氟氰菊酯单克隆抗体灵敏度的测定

配置一系列的高效氯氟氰菊酯的标准溶液：0 ng/mL, 10 ng/mL，20 ng/mL，50 ng/mL，100 ng/mL，200ng/mL，500 ng/ mL，1000 ng/mL；将检测试纸条的样品垫分别插入高效氯氟氰菊酯的标准品溶液，溶液通过层析作用从试纸条上流过，10-12分钟后，金标试纸条的测定结果见图4，胶体金免疫层析试纸条检测高效氯氟氰菊酯的裸眼灵敏度达到了200 ng/mL；由此可见，细胞株16号分泌单克隆抗体可以用于高效氯氟氰菊酯农药残留的检测。

2、样品预处理：先将苹果切成小块，称取10.0 g 放入100 mL 的三角瓶中，加入50 mL的正己烷，震荡45分钟；过滤，减压旋蒸至干，在测定前用甲醇溶解；用10%甲醇-PBS溶液（磷酸盐缓冲溶液）稀释进行测定。 

将金标试纸条插入样品溶液中，10-12分钟后，用肉眼观察结果。先用气质联用技术（GC-MS）对6份样品中高效氯氟氰菊酯含量进行测定；仪器检测结果如下：1号样品中高效氯氟氰菊酯的浓度为15.6 ng/mL；其他5份样品样品中高效氯氟氰菊酯含量均超过了200 ng/mL。试纸条测定结果如下：测定1号样品的试纸条出现了T线和C 线两条线，被判为阴性样品，表明样品中高效氯氟氰菊酯的含量远远低于200 ng/mL；测定2号、3号、4号、5号和6号样品的试纸条仅在C线出现了一条线，说明样品中高效氯氟氰菊酯的含量超过了试纸条检测限200 ng/mL，和GC-MS法的测定结果相吻合。 

Claims (6)

1.一种细胞株16号，其特征在于：分类命名为单克隆细胞株，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.7216。

2.根据权利要求1所述的细胞株16号的制备方法，其特征在于：按照如下步骤获得：首先，将半抗原1即H1: 3- [氰[顺-3- [2-氯-3，3，3-三氟乙基-2，二甲基]环丙烷-苯氧基]苯丙酸，通过活性酯法和血蓝蛋白KLH偶联；然后将半抗原2即H2: 氰基-[3-（4-氨基苯氧基）苯基-顺-3- [2-氯-3，3，3- 三氟乙烯基-2，2-二甲基] 环丙烷酸酯 ，通过重氮化法和牛血清白蛋白偶联，用作包被原；最后通过动物免疫、血清测定、细胞融合、筛选和亚克隆技术得到细胞株16号。

3.一种由权利要求1所述的细胞株16号产生的抗高效氯氟氰菊酯单克隆抗体，其特征在于：单克隆抗体的重链为IgG_2b型，轻链为Kappa 链，亲和常数为2.8 10⁶ L/mol。

4.根据权利要求3所述的细胞株16号产生的抗高效氯氟氰菊酯单克隆抗体在高效氯氟氰菊酯残留检测中的应用。

5.根据权利要求4所述的细胞株16号产生的抗高效氯氟氰菊酯单克隆抗体在高效氯氟氰菊酯残留检测中的应用，其特征在于：将所述单克隆抗体用于制备检测高效氯氟氰菊酯残留的酶联免疫试剂盒。

6.一种根据权利要求4所述的细胞株16号产生的抗高效氯氟氰菊酯单克隆抗体在高效氯氟氰菊酯残留检测中的应用，其特征在于：将所述单克隆抗体用于制备检测高效氯氟氰菊酯残留的胶体金试纸条。