CN105628922A - 联苯菊酯的快速金标试纸条及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种联苯菊酯的快速金标试纸条及其制备方法，包括衬板，其特征是：在所述衬板上排列样品垫、金标结合垫、纤维素膜和吸水垫，金标结合垫内吸附联苯菊酯金标抗体，纤维素膜上采用联苯菊酯半抗原偶联的载体蛋白溶液印制隐形检测线，采用兔抗鼠IgG抗体印制隐形对照线。所述联苯菊酯的快速金标试纸条的制备方法，包括以下步骤：联苯菊酯半抗原的合成；联苯菊酯半抗原与载体蛋白偶联得到联苯菊酯半抗原偶联的载体蛋白溶液；联苯菊酯金标抗体的制备；金标结合垫的制备；兔抗鼠IgG抗体的制备；联苯菊酯半抗原偶联的载体蛋白溶液和兔抗鼠IgG抗体包被纤维素膜；试纸条的组装。本发明所述金标试纸条具有特异、敏感、快速、简便的优点。

Description

联苯菊酯的快速金标试纸条及其制备方法
技术领域
本发明涉及一种联苯菊酯的快速金标试纸条及其制备方法，属于农药残留免疫分析技术领域。
背景技术
联苯菊酯（bifenthrin）又名天王星、虫螨灵、毕芬宁，是由FMC公司研制开发的一种拟除虫菊酯类杀虫、杀螨剂，除对鳞翅目幼虫、蚜虫、粉虱、植食性叶螨等20多种农业害虫有较好防效外，还对卫生害虫白蚁有强烈的驱避及毒杀作用。联苯菊酯对鱼类及家蚕高毒，对蜜蜂中毒，但该药在水中溶解度很低（1mg/L），且能较好的吸附于土壤颗粒表面，因此对环境造成的危害较小。联苯菊酯具有作用迅速、残效期长、在土壤中不移动等优点，作为一种理想的白蚁防治毒土处理药剂，被广泛应用于我国新建房屋的白蚁预防。
目前，对农药残留的检测方法主要是仪器分析方法和酶联免疫分析方法（ELISA）等。仪器分析方法包括高效液相色谱法（Highperformanceliquidchromatography，HPLC）、气相色谱法（Gaschromatography，GC）、薄层色谱法（Thinlayerchromatography，TLC）、液-质串联法（HPLC-MS）和气-质串联法（GC-MS）等，这些仪器分析方法虽然可以达到较高的检测灵敏度，但需要复杂昂贵的仪器设备及专业操作人员，加之样品前处理繁琐费时、检测费用高，难以满足快速、在线检测的需要。ELISA（EnzymeLinkedImmunosorbentAssay）方法是常用的免疫检测方法，但是其却有操作步骤相对较多，检测时间较长，检测结果不够直观，不能在线进行检测等缺陷。因而ELISA在联苯菊酯的现场快速检测及施药量控制上的应用受到很大的限制。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术中存在的不足，提供一种联苯菊酯的快速金标试纸条及其制备方法，该金标试纸条具有特异、敏感、快速、简便的优点。
按照本发明提供的技术方案，所述联苯菊酯的快速金标试纸条，包括衬板，其特征是：在所述衬板上依次排列样品垫、金标结合垫、纤维素膜和吸水垫，金标结合垫内吸附联苯菊酯金标抗体，纤维素膜上设有隐形检测线和隐形对照线，隐形检测线采用联苯菊酯半抗原偶联的载体蛋白溶液印制，隐形对照线采用兔抗鼠IgG抗体印制。
进一步的，所述联苯菊酯半抗原偶联的载体蛋白溶液采用的载体蛋白为牛血清白蛋白BSA、鸡卵清白蛋白OVA或人血清白蛋白HAS。
进一步的，在所述样品垫外部包裹样品浸入端保护膜，在吸水垫外部包裹手柄端保护膜。
进一步的，在所述样品浸入端保护膜上设有标识线。
进一步的，所述标识线位于偏向样品垫一侧约0.5厘米处。
进一步的，所述隐形检测线靠近样品垫一侧设置，隐形对照线靠近吸水垫一侧设置。
进一步的，述联苯菊酯金标抗体为胶体金标记的联苯菊酯单克隆抗体，该单克隆抗体由保藏编号为CCTCCNo.C2014135的杂交瘤细胞株所分泌。
所述联苯菊酯的快速金标试纸条的制备方法，其特征是，包括以下步骤：
（1）联苯菊酯半抗原的合成；
（2）联苯菊酯半抗原与载体蛋白偶联得到联苯菊酯半抗原偶联的载体蛋白溶液；
（3）联苯菊酯金标抗体的制备；
（4）金标结合垫的制备；
（5）兔抗鼠IgG抗体的制备；
（6）联苯菊酯半抗原偶联的载体蛋白溶液和兔抗鼠IgG抗体包被纤维素膜；
（7）试纸条的组装。
进一步的，所述步骤（4）金标结合垫的制备：将载体蛋白溶液以8μl/cm的量喷在金标结合垫上，42℃干燥50min后，再把金标记抗体以7μl/cm的量喷在金标结合垫上，干燥箱42℃干燥50min，真空干燥保存。
进一步的，所述步骤（6）具体为：把联苯菊酯半抗原偶联的载体蛋白溶液以1.2μl/cm的量喷在纤维素膜的下侧，作为检测线；把兔抗鼠IgG以1.2μl/cm的量喷在纤维素膜的上侧，作为对照线。
本发明具备以下优点：
（1）特异性强，敏感性高：本发明所述金标试纸条以胶体金标记高亲和力的单克隆抗体为基础制备而成，金标抗体中的胶体金颗粒与抗体分子之间无共价键，两者通过异性电荷间的范德华力相结合，胶体金的标记对单克隆抗体的特异性和亲和力影响很小，而且有较高的标记率。因此，试纸条很好的保留了单克隆抗体的特性，具有较强的特异性和较高的敏感性，检出最低限量为7.5mg/L。
（2）简便、快速：在使用本发明所述金标试纸条时，无需任何其他辅助仪器，可现场操作，只要将检测样加入样品垫，在5至10分钟内即可判定检测结果。
（3）结果显示形象、直观、准确：本发明所述金标试纸条的检测结果以纤维素膜上的显色情况来判断。如果样品中有待测物时，待测物和金标抗体结合形成抗原－金标抗体复合物，并且继续上移，遇隐形检测线不显色或者显色很弱即表示检测样品阳性或者弱阳性；如果样品中没有待测样品时，金标抗体继续上移，遇隐形检测线显示一条清晰红线即表示检测样品阴性。隐形对照线颜色的有或无表示此试纸条的有效或无效。结果判定形象、直观、准确、简单明了。
（4）节省费用，适用范围广，便于推广：使用本发明所述金标试纸条进行检测，比使用仪器和ELISA试剂盒检测进行检测的费用大幅降低。再者，试纸条的使用范围广，可满足不同层次人员的需要，便于推广应用，具有广阔的市场前景和明显的经济和社会效益。
（5）本发明所述的联苯菊酯胶体金试纸条，无需专业操作人员及任何辅助类仪器，根据反应所显现的条带几分钟内即可判定结果，不仅操作简便、快速、结果直观准确、成本低，并且可以在室外进行检测。
附图说明
图1为本发明所述联苯菊酯的快速金标试纸条的示意图。
图2为本发明所述联苯菊酯的快速金标试纸条的剖视图。
图3A～图3E为联苯菊酯快速检测试纸条结果判定示意图，其中：
图3A为阴性样品检测结果，图3B为弱阳性样品检测结果，图3C为强阳性样品检测结果，图3D和图3E为试纸条失效。
具体实施方式
下面结合具体附图对本发明作进一步说明。
如图1～图2所示：本发明所述联苯菊酯的快速金标试纸条包括衬板1、样品垫2、金标结合垫3、纤维素膜4、隐形检测线5、隐形对照线6、吸水垫7、样品浸入端保护膜8-1、手柄端保护膜8-2、标识线9等。
实施例1：
一种联苯菊酯胶体金快速检测试纸条，所述试纸条含有衬板1和依次排列在衬板上的样品垫2、金标结合垫3、纤维素膜4和吸水垫7，所述衬板1为不吸水的韧性材料，所述的韧性材料用硬质塑胶条制成，所述金标结合垫3内吸附有联苯菊酯金标抗体，所述纤维素膜4上有隐形检测线5和隐形对照线6，所述隐形检测线5用联苯菊酯半抗原偶联的载体蛋白溶液印制，所述隐形对照线6用兔抗鼠IgG抗体印制。所述吸水垫7为吸水能力较强的吸水滤纸或滤油纸。联苯菊酯金标抗体为胶体金标记的联苯菊酯单克隆抗体。偶联联苯菊酯半抗原的载体蛋白为牛血清白蛋白BSA。在试纸条的吸水垫上设有手柄端保护膜8-2，在样品垫2上设有样品浸入端保护膜8-1。所述的保护膜为不透明的胶膜，样品垫2、金标结合垫3对应的保护膜上印制有待测样品标记线，该标记线偏向样品垫一侧约0.5厘米处。
样品垫2用玻璃纤维棉制成。纤维素膜为硝酸纤维素膜。
实施例2：
与实施例1基本一样，区别在于，所述的韧性材料用不吸水硬纸条制成，所述吸水垫7为吸水能力较强的滤油纸。偶联联苯菊酯半抗原的载体蛋白为鸡卵清白蛋白OVA。样品垫2用尼龙膜、聚偏二氟乙烯膜和聚酯膜制成。纤维素膜为纯纤维素膜。
实施例3：
与实施例1基本一样，区别在于，所述的韧性材料用硬质塑胶条制成，吸水垫7为吸水能力较强的吸水滤纸。偶联联苯菊酯半抗原的载体蛋白为人血清白蛋白HAS。样品垫2用聚偏二氟乙烯膜和聚酯膜制成。纤维素膜为羧化纤维素膜。
实施例4：一种联苯菊酯的快速金标试纸条的制备方法，包括以下步骤：
（1）、联苯菊酯半抗原的合成：
①联苯菊酯半抗原LBc的合成：称取0.99g（5mmol）联苯醇于50mL圆底烧瓶中，加入10mL无水吡啶和1.0g（10mmol）丁二酸酐，50℃避光条件下，磁力搅拌反应12h；向反应溶液中加入10mL3.6%（v%）盐酸，继续反应0.5h；转移反应溶液至250mL分液漏斗，乙酸乙酯萃取两次（20mL×2），水洗两次（15mL×2），饱和NaCl水溶液洗一次（10mL）；有机相经无水硫酸钠干燥后，减压蒸发浓缩近干，重结晶，得到白色固体。
②联苯菊酯半抗原LBy的合成：取1.4g联苯醉于100mL三口烧瓶中，加入0.98g18-冠醚-6，加入20mL丙酮溶解，冷却，在冰浴条件下，将2.8g高锰酸钾研细后的粉末分批加入，搅拌反应5h；将反应后的混合物抽滤，并用少量丙酮洗滤饼，滤饼风干后，放入研钵内，加入适量的饱和NaHCO3，研磨，使可溶性部分充分溶解，过滤除去MnO2，滤液用浓盐酸调节pH值为2.0左右，乙醚提取，水洗，无水Na2SO4干燥，浓缩近干；采用柱层析法纯化，分别用抓仿：石油醚（20：80）、氯仿进行梯度淋洗，收集氯仿部分，浓缩后得到白色晶体。
（2）、联苯菊酯半抗原与载体蛋白偶联：
利用活泼酯法（ActiveEstermethod，简称AE法）将具有羧基末端（-COOH）的半抗原偶联到大分子的蛋白质上。分别称取0.1mmol半抗原与0.1mmolNHS，用600μlDMF溶解于反应装置中；称取0.1mmolDCC，用400μlDMF溶解；将DCC/DMF溶液缓慢滴加到上述反应装置中；在磁力搅拌下室温密封反应7小时；反应终液置4℃冰箱冷却2小时以上，经8000rpm离心5分钟，取上清活泼酯液缓慢地加入到5ml15mg/ml的BSA蛋白中，反应在磁力搅拌下室温搅拌4小时；待反应完成后，将反应液置于透析袋内，于0.02mol/LpH6.8的PB缓冲液中4℃搅拌透析，每四小时换一次透析液，共透析60小时；透析结束后将透析袋中的液体取出，经4℃12000rpm离心5分钟，取上清分装保存于-20℃冰箱中。
同上述方法，用OVA或HAS代替BSA制备人工抗原HAPTEN-OVA或HAPTEN-HAS。
（3）、抗联苯菊酯单克隆抗体的制备：
以50μg~100μg每只的抗原量免疫6～8周龄健康的雌性BALB/c小鼠；每次间隔时间为2~3周，最后一次超强免疫后3天，无菌条件下取出小鼠脾细胞，将小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0以5：1的细胞数量用PEG介导的方法融合。融合后置于37℃、5%CO2培养箱中培养；培养至细胞长满培养孔1/3~1/2时，用间接竞争ELISA法选择强阳性、抑制率高、细胞生长旺盛的孔进行3次优先稀释克隆，然后扩大培养，建立杂交瘤细胞株；将特异性的细胞株移入高密度细胞培养器（CELLINE350）中培养，收集细胞培养液并用ProteinA进行抗体纯化，之后用超滤离心管去盐，冷冻抽干获得干粉状抗体，并于-20℃冻存备用。
（4）、金标抗体和金标结合垫的制备：
采用柠檬酸三钠还原氯金酸的方法，制备平均直径在40nm的胶体金悬浮液；在回流条件下，把100ml0.01%的氯金酸溶液加热至沸腾，不停的搅拌，迅速加入1.1ml1%的柠檬酸三钠；当反应溶液颜色变成葡萄红色时继续加热搅拌5min；冷却至室温后，加入0.05%的叠氮化钠4℃保存；胶体金在与抗体标记前以0.2mol的K2CO3溶液调到pH为8.2左右，采用经典NaCl滴定法确定胶体金溶液与联苯菊酯抗体的最佳标记量为5μg/ml；然后按最佳标记量进行标记，标记1小时后，搅拌下加入10%BSA（使最终BSA浓度为1%），孵育1小时后4℃10000rpm离心25min，并去上清；再用和所用胶体金溶液同体积的2%BSA溶液重悬后4℃10000rpm离心25min，重复两次；最后，用1/5胶体金溶液体积的TB溶液（含3%BSA、3%蔗糖、0.01mol/L硼酸钠和0.05%叠氮化钠）重悬，4℃保存；用XYZ-3000三维喷膜仪把4%的BSA溶液以8μl/cm的量喷在玻璃棉上，使用干燥箱42℃干燥50min，再把金标记抗体以7μl/cm的量喷在玻璃棉上，干燥箱42℃干燥50min，真空干燥保存。
（5）、兔抗鼠IgG抗体的制备：
将纯化得到的IgG按50~100μg/kg体重经皮下和肌肉注射家兔3~4次，末次注射10天后，以ELISA测定其血清效价达到1：2000以上时，心脏采血，分离收集高免血清；以饱和硫酸铵法提取兔抗鼠IgG抗体，用于胶体金层析检测试纸条对照线的制备。
（6）、偶联抗原和兔抗鼠包被纤维素膜：
用XYZ-3000三维喷膜仪把浓度为1mg/ml的偶联抗原以1.2μl/cm的量喷在纤维素膜的偏下侧，作为检测线。用XYZ-3000三维喷膜仪把浓度为93.75μg/L的兔抗鼠IgG以1.2μl/cm的量喷在纤维素膜的偏上侧，作为对照线，两线间隔5mm。
（7）、快速试纸条的组装：
把纤维素膜粘贴在衬板中间部位上，吸水垫粘贴在纤维素膜上侧和纤维素膜重叠1mm；金标结合垫粘贴在NC膜（硝酸纤维素膜）下方重叠1mm；样品垫粘贴在金标结合垫下方重叠2mm；组装好的试纸板用斩切机切成4.08mm宽的试纸条。
（8）、快速检测试纸条检测反应原理：
当待测样品溶液加入试纸条或试纸卡测试端后，待测溶液通过虹吸作用带动待测物及金标结合物垫中的金标抗体一起向纤维素膜扩散，并最终渗入吸水垫端。在扩散过程中，如果样品中有待测物时，待测物和金标抗体结合，进而占据了金标抗体上的抗原结合点，阻止金标抗体与纤维素膜上检测线（半抗原与载体蛋白的结合物）的结合，使检测线不显色或者显色很弱即表示检测样品阳性或者弱阳性；如果样品中没有待测样品时，金标抗体在上移过程中，遇检测线显示一条清晰红线即表示检测样品阴性。同样，金标抗体也与纤维素膜上的对照线（兔抗鼠IgG）结合，使对照线显红色。对照线颜色的有或无分别表示此试纸条的有效或无效。
实施例5：应用实施例：
（1）、检测样品液的制备：
土壤样品溶液的预处理：称取10g土壤样品（风干，过120目筛）于50mL离心管中，加入20mL甲醇：PBS（0.14M，pH7.4）（v：v）=8:2的溶液，涡旋3min，超声提取10min，4000rpm离心5min，取1mL上清液用工作缓冲液稀释一定倍数后测定溶液中联苯菊酯含量。
（2）、检测及结果判断：
将联苯菊酯试纸条样品端插入以上预处理的各待检测样品中，插入深度不超过标记线9，待测溶液通过虹吸作用带动待测物及金标结合垫中的金标抗体一起向纤维素膜扩散，并最终渗入吸水垫端。在扩散过程中，如果样品中有待测物浓度大于60mg/L时，阻止金标抗体与纤维素膜上检测线（半抗原与载体蛋白的结合物）的结合，使检测线不显色即表示检测样品为阳性（如图3C）；如果样品中待测物在7.5~60mg/L时，阻止部分金标抗体与纤维素膜上检测线的结合，使检测线显示很弱的红色即表示检测样品为弱阳性（如图3B）；如果样品中待测物浓度小于7.5mg/L时，不能阻止金标抗体与纤维素膜上检测线的结合，使检测线显示一条清晰红线即表示检测样品为阴性（如图3A）。同样，金标抗体也与纤维素膜上的对照线（兔抗鼠IgG）结合，使对照线显红色，对照线颜色的有或无分别表示此试纸条的有效或无效（如图3A、B、C为有效D、E为无效）。5-10分钟判定检测结果。
实施例6：
（1）、特异性试验：
按实施例5所述的方法进行试验，将与联苯菊酯结构相似的八种农药（三氟氯氰菊酯、功夫菊酸、氯氰菊酯、溴氰菊酯、甲氰菊脂、氰戊菊酯、醚菊酯和胺菊酯）的标准品配成100ppm，用本发明试纸条进行检测，纤维素膜上检测线与对照线呈“||”排列，即联苯菊酯试纸条与毒死蜱、杀螟硫磷、甲基对硫磷、联苯菊酯、倍硫磷这八种农药没有交叉反应。从而可以断定此试纸条特异性很好，在进行检测时不会受到其他样品的干扰。
（2）敏感性和均一性试验：
按实施例5所述的方法进行试验，用本发明试纸条进行检测60、30、15、7.5、3.75、1.875、0.9375、0mg/L的联苯菊酯溶液，重复10次，其中60mg/L的联苯菊酯标准品检测的检测结果为纤维素膜上的对照线呈一条红色线，即为阳性；30、15和7.5mg/L的联苯菊酯标准品检测的检测结果为纤维素膜上的对照线呈一条红色线，检测线呈一条很弱的红色线，即为弱阳性；0、0.9375和1.875mg/L的联苯菊酯标准品检测的检测结果为纤维素膜上的检测线和对照线呈两条红色线。因此本发明检测试纸条的灵敏度为7.5mg/L。此10检测显色深度均一，检测结果显示一致。
（3）稳定性试验：
将试纸条放入铝铂袋中真空包装，并且室温保存，3个月后各项指标均符合上1-2项指标，即检测其他相似农药无交叉反应，灵敏度达7.5mg/L，检测显色深度均一，反应结果一致。

Claims (10)

1.一种联苯菊酯的快速金标试纸条，包括衬板（1），其特征是：在所述衬板（1）上依次排列样品垫（2）、金标结合垫（3）、纤维素膜（4）和吸水垫（7），金标结合垫（3）内吸附联苯菊酯金标抗体，纤维素膜（4）上设有隐形检测线（5）和隐形对照线（6），隐形检测线（5）采用联苯菊酯半抗原偶联的载体蛋白溶液印制，隐形对照线（6）采用兔抗鼠IgG抗体印制。
2.如权利要求1所述的联苯菊酯的快速金标试纸条，其特征是：所述联苯菊酯半抗原偶联的载体蛋白溶液采用的载体蛋白为牛血清白蛋白BSA、鸡卵清白蛋白OVA或人血清白蛋白HAS。
3.如权利要求1所述的联苯菊酯的快速金标试纸条，其特征是：在所述样品垫（2）外部包裹样品浸入端保护膜（8-1），在吸水垫（7）外部包裹手柄端保护膜（8-2）。
4.如权利要求3所述的联苯菊酯的快速金标试纸条，其特征是：在所述样品浸入端保护膜（8-1）上设有标识线（9）。
5.如权利要求4所述的联苯菊酯的快速金标试纸条，其特征是：所述标识线（9）位于偏向样品垫（2）一侧约0.5厘米处。
6.如权利要求1所述的联苯菊酯的快速金标试纸条，其特征是：所述隐形检测线（5）靠近样品垫（2）一侧设置，隐形对照线（6）靠近吸水垫（7）一侧设置。
7.如权利要求1所述的联苯菊酯的快速金标试纸条，其特征是：所述联苯菊酯金标抗体为胶体金标记的联苯菊酯单克隆抗体，该单克隆抗体由保藏编号为CCTCCNo.C2014135的杂交瘤细胞株所分泌。
8.一种联苯菊酯的快速金标试纸条的制备方法，其特征是，包括以下步骤：
（1）联苯菊酯半抗原的合成；
（2）联苯菊酯半抗原与载体蛋白偶联得到联苯菊酯半抗原偶联的载体蛋白溶液；
（3）联苯菊酯金标抗体的制备；
（4）金标结合垫的制备；
（5）兔抗鼠IgG抗体的制备；
（6）联苯菊酯半抗原偶联的载体蛋白溶液和兔抗鼠IgG抗体包被纤维素膜；
（7）试纸条的组装。
9.如权利要求8所述的联苯菊酯的快速金标试纸条的制备方法，其特征是：所述步骤（4）金标结合垫的制备：将载体蛋白溶液以8μl/cm的量喷在金标结合垫上，42℃干燥50min后，再把金标记抗体以7μl/cm的量喷在金标结合垫上，干燥箱42℃干燥50min，真空干燥保存。
10.如权利要求8所述的联苯菊酯的快速金标试纸条的制备方法，其特征是：所述步骤（6）具体为：把联苯菊酯半抗原偶联的载体蛋白溶液以1.2μl/cm的量喷在纤维素膜的下侧，作为检测线；把兔抗鼠IgG以1.2μl/cm的量喷在纤维素膜的上侧，作为对照线。
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