CN1948965A - 呋喃唑酮代谢物胶体金层析检测试纸条和试纸卡 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种呋喃唑酮代谢物胶体金层析检测试纸条和试纸卡。试纸条含有衬板、样品垫、金标结合垫、纤维素膜、吸水垫，在试纸条的两端粘贴有保护膜，金标结合垫为吸附呋喃唑酮代谢物AOZ金标抗体或AOZ衍生物金标抗体的玻璃纤维棉，在纤维素膜上有用AOZ－载体蛋白偶联物或AOZ衍生物－载体蛋白偶联物印制的直线式隐形检测线，用羊抗或兔抗小鼠IgG、或羊抗兔IgG印制的直线式隐形对照线，两条线平行排列组合为“丨丨”。将不带保护膜的试纸芯放在特制的塑料卡中，即得到试纸卡，塑料卡的面板上设有加样孔和结果显示窗。本发明的试纸条和试纸卡具有特异性强、灵敏度高、简便、快速、直观、准确的特点，适用范围广，成本低，易推广应用。
Description
一、技术领域：本发明涉及一种检测微量呋喃唑酮代谢物(3-氨基-2-恶唑烷酮，AOZ)的器具，特别是涉及一种呋喃唑酮代谢物残留分析的胶体金层析检测试纸条和试纸卡。
二、技术背景：呋喃唑酮(Furazolidone，FZ)，又名痢特灵，是一种人工合成的硝基呋喃类广谱抗菌药物，对多种革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌及某些原虫和真菌具有抑制或杀灭效果，而且药效稳定，在畜禽和水产养殖中得到了广泛的应用。但毒理学研究发现，呋喃唑酮及其代谢产物3-氨基-2-恶唑烷酮(3-amino-2-oxazolidinone，AOZ)均有很强的毒副作用，可致癌、致突变，可引起溶血性贫血、血小板减少性紫癜、多发性神经炎等多种疾病。1995年欧盟首先禁止呋喃唑酮在畜禽和水产养殖中使用，随后美国、日本、澳大利亚等国将呋喃唑酮列为禁用药，我国农业部2002年3月颁布的《食品动物禁用的兽药及其它化合物清单》(农牧发[2002]1号)中将呋喃唑酮列为禁用药。呋喃唑酮是我国食品安全监控的主要药物之一。
尽管我国严禁呋喃唑酮用于畜牧、水产养殖业，但由于其药效确切，价格低廉，目前在畜牧和水产养殖中违禁使用现象仍较严重。呋喃唑酮在食品动物中的残留不仅直接危害食用者的身体健康，同时还严重制约我国动物性食品出口，造成了巨大的经济损失。
由于呋喃唑酮在动物体内很快代谢为AOZ，AOZ与组织蛋白结合且在体内滞留时间长，被视为呋喃唑酮残留的标示物。通过检测母体药物不能判定呋喃唑酮的实际残留情况，因此检测呋喃唑酮残留的最佳方法是检测其代谢物(AOZ)而并非母体药物本身。
目前，用于AOZ残留检测的方法主要有理化分析法和酶联免疫分析法(ELISA)等。理化分析法主要是高压液相色谱(HPLC)、液相色谱-质谱联用(LC-MS)等。理化分析法灵敏度高，结果准确，但是样品需经一系列复杂的处理净化，繁琐费时，所需仪器设备价格昂贵，而且只有特定的专业技术人员才能操作，不能进行现场检测，时效性差，难以推广。ELISA法以竞争性酶联免疫反应为检测原理，反应显色后用酶标仪测定OD值进行结果判定。缩短了检测时间，可以定性定量检测。但ELISA方法需要配套的酶标仪和配套试剂，操作过程仍较复杂，而且国内现处在研发阶段，进口国外产品价格昂贵，因而ELISA方法的应用受到了较大限制。
三、内容：
本发明的目的：研制出特异、敏感、快速、简便的呋喃唑酮代谢物(AOZ)残留检测试纸条和试纸卡。
本发明的技术方案是：
一种呋喃唑酮代谢物胶体金层析检测试纸条，含有衬板和在衬板上依次衔接的样品垫、金标结合垫、包被膜、吸水垫，在试纸条的两端粘贴有保护膜，金标结合垫为吸附AOZ金标抗体的玻璃纤维棉，在包被膜上有用AOZ偶联的载体蛋白溶液印制的直线式隐形检测线，用羊抗或兔抗小鼠IgG、或羊抗兔IgG溶液印制的直线式隐形对照线，两条线平行排列组合为“| |”。
一种呋喃唑酮代谢物胶体金层析检测试纸条，含有衬板和在衬板上依次衔接的样品垫、金标结合垫、包被膜、吸水垫，在试纸条两端粘贴有保护膜，金标结合垫为吸附AOZ衍生物金标抗体的玻璃纤维棉，在包被膜上有用AOZ衍生物偶联的载体蛋白溶液印制的直线式隐形检测线，用羊抗或兔抗小鼠IgG、或羊抗兔IgG溶液印制的直线式隐形对照线，两条线平行排列组合为“| |”。
一种呋喃唑酮代谢物胶体金层析检测试纸卡，含有衬板、样品垫、金标结合垫、包被膜和吸水垫组成试纸芯，试纸芯放在特制的塑料卡中，金标结合垫为吸附AOZ金标抗体的玻璃纤维棉，在包被膜上有用AOZ偶联的载体蛋白溶液印制的直线式隐形检测线，用羊抗或兔抗小鼠IgG、或羊抗兔IgG溶液印制的直线式隐形对照线，两条线平行排列组合为“| |”。
一种呋喃唑酮代谢物胶体金层析检测试纸卡，含有衬板、样品垫、金标结合垫、包被膜和吸水垫组成试纸芯，试纸芯放在特制的塑料卡中，金标结合垫为吸附AOZ衍生物金标抗体的玻璃纤维棉，在包被膜上有用AOZ衍生物偶联的载体蛋白溶液印制的直线式隐形检测线，用羊抗或兔抗小鼠IgG、或羊抗兔IgG溶液印制的直线式隐形对照线，两条线平行排列组合为“| |”。
所述的衬板为不吸水的韧性材料，样品垫为玻璃纤维棉、尼龙膜、聚偏二氟乙烯膜、或聚酯膜，吸水垫为吸水能力较强的吸水滤纸或滤油纸，韧性材料为硬质塑胶条、或不吸水硬纸条，包被膜为硝酸纤维素膜、纯纤维素膜、或羧化纤维素膜，所述的保护膜为不透明的胶膜。
所述的AOZ金标抗体为胶体金标记的AOZ单克隆抗体或多克隆抗体，AOZ衍生物金标抗体为胶体金标记的AOZ衍生物单克隆抗体或多克隆抗体。
所述的偶联AOZ或偶联AOZ衍生物的载体蛋白为：牛血清白蛋白BSA、鸡卵清白蛋白OVA、人血清白蛋白HSA。
所述的试纸条，在样品垫、金标结合垫及吸水垫上覆盖有保护膜，样品垫、金标结合垫对应的保护膜上印制有待测样品标记线，该标记线偏向样品垫一侧约0.5cm处。
所述的塑料卡由底座和面盖嵌合在一起构成，底座上有放试纸芯的固定槽以及与面盖相结合的卡齿，面盖有观察窗和加样孔以及与底座相结合的卡齿，观察窗与试纸芯的包被膜相对应，加样孔与试纸芯的样品垫相对应，在观察窗旁边分别印有T和C，T表示检测线，在靠近加样孔侧，C表示对照线，在远离加样孔侧。
本发明的检测试纸条和试纸卡具有下列优点：
①特异性强，敏感性高。该胶体金层析检测试纸条和试纸卡以胶体金标记高亲和力的单克隆抗体为基础制备而成，金标抗体中金颗粒与抗体分子之间无共价键形成，二者通过异性电荷间的范德华力相结合，胶体金标记对单克隆抗体的特异性和亲和力影响很小，且具有较高的标记率。因此，试纸条和试纸卡具有较强的特异性和较高的敏感性，检出最低限量可达到1～5ppb。
②简便、快速、时效性强。使用胶体金层析检测试纸条和试纸卡，无需任何其它试剂和仪器，可现场操作，试纸条(卡)加入被检样品液后，在10分钟内即可判定检测结果。
③结果显示形象、直观、准确。检测试纸条和试纸卡均以显示棕红色线“|”和“| |”作为检测结果阳性和阴性标记，即在包被膜上显示一条棕红色线“|”时，表示在被检样品中含有被检物，显示两条棕红色线“| |”时，表示在被检样品中不含被检物。结果判定形象、直观、准确，简单明了，不易出现假阳性和假阴性等人为误判。
④节省费用，适用范围广，便于推广。使用检测试纸条和试纸卡，比用仪器分析和进口ELISA试剂盒的费用大幅下降。另外，试纸条和试纸卡的适用范围广，可满足不同层次人员需要，包括专业检验，海关检疫，卫生检疫，质量监测，加工企业和养殖场户等，便于推广应用，具有广阔的市场前景和明显的经济、社会效益。
四、附图说明：
图1、呋喃唑酮代谢物胶体金层析检测试纸条俯视结构示意图。
图2、呋喃唑酮代谢物胶体金层析检测试纸条剖面结构示意图。
图3、呋喃唑酮代谢物胶体金层析检测试纸卡俯视结构示意图。
图4、呋喃唑酮代谢物胶体金层析检测试纸卡剖面结构示意图。
图中，1：衬板，2：样品垫，3：金标物结合垫，4：包被膜，5：检测线，6：对照线，7：吸水垫，8-1：样品浸入端保护膜，8-2：手柄端保护膜，9：标识线，10：加样孔，11：观察窗，12：面板，13：试纸芯固定槽，14：底座。
五、具体实施方式：
要制成呋喃唑酮代谢物检测试纸条和试纸卡，首先需要制备偶联呋喃唑酮代谢物载体蛋白和呋喃唑酮代谢物衍生物载体蛋白，用于制备相应的检测线和抗体；而且需要制备呋喃唑酮代谢物金标抗体和呋喃唑酮代谢物衍生物金标抗体，用于制备相应的金标抗体纤维棉；另外需要制备羊抗或兔抗小鼠IgG(或羊抗兔IgG)抗体，用于制备对照线。
1、呋喃唑酮代谢物(AOZ)与载体蛋白偶联
采用戊二醛法，将AOZ与载体蛋白BSA进行偶联制备人工结合抗原AOZ-BSA。具体制备方法如下：称取BSA30mg溶于5ml pH7.4的0.01mol/L磷酸缓冲液(PBS)中，搅拌下加入AOZ 5～6mg，缓慢滴加25％戊二醛溶液0.1ml，磁力搅拌反应4～6h。5000r/min离心10min，收集上清液装入透析袋，在4℃下用0.01mol/L(pH7.4)的PBS透析72h，每天更换透析液2～3次。最后收集透析袋内的橙黄色溶液过葡聚糖凝胶层析柱(SephadexG-25)进一步提纯，制得人工结合抗原AOZ-BSA，保存于-20℃冰箱备用。
同法，用OVA或HSA替代BSA制得人工结合抗原AOZ-OVA或AOZ-HSA。
2、AOZ衍生物与载体蛋白偶联
碳二亚胺法：将AOZ对醛基苯甲酸衍生物(CPAOZ)与载体蛋白BSA进行偶联制备人工结合抗原CPAOZ-BSA。具体制备方法如下：称取BSA 100mg溶于6ml pH7.4的0.01mol/L PBS中，加入N，N-二甲基甲酰胺(DMF)1ml，搅拌溶解；称取CPAOZ 14mg溶于1.2ml二甲基甲酰胺(DMF)中，搅拌下加入二环己基碳二亚胺(DCC)16.5mg和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)8.5mg，4℃下磁力搅拌反应过夜，5000r/min离心10min，取上清液并在磁力搅拌下逐滴加入上液中，4℃下密封搅拌反应4～6h，5000r/min离心10min，收集上清液装入透析袋，在4℃下用pH7.4的PBS透析72h，每天更换透析液2～3次。最后收集透析袋内的无色CPAOZ-BSA溶液，保存于-20℃冰箱备用。
同法，用OVA或HSA替代BSA制得人工结合抗原CPAOZ-OVA或CPAOZ-HSA。
混合酸酐法：冰浴条件下进行，将CPAOZ 8.2mg溶解在0.8ml DMF中，搅拌加入三丁胺30ul，反应30min，再加入氯甲酸异丁酯20μl反应1h，而后加入载体蛋白BSA溶液(BSA50mg溶于2ml pH为7.4的0.01mol/LPBS中)反应过夜，终止反应。收集反应物装入透析袋，在4℃下用0.01mol/L(pH7.4)的PBS透析3天，每天更换透析液2～3次。最后收集透析好的反应物过SephadexG-25层析柱进一步提纯，制得人工结合抗原CPAOZ-BSA，保存于-20℃冰箱备用。
同法，用OVA或HSA替代BSA制得人工结合抗原CPAOZ-OVA或CPAOZ-HSA。
3、抗AOZ单克隆抗体或多克隆抗体的制备
单抗制备：以50μg～100μg/只的AOZ-载体蛋白结合抗原免疫8周龄BALB/c小鼠3～4次，每次免疫间隔时间3～5周，最后一次超强免疫后3～4天，无菌取其脾细胞并与NS0骨髓瘤细胞杂交融合，置37℃、5％CO2培养箱中培养。培养10～14天，用间接ELISA方法选择强阳性、抑制率高、细胞生长旺盛的孔进行3次有限稀释克隆化，而后扩大培养，建立杂交瘤细胞株，其分泌的单克隆抗体可特异地与AOZ反应。以体内诱生法进行单抗制备，以辛酸-硫酸铵法提纯单抗，-20℃冻存备用。
多抗制备：用AOZ-载体蛋白结合抗原免疫新西兰白兔，免疫剂量为200μg～500μg/次，背部皮下分4～6点注射。首免，用AOZ-载体蛋白结合抗原与等量弗氏完全佐剂(FCA)混合，充分乳化；加强免疫，用AOZ-载体蛋白结合抗原与等量弗氏不完全佐剂(FIA)混合，充分乳化，首免后2～3周进行，连续免疫4～5次，每次间隔2～3周，最后一次免疫后10～15天，以ELISA法测其定效价达到105以上时，采血并分离收集高免血清。以饱和硫酸铵盐析法提取IgG抗体，-20℃冻存备用。
4、抗AOZ衍生物单克隆抗体或多克隆抗体的制备
参照抗AOZ单克隆抗体或多克隆抗体的制备方法，以AOZ衍生物载体蛋白结合抗原替代AOZ载体蛋白结合抗原，制备抗AOZ衍生物单克隆抗体或多克隆抗体。
5、金标抗体和金标物结合垫的制备
①AOZ金标抗体和金标物结合垫的制备：采用柠檬酸钠还原法制备胶体金溶液，即在沸腾的200ml 0.01～0.02％氯金酸溶液中加入新鲜配制的1％柠檬酸三钠8ml，获得直径约15nm的胶体金溶液，用0.1mol/L K2CO3调pH值至8.5～9.5，置2～8℃保存备用。以1∶2000的标记比将待标记的抗AOZ单克隆抗体或多克隆抗体加入pH8.5～9.5的金溶胶中，标记10min后，加入20％的PEG10000至终浓度为0.05％，4℃、1500～2000rpm离心20min，除去未结合的胶体金颗粒，4℃、15000rpm离心1h，弃上清，获初步纯化的金标抗体蛋白混合物，再用丙烯葡聚糖S-400柱层析进行分离纯化，获得AOZ胶体金标记抗体。将1∶100～500稀释的胶体金标记抗体(单克隆抗体或多克隆抗体)吸附于精制玻璃纤维棉中，4℃低温真空干燥，制备AOZ金标物结合垫。
②AOZ衍生物金标抗体和金标物结合垫的制备：参照AOZ金标抗体和金标物结合垫的制备方法，以AOZ衍生物单克隆抗体或多克隆抗体替代AOZ单克隆抗体或多克隆抗体，制备AOZ衍生物金标抗体和金标物结合垫。
6、羊抗或兔抗小鼠IgG(或羊抗兔IgG)抗体的制备
以饱和硫酸铵法提取AOZ及其AOZ衍生物阴性小鼠血清IgG(或阴性兔血清IgG)。即取1份小鼠血清(或兔血清)加2份PBS(pH7.2)混匀，加等体积饱和硫酸铵溶液混匀，置4℃冰箱12h，4℃、2500rpm离心15min，弃上清；再以适量PBS(pH7.2)溶解沉淀，加饱和硫酸铵溶液至终浓度33％，置4℃冰箱2h，4℃、2500rpm离心15min，弃上清，以适量PBS(pH7.2)溶解沉淀，置4℃冰箱内用PBS(pH7.2)透析48h，中间换液3次，4℃、12000rpm离心15min，收集上清，以紫外分光光度计测定其蛋白浓度。以提取的小鼠血清(或兔血清)IgG按50～100μg/kg体重经皮下和肌肉注射健康山羊或家兔3～4次，末次注射10天后，以ELISA测定其血清效价达到1∶2000以上时，心脏或动脉采血，分离收集高免血清。以饱和硫酸铵法提取羊抗或兔抗小鼠IgG(或羊抗兔IgG)抗体(方法与提取小鼠血清IgG相同，不再重述)，用于胶体金层析检测试纸条和试纸卡对照线的制备。
7、检测试纸条和试纸卡检测反应原理
当快速检测试纸条和试纸卡测试端加入待测样品溶液后，待测溶液通过虹吸作用带动待测物及金标物结合垫中的金标抗体一起向包被膜扩散，并最终渗入手柄端吸水滤纸。在扩散过程中，待测物可与金标抗体相结合，进而封闭金标抗体上待测物的抗原结合点，阻止金标抗体与包被膜上偶联载体蛋白抗原的检测线结合，检测线不能显色，而羊或兔抗小鼠IgG(或羊抗兔IgG)抗体则可与金标抗体结合，形成一条棕红色对照线“|”，为阳性表示。反之样品溶液中无待测物则不能阻止金标抗体与包被膜上偶联载体蛋白抗原的检测线结合，显示棕红色检测线“|”，同样羊抗或兔抗小鼠IgG(或羊抗兔IgG)抗体也与金标抗体结合，显示棕红色对照线“|”，这样形成两条棕红色线“| |”，为阴性表示。如果包被膜上没有棕红色线显示，则表明试纸条已失效。
实施例一、AOZ检测试纸条，参见图1和图2。图中1为衬板，用硬质塑胶条制成；2为样品垫，用玻璃纤维棉制成；3为金标物结合垫，根据上述具体实施方式“5”所述的制备方法，制备吸附有胶体金标记的抗AOZ单克隆抗体玻璃纤维棉；4为包被膜，采用硝酸纤维素膜；5为隐形检测线，用AOZ-载体蛋白偶联物在包被膜上印制成“|”，载体蛋白为牛血清白蛋白BSA；6为隐形对照线，用兔抗小鼠IgG抗体溶液在包被膜上印制成“|”，两条线平行排列组合为“| |”；7为手柄端的吸水垫，用吸水滤纸制成。将2、3、4、7从右至左依次粘贴固定在塑胶薄片条1上，彼此之间交界处纤维互相搭接。8-1为覆盖在样品垫2和金标物结合垫3上面的样品端白色保护膜，8-2为覆盖在吸水垫7上面的手柄端其它颜色保护膜(如黄色)，9为测试样品的带箭头标示线，即在样品垫2与金标物结合垫3交界处对应的白色保护膜偏向样品垫一侧约0.5cm处印制的标示线，在标示线右侧保护膜上印有箭头及MAX字样。
试纸条适于检测的样品及其检测操作方法与结果判定：
检测样品可为组织样、蛋样、蜂蜜样和奶样。
检测样品制备：
①组织样和蛋样将样品匀浆后，称取1g样品加入5ml甲醇/乙醇/乙醚(1∶1∶1)提取液，5000r/min离心10min，取上清液；沉淀中再加入5ml甲醇/乙醇/乙醚提取液，5000r/min离心10min，取上清液，收集两次上清液混匀后，用N2吹干，加入5ml 0.15mol/L pH 7.4的PBS稀释，用于检测分析。
②奶样取奶样2ml在15℃条件下3000r/min离心5min，除去上层脂肪，取下层液，加入5ml甲醇/乙醇/乙醚(1∶1∶1)提取液，5000r/min离心10min，取上清液；沉淀中再加入5ml甲醇/乙醇/乙醚提取液，5000r/min离心10min，取上清液，收集两次上清液混匀后，用N2吹干，加入5ml 0.15mol/L pH 7.4的PBS稀释，用于检测分析。
③蜂蜜样取蜂蜜样品2g，加入5ml甲醇/乙醇/乙醚(1∶1∶1)提取液，5000r/min离心10min，取上清液；沉淀中再加入5ml甲醇/乙醇/乙醚提取液，5000r/min离心10min，取上清液，收集两次上清液混匀后，用N2吹干，加入5ml 0.15mol/L pH 7.4的PBS稀释，用于检测分析。
检测操作方法：将AOZ胶体金层析检测试纸条样品端插入待测样品液中，插入深度不超过标记线，约10～20秒钟取出检测试纸条，水平放置，5～10分钟观察判定检测结果。
结果判定：①阳性如果在包被膜上显示有一条棕红色线“|”，表示检测结果为阳性，说明在待测样品中含有AOZ；②阴性如果在包被膜上显示有两条棕红色线“| |”，表示检测结果为阴性，说明在待测样品中不含AOZ；③失效如果在包被膜上没有棕红色线显示，则表明试纸条已失效。
实施例二、AOZ检测试纸卡：参见图3、图4。图中1、2、3、4、5、6和7分别为衬板、样品垫、金标物结合垫、包被膜、隐形检测线、隐形对照线和吸水垫，其制备方法与实施例一相同，组成试纸芯；14为塑料制成的试纸卡底座，试纸芯固定在底座的固定槽13中；12为塑料制成的试纸卡面板，其上的加样孔10与试纸芯的样品垫相对应，是滴加待检样品的位置；在面板上的观察窗11与试纸芯的包被膜相对应，是观察判定结果的窗口，其旁边印有T和C，分别与包被膜上的检测线和对照线相对应。
检测样品及检测样品制备和实施例一相同。
检测时，将试纸卡平放，从加样孔滴加待测样品液，5～10分钟从观察窗判定检测结果。
结果判定：如在包被膜上对应T的位置显示有一条棕红色线“|”时，表示检测结果为阳性，说明在待测样品中含有AOZ；如在包被膜上对应T、C的位置显示有两条棕红色线“| |”时，表示检测结果为阴性，说明在待测样品中不含AOZ；如在包被膜上没有棕红色线显示，则表明试纸条已失效。
实施例三、检测试纸条结构和实施例一基本相同，不同之处在于：以抗AOZ多克隆抗体替代抗AOZ单克隆抗体，制备AOZ金标抗体和金标物结合垫；偶联AOZ的载体蛋白为鸡卵清白蛋白OVA，用羊抗兔IgG替代兔抗小鼠IgG抗体溶液在包被膜上制备对照线“|”。
其它包括检测样品、操作方法和结果判定等均同实施例一，不再重述。
实施例四、检测试纸卡结构和实施例二基本相同，不同之处在于：以抗AOZ多克隆抗体替代AOZ单克隆抗体，制备AOZ金标抗体和金标物结合垫；偶联AOZ的载体蛋白为鸡卵清白蛋白OVA，用羊抗兔IgG替代兔抗小鼠IgG抗体溶液在包被膜上制备对照线“|”。
其它包括检测样品、操作方法和结果判定等均同实施例二，不再重述。
实施例五、检测试纸条结构和实施例一基本相同，不同之处在于：以抗AOZ对醛基苯甲酸衍生物(CPAOZ)单克隆抗体替代抗AOZ单克隆抗体，制备AOZ衍生物金标抗体和金标物结合垫；用AOZ-衍生物载体蛋白偶联物替代AOZ-载体蛋白偶联物在包被膜上制备检测线“|”，偶联AOZ衍生物的载体蛋白为人血清白蛋白HSA。
检测样品制备：
①组织样和蛋样将样品匀浆后，按每克样品加入10ml 0.125mol/L的HCL及1.0ml 4mg/ml的2-硝基苯甲醛溶液，置37℃水浴中振荡16h(过夜)，用1mol/LNaOH调pH至7.0～7.5；再加入5ml正己烷，混匀搅拌10min，4℃条件下5000r/min离心10min，弃去上层正己烷溶液层，下层溶液加乙酸乙酯8ml，旋转振荡10min，4℃条件下5000r/min离心10min，用N2吹干，加入5mL含0.05％吐温-20的PBS(pH 7.4，0.15mol/L)稀释，用于检测分析。
②奶样取奶样2ml在15℃条件下3000r/min离心5min，除去上层脂肪，取下层液，加入10ml 0.125mol/L的HCL及1.0ml 4mg/ml的2-硝基苯甲醛溶液，置37℃水浴中振荡16h(过夜)，用1mol/L NaOH调pH至7.0～7.5；再加入正己烷5ml，搅拌10min，4℃条件下5000r/min离心10min，弃去上层正己烷溶液层，下层溶液加乙酸乙酯8ml，旋转振荡10min，4℃条件下5000r/min离心10min，用N2吹干，加入5ml含0.05％吐温-20的PBS(pH 7.4，0.15M)稀释，用于检测分析。
③蜂蜜样取蜂蜜样品2g，加入10ml 0.125mol/L的HCL及1.0ml 4mg/ml的2-硝基苯甲醛溶液，置37℃水浴中振荡16h(过夜)，用1mol/L NaOH调pH至7.0～7.5；再加入正己烷5ml，搅拌10min，4℃条件下5000r/min离心10min，弃去上层正己烷溶液层，下层溶液加乙酸乙酯8ml，旋转振荡10min，4℃条件下5000r/min离心10min，用N2吹干，加入5ml含0.05％吐温-20的PBS(pH 7.4，0.15M)稀释，用于检测分析。
其它包括检测操作方法和结果判定等均同实施例一，不再重述。
实施例六、检测试纸条结构和实施例一基本相同，不同之处在于：以抗AOZ对醛基苯甲酸衍生物(CPAOZ)多克隆抗体替代抗AOZ单克隆抗体，制备AOZ衍生物金标抗体和金标物结合垫；用AOZ-衍生物载体蛋白偶联物替代AOZ-载体蛋白偶联物在包被膜上制备检测线“|”，偶联AOZ衍生物的载体蛋白为人血清白蛋白HSA，用羊抗兔IgG替代兔抗小鼠IgG抗体溶液在包被膜上制备对照线“|”。
其它包括检测样品、操作方法和结果判定等均同实施例五，不再重述。
实施例七、检测试纸卡结构和实施例二基本相同，不同之处在于：以抗AOZ对醛基苯甲酸衍生物(CPAOZ)单克隆抗体替代抗AOZ单克隆抗体，制备AOZ衍生物金标抗体和金标物结合垫；用AOZ衍生物-载体蛋白偶联物替代AOZ-载体蛋白偶联物在包被膜上制备检测线“|”，偶联AOZ衍生物的载体蛋白为鸡卵清白蛋白OVA。
其它包括检测样品、操作方法和结果判定等均同实施例五，不再重述。
实施例八、检测试纸卡结构和实施例二基本相同，不同之处在于：以抗AOZ对醛基苯甲酸衍生物(CPAOZ)多克隆抗体替代抗AOZ单克隆抗体，制备AOZ衍生物金标抗体和金标物结合垫；用AOZ衍生物-载体蛋白偶联物替代AOZ-载体蛋白偶联物在包被膜上制备检测线“|”，用羊抗兔IgG替代兔抗小鼠IgG抗体溶液在包被膜上制备对照线“|”，偶联AOZ衍生物的载体蛋白为鸡卵清白蛋白OVA。
其它包括检测样品、操作方法和结果判定等均同实施例五，不再重述。
Claims (8)
1.一种呋喃唑酮代谢物胶体金层析检测试纸条，含有衬板和在衬板上依次衔接的样品垫、金标结合垫、包被膜、吸水垫，在试纸条的两端粘贴有保护膜，其特征是：金标结合垫为吸附AOZ金标抗体的玻璃纤维棉，在包被膜上有用AOZ偶联的载体蛋白溶液印制的直线式隐形检测线，用羊抗或兔抗小鼠IgG、或羊抗兔IgG溶液印制的直线式隐形对照线，两条线平行排列组合为“||”。
2.一种呋喃唑酮代谢物胶体金层析检测试纸条，含有衬板和在衬板上依次衔接的样品垫、金标结合垫、包被膜、吸水垫，在试纸条两端粘贴有保护膜，其特征是：金标结合垫为吸附AOZ衍生物金标抗体的玻璃纤维棉，在包被膜上有用AOZ衍生物偶联的载体蛋白溶液印制的直线式隐形检测线，用羊抗或兔抗小鼠IgG、或羊抗兔IgG溶液印制的直线式隐形对照线，两条线平行排列组合为“||”。
3.一种呋喃唑酮代谢物胶体金层析检测试纸卡，含有衬板、样品垫、金标结合垫、包被膜和吸水垫组成试纸芯，试纸芯放在特制的塑料卡中，其特征是：金标结合垫为吸附AOZ金标抗体的玻璃纤维棉，在包被膜上有用AOZ偶联的载体蛋白溶液印制的直线式隐形检测线，用羊抗或兔抗小鼠IgG、或羊抗兔IgG溶液印制的直线式隐形对照线，两条线平行排列组合为“||”。
4.一种呋喃唑酮代谢物胶体金层析检测试纸卡，含有衬板、样品垫、金标结合垫、包被膜和吸水垫组成试纸芯，试纸芯放在特制的塑料卡中，其特征是：金标结合垫为吸附AOZ衍生物金标抗体的玻璃纤维棉，在包被膜上有用AOZ衍生物偶联的载体蛋白溶液印制的直线式隐形检测线，用羊抗或兔抗小鼠IgG、或羊抗兔IgG溶液印制的直线式隐形对照线，两条线平行排列组合为“||”。
5.根据权利要求1～4中任一项所述的试纸条或试纸卡，其特征是：所述的衬板为不吸水的韧性材料；所述的样品垫为玻璃纤维棉，或为尼龙膜，或为聚偏二氟乙烯膜，或为聚酯膜；所述的吸水垫为吸水能力较强的吸水滤纸或滤油纸；所述的韧性材料为硬质塑胶条，或不吸水硬纸条；所述的包被膜为硝酸纤维素膜，或为纯纤维素膜，或为羧化纤维素膜；所述的保护膜为不透明的胶膜。
6.根据权利要求1～4中任一项所述的试纸条或试纸卡，其特征是：所述的AOZ金标抗体为胶体金标记的AOZ单克隆抗体或多克隆抗体，AOZ衍生物金标抗体为胶体金标记的AOZ衍生物单克隆抗体或多克隆抗体，所述的偶联AOZ或偶联AOZ衍生物的载体蛋白为牛血清白蛋白BSA，或为鸡卵清白蛋白OVA，或为人血清白蛋白HSA。
7.根据权利要求1或2所述的试纸条，其特征是：在样品垫、金标结合垫及吸水垫上覆盖有保护膜，样品垫、金标结合垫对应的保护膜上印制有待测样品标记线，该标记线偏向样品垫一侧约0.5cm处。
8.根据权利要求3或4所述的试纸卡，其特征是：所述的塑料卡由底座和面盖嵌合在一起构成，底座上有放试纸芯的槽以及与面盖相结合的卡齿，面盖有观察窗和加样孔以及与底座相结合的卡齿，观察窗与试纸芯的包被膜相对应，加样孔与试纸芯的样品垫相对应，在观察窗旁边分别印有T和C，T表示检测线，在靠近加样孔侧，C表示对照线，在远离加样孔侧。
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