CN101059513A - 检测食品中药物残留的方法及其设备 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种检测药物或毒素残留的免疫层析设备，其包括，包含胶体金属标记的药物或毒素抗体的固相介质以及连接于所述固相介质一端的纤维膜，所述纤维膜上固定有药物或毒素。本发明还公开了胶体金属标记的药物或毒素抗体的制备方法。本发明还公开了使用上述免疫层析设备进行检测药物或毒素残留的方法。本发明的检测方法灵敏度高。

Description

检测食品中药物残留的方法及其设备

技术领域

本发明主要涉及检测动物性食品中药物或毒素残留的设备和方法，尤其是针对检测莱克多巴胺的试纸及其应用方法。本发明还涉及上述检测设备以及其中关键的胶体金属的制造方法。

背景技术

在供食用的动物的养殖中，违规使用或过量使用莱克多巴胺、盐酸克伦特罗、氯霉素等药物的现象屡见不鲜，有些甚至造成了严重的人民健康损害；而且，检测其中有意或无意导致的肉毒素等毒素的残留也是很有必要的，因此需要有高效、灵敏的检测手段才能有效防止这样的动物食品流入消费市场。例如，莱克多巴胺(Ractopamine，本文中缩写为Rac)是一种苯乙醇胺类β2-肾上腺素受体激动剂，可选择性激动平滑肌的β2受体，临床上主要用于治疗支气管哮喘、心力衰竭症和肌肉萎缩症等。其由美国礼来公司研制成功。尽管在2000年美国FDA批准其作为新型饲料添加剂应用于动物生产，但是有研究表明，动物日粮中莱克多巴胺的添加量为临床治疗剂量的5～10倍时，动物体内的营养成分由脂肪向肌肉转移，表现出营养再分配效应，进而调控动物体的物质代谢，增强脂肪分解，促进蛋白质合成，显著提高胴体瘦肉率和饲料报酬，且对猪的饲养效应尤为明显。因而，为追求更大的养殖效益，众多养殖场不断提高动物日粮中莱克多巴胺的添加量，甚至使其达到μg级，其滥用及在动物性食品中的残留严重危害人们的健康和生命安全。目前，除美国外，我国和世界上绝多数国家都严禁莱克多巴胺用作饲料添加剂。尽管我国农业部第176号公告规定莱克多巴胺为严禁在饲料和动物饮用水中使用的药物，但由于经济效益明显，莱克多巴胺非法滥用现象仍然存在。因此，对动物性食品中莱克多巴胺残留进行严格检测非常必要。盐酸克伦特罗(俗称瘦肉精)更是当前多见诸报端的严重威胁人们的饲料添加剂，多为不法商人所使用。

目前莱克多巴胺、盐酸克伦特罗等残留的检测主要方法有高压液相色谱法、气相色谱法、气质联用法、ELISA法等，这些方法虽然能对动物尿液或组织中的莱克多巴胺残留进行准确有效的检测，但检测时间长，检测费用高，对检测人员的技术要求高，需要检测实验室，尤其不能进行现场检测。因而，这些手段不适合我国广大基层检测单位进行大批量样品筛查与现场检测的要求。如CN1766630A、CN1687783A公开的酶联免疫试剂盒在使用时需要经过样品前处理、装柱、过柱、洗脱、显色和/或制备标准曲线等步骤，不便于现场检测和大量筛查。

而以免疫层析技术的胶体金属为基础的设备及其检测方法(如常用的快速检测试纸)刚好能够符合以上要求。目前已有许多文献公开了这样的技术。例如，CN1279360C、CN1790025A、CN 1847851A、CN 1888906A、CN1300584C、CN1818656A分别公开了利用免疫层析技术的胶体金为基础莱克多巴胺、盐酸克伦特罗、肉毒素等药物或毒素的检测方法和设备(如，快速检测试纸、卡片等)，它们的全文纳入本文参考。

然而，以上现有技术会有如下几个缺点：1，胶体金属标记的药物或毒素抗体中混有未标记的药物或毒素抗体，在制成检测设备后会竞争性抑制检测样品中的药物或毒素，或混有未与抗体结合的胶体金属，通过位阻效应影响样品中的药物或毒素和胶体金属标记的抗体的结合速度，干扰检测结果；2，在混合抗体与胶体使它们结合时，由于局部抗体的浓度较高，先接触抗体的胶体金会结合上多个抗体，而后接触抗体的胶体金颗粒可能结合1个抗体分子或者没有抗体结合上去，因此制成的检测设备中胶体金属标记的药物或毒素抗体的不均一性较高，影响检测结果；3，其中使用的用于进行封闭的BSA或PEG等蛋白质或大分子试剂，会由于空间位阻的存在而在检测中使样品中的药物或毒素不能与标记了的抗体很好地接触，影响了检测的灵敏度。例如，CN1790025A等常规的试纸条生产过程中，用40nm左右的胶体金和一定量的抗体混合，利用胶体金强大的物理吸附作用使得抗体结合到胶体金上，再用PEG等封闭胶体金上的位点；通过多次离心，去处溶液中未与胶体金结合的抗体，得到莱克多巴胺抗体和胶体金的结合物(RacAb-Au)；再将RacAb-Au用缓冲液调成一定浓度并喷到玻璃纤维棉上，然后干燥。这种技术将抗体与胶体金混合后，需要加入BSA或PEG，而且通过简单的离心、复溶来提纯，因此具有以上几种缺点，不利于提高检测的灵敏度和准确性。这样制备出来的莱克多巴胺残留快速检测试纸条在应用过程中会有下列不足：1、样品中莱克多巴胺阴性时，检测线处的红色条带颜色太浅，不利于观察；2、样品中的莱克多巴胺阳性时，检测线处还有微弱的红色条带存在，不能完全消失。

另外，由于药物或毒素残留快速检测试设备(如试纸)的目标是要求在不需要借助任何仪器的条件下用肉眼判断样品中的药物是否超标。因此，如果样品中药物浓度超标时，而检测线处的红色条带太浅或消失，则这种情况的出现对检测人员的判断有严重干扰，很可能认为样品是阴性的，造成漏检。这些情况在实际应用中使得检测人员觉得无所适从，妨碍了快速检测试设备(如试纸)的推广应用，并损害了对违禁药物的控制力度。因此，很有必要对这些设备的不足之处进行改进。

为此，本发明人进行了长期研究，首先提出了现有技术中的上述缺点，然后分析了造成这些缺点的原因，最终令人意外地发现了利用层析法提高抗体和胶体金属复合物均一性的制备方法是解决这些问题的关键。而且，由于抗体是二价的，两个来药物或毒素分子可以结合一个抗体分子而显示出其上标记的胶体金属，因此如果能够一个单位的胶体金属结合一个抗体分子，而不使或过多混入多个单位的胶体金属结合一个抗体分子从而无需更多的药物或毒素分子来使这个单位的胶体金属被显示出，则这种方法也降低了胶体金属结合抗体分子数量，故而能够提高检测的灵敏度。据此，我们开发了一种利用层析法制备/纯化抗体和胶体金属复合物的技术，并将由此获得的复合物作为原料制备检测动物性食品中药物或毒素残留的设备，另外还提供了使用该设备的方法。

发明内容

本发明的目的在于提供检测药物或毒素残留的设备以及使用这种设备进行检测的方法。这种设备中应用了经过层析纯化的胶体金属标记的药物或毒素抗体，因此能有效克服现有技术种的缺陷。本发明的目的还在于提供制备这种胶体金属标记的药物或毒素抗体的方法及其得到的产品。

具体而言，在第一方面，本发明提供了检测药物或毒素残留的免疫层析设备，其包括，包含胶体金属标记的药物或毒素抗体的固相介质以及连接于所述固相介质一端的纤维膜，所述纤维膜上固定有药物或毒素，其特征在于，

其中胶体金属标记的药物或毒素抗体由如下方法制备：

1)将胶体金属与药物或毒素抗体混合，形成胶体金属与药物或毒素抗体的复合物；和

2)层析纯化上述复合物；

或者，其中胶体金属标记的药物或毒素抗体由如下方法制备：

1)将胶体金属与抗药物或毒素抗体的抗体混合，形成胶体金属与抗药物或毒素抗体的抗体的复合物；

2)将第1)步得到的复合物与药物或毒素抗体混合，形成胶体金属、抗药物或毒素抗体的抗体与药物或毒素抗体的复合物；和

3)层析纯化第2)步得到的复合物。

在本文中，胶体金属指的是分散相粒子直径介于1～150nm之间的金属溶胶。胶体金属能够对蛋白质等高分子物质(本发明中，尤其是抗体)进行吸附结合，利用这种表面吸附作用，将蛋白质吸附在金属溶胶颗粒表面就得到胶体金属标记的物质。通过选择合适的纤维膜颜色，胶体金属富集时能显示出区别于纤维膜的颜色，从而能够观察。优选的胶体金属选自胶体Ag、Au、Pd、Pt、Rh、Ir、Ru和Os，优选选自胶体金和胶体银，最优选选自胶体金，其颜色呈桔红色或紫红色。通过本领域技术人员熟知的还原法可以制备胶体金属。在本发明的具体实施方式中，将氯金酸(HAuCl₄·3H₂O)在还原剂作用下聚合成金颗粒，由于金颗粒之间的静电作用和布朗运动，便使其保持粒子直径为40nm左右的水溶胶状态，而且该胶体金富含电子和强大的给电子能力，从而以非共价键与抗体结合形成金标记的抗体。

在本文中，抗体是单克隆抗体或多克隆抗体。可利用常规方式制备多克隆抗体，即从接触了所选抗原的动物或人血清中得到。例如，通过用所选择的抗原用常规方法刺激所选择的动物或人的免疫系统，使免疫系统产生天然抗体，然后从动物或人血或其他生物液体中收集这些抗体来制备多克隆抗体。对于单克隆抗体，可利用常规的杂交瘤技术制备。G.Kohler and C.Milstein，Nature，256：495-497(1975)中记载了制备单克隆抗体的方法，目前也有许多公知的改良方法。另外，本领域的技术人员采用公知技术操作动物或人抗体的互补决定区，即可制备出嵌合或人源化的抗体，这也可用作本发明的抗体。目前有些抗体已经商品化了，本发明中也包括使用通过商业途径购买的抗体。在本发明的第一方面，药物或毒素抗体是抗药物或毒素的抗体；抗药物或毒素抗体的抗体是特异结合药物或毒素抗体的抗体，通常是特异结合药物或毒素抗体所属的动物物种的抗体。例如，药物或毒素抗体是鼠抗体，则抗药物或毒素抗体的抗体可以是兔抗鼠抗体或羊抗鼠抗体。

在本文中，由于药物或毒素大多是小分子半抗原，因此常用的方式是将药物或毒素与大分子载体偶连形成完全抗原，从而可被固定在纤维膜上或用于制备相应抗体。与药物或毒素偶连的载体包括蛋白质或其片段、合成或半合成的多肽、或多糖等，尤其常用的有牛血清白蛋白(BSA)、卵清白蛋白、匙孔血蓝蛋白、甲状腺球蛋白、L-多聚赖氨酸、白喉毒素、破伤风毒素、右旋葡聚糖或纤维素。其中，药物或毒素优选是莱克多巴胺、盐酸克伦特罗、氯霉素或肉毒素，优选是莱克多巴胺。在本发明的具体实施方式中，采用竞争法来检测莱克多巴胺。氯金酸(HAuCl₄·3H₂O)在还原剂作用下聚合成金颗粒，由于金颗粒之间的静电作用和布朗运动，使其保持水溶胶状态，胶体金富含电子和强大的给电子能力，以非共价键与莱克多巴胺单克隆抗体或多克隆抗体结合形成胶体金标记的抗体，将该胶体金标记的抗体干燥在玻璃纤维膜上。玻璃纤维膜一端与硝酸纤维膜(NC膜)相连，硝酸纤维膜上固定有莱克多巴胺完全抗原(如Rac-BSA，即莱克多巴胺和牛血清白蛋白通过化学交联而成的抗原)作为检测线，并优选还固定有能与胶体金标记的抗体结合的第二抗体(如在胶体金标记的抗体是兔抗体时，该第二抗体是抗兔的抗体)作为质控线(或参考线)；玻璃纤维膜另一端优选与样品垫相连。加入待测样品后，胶体金标记的抗体重新水化并与样品相互反应，在毛细管的扩散作用下扩散。优选在硝酸纤维膜与玻璃纤维膜相对的另一端连有吸水纸，因此可以胶体金标记的抗体沿着吸水纸方向移动，至检测线时，若样品中不含莱克多巴胺，胶体金标记的抗体就会与硝酸纤维膜上的莱克多巴胺完全抗原反应而被部分截获，金颗粒富集而出现明显直观的红色条带，至质控线时同样会出现红色条带；若样品中含有莱克多巴胺，莱克多巴胺与胶体金标记的抗体反应而占据了金标抗体上有限的莱克多巴胺结合位点，不再与莱克多巴胺完全抗原反应而越过检测线，不出现红色条带，仅在质控线出现红色条带。所以，样品中莱克多巴胺浓度越低，检测线颜色越深；样品中莱克多巴胺浓度越高，检测线颜色越浅。通过颜色的深浅可以判断样品中药物的浓度。免疫金标检测试纸法特异、敏感、快速、简便、直观，适合大量样品的检测和现场检测。

为了克服现有技术的某些缺陷，本发明采用层析法来纯化胶体金属标记的药物或毒素抗体，以此排除未标记的抗体和未结合的胶体金属的干扰，提高产物的均一性。层析技术本身对于技术人员来说是熟知的，甚至有许多已经商品化了。在本发明中，可以采用这些层析技术，优选的层析为分子筛层析(也称为分子尺寸排阻色谱)，更优选选自Sephacryl-S200、Sephacryl-S300、Sephedex G-25和Sephedex G-100，最优选是Sephacryl-S200或Sephacryl-S300。在本发明的具体实施方式中，使用Sephacryl-S200或Sephacryl-S300来纯化胶体金属标记的药物或毒素抗体，收集一个胶体金属结合一个抗体分子的级分。

另外，为了进一步减少空间位阻存在的影响，本发明采用二级抗体来制备胶体金属标记的抗体。先用二级抗体和胶体金属颗粒结合，再用莱克多巴胺等药物或毒素抗体和胶体金属颗粒上的二级抗体结合。这样，可以使药物或毒素抗体上的药物或毒素结合位点突出在胶体金属颗粒表面，消除了用药物或毒素抗体直接标记时，抗体的抗原结合位点被BSA、PEG等封闭剂围在内部所造成的位阻效应，使得抗体对样品中的药物或毒素反应更加灵敏，提高检测试纸的检测灵敏度。其中，二级抗体是抗药物或毒素抗体的抗体，即能特异结合药物或毒素抗体的抗体，通常是特异针对药物或毒素抗体所属的动物物种的抗体。例如，药物或毒素抗体是鼠抗体，则抗药物或毒素抗体的抗体可以是兔抗鼠抗体或羊抗鼠抗体。

还有，为了进一步防止由于混合时抗体局部浓度过高而导致的不均一性增高，将胶体金属与药物或毒素抗体混合是将胶体金属与药物或毒素抗体同步加入到同一容器而混合，或者其中将胶体金属与抗药物或毒素抗体的抗体混合是将胶体金属与抗药物或毒素抗体的抗体同步加入到同一容器而混合。所谓“同步加入”就是以相同速度同时加入抗体和胶体金属，使容器中出现一个胶体金属时同时出现一个抗体分子。在本发明的具体实施方式中，采用两个蠕动泵，一个加入抗体，而另一个加入胶体金属。

通过采用上述改进的全部或部分，本发明的设备可以解决现有检测设备中存在的问题的全部或部分，使得试纸条的检测灵敏度和准确度大大提高。

在本发明第一方面的免疫层析设备中，固相介质是能用于层析的固相介质，其上包含有胶体金属标记的药物或毒素抗体。加入待测样品后，其上胶体金属标记的抗体重新水化并可以与样品中的药物或毒素相互反应，在毛细管的扩散作用下扩散移动。固相介质优选是纤维膜，更优选是玻璃纤维膜。

本发明第一方面的免疫层析设备中的纤维膜上固定药物或毒素。该药物或毒素能与胶体金属标记的药物或毒素抗体，因此对于小分子药物或毒素，通常使用的药物或毒素是其与载体偶连形成的完全抗原形式。优选纤维膜上还固定有能与胶体金标记的抗体结合的第二抗体(常用的有，当胶体金标记的抗体是兔抗体时，该第二抗体是抗兔的抗体)作为质控线(或参考线)。其中，纤维膜的实例有醋酸纤维膜或硝酸纤维膜。

本发明第一方面的免疫层析设备可以是层析柱、卡或试纸，优选是试纸，其包括背衬，其中固相介质和纤维膜粘贴在背衬上。背衬可以是能保持试纸形状的刚性材料，如塑料、硬板纸等，也可以是金属片。优选试纸上固相介质一端与纤维膜相连，另一端与样品垫相连，在纤维膜与固相介质相对的一端连有吸水纸垫，这样在样品垫上加入样品后，可以向着吸水纸垫方向移动。优选样品垫、固相介质、纤维膜、吸水纸垫都粘贴在背衬上。在一个具体实施方式中，本发明提供了检测莱克多巴胺的免疫层析试纸，其包括，包含样品垫、胶体金标记的莱克多巴胺抗体的固相介质以及连接于所述固相介质一端的纤维膜、和吸水垫，所述纤维膜上固定有莱克多巴胺完全抗原，其特征在于，

其中胶体金标记的莱克多巴胺抗体由如下方法制备：

1)将胶体金与莱克多巴胺抗体同步加入到同一容器而混合，形成胶体金与莱克多巴胺抗体的复合物；和

2)层析纯化上述复合物；

或者，其中胶体金标记的莱克多巴胺抗体由如下方法制备：

1)将胶体金与抗莱克多巴胺抗体的抗体加入到同一容器而混合，形成胶体金与抗莱克多巴胺抗体的抗体的复合物；

2)将第1)步得到的复合物与药物或毒素抗体混合，形成胶体金、抗莱克多巴胺抗体的抗体与莱克多巴胺抗体的复合物；和

3)层析纯化第2)步得到的复合物。

另外，本发明也可以提供相应的检测盐酸克伦特罗的免疫层析试纸。

在本发明第一方面的基础上，本发明还包括以下几个方面。

具体而言，在第二方面，本发明提供了检测药物或毒素残留的方法，其包括使用本发明第一方面所述的免疫层析设备。优选该方法包括，将样品上样于前述权利要求之任一所述的免疫层析设备，观察样品与胶体金属标记的药物或毒素抗体的反应。如果免疫层析设备是层析柱，则可将样品上样于固体介质上，使之通过毛细管作用和重力作用流过连于固体介质下的纤维膜，观察纤维膜上的检测线的颜色变化并优选观察纤维膜上的质控线上的颜色变化；对于免疫层析试纸，则可将在样品垫上加入样品，使之向着吸水纸垫方向移动，观察纤维膜上的检测线的颜色变化并优选观察纤维膜上的质控线上的颜色变化。如果检测线显色，则样品的药物或毒素呈阴性；如果检测线不显色，则样品的药物或毒素呈阳性。

在第三方面，本发明提供了一种胶体金属标记的药物或毒素抗体的制备方法，其过程包括：

1)将胶体金属与药物或毒素抗体混合，形成胶体金属与药物或毒素抗体的复合物；和

2)层析纯化上述复合物。

其中，抗体是单克隆抗体或多克隆抗体。其中，药物或毒素优选是莱克多巴胺、盐酸克伦特罗、氯霉素或肉毒素，最优选是莱克多巴胺。其中，胶体金属优选选自胶体Ag、Au、Pd、Pt、Rh、Ir、Ru和Os，更优选选自胶体金和胶体银，最优选选自胶体金。其中，层析优选为分子筛层析，更优选选自Sephacryl-S200、Sephacryl-S300、Sephedex G-25和Sephedex G-100，最优选是Sephacryl-S200或Sephacryl-S300。

进一步优选的是，其中将胶体金属与药物或毒素抗体混合是将胶体金属与药物或毒素抗体同步加入到同一容器而混合。

在第四方面，本发明提供了一种胶体金属标记的药物或毒素抗体的制备方法，其过程包括：

1)将胶体金属与抗药物或毒素抗体的抗体混合，形成胶体金属与抗药物或毒素抗体的抗体的复合物；

2)将第1)步得到的复合物与药物或毒素抗体混合，形成胶体金属、抗药物或毒素抗体的抗体与药物或毒素抗体的复合物；和

3)层析纯化第2)步得到的复合物。

其中，抗体是单克隆抗体或多克隆抗体。其中，药物或毒素优选是莱克多巴胺、盐酸克伦特罗、氯霉素或肉毒素，最优选是莱克多巴胺、盐酸克伦特罗。其中，胶体金属优选选自胶体Ag、Au、Pd、Pt、Rh、Ir、Ru和Os，更优选选自胶体金和胶体银，最优选选自胶体金。其中，层析优选为分子筛层析，更优选选自Sephacryl-S200、Sephacryl-S300、Sephedex G-25和Sephedex G-100，最优选是Sephacryl-S200或Sephacryl-S300。

进一步优选的是，其中将胶体金属与抗药物或毒素抗体的抗体混合是将胶体金属与抗药物或毒素抗体的抗体同步加入到同一容器而混合。

在第五方面，本发明提供了一种胶体金属标记的药物或毒素抗体，其是由本发明第三或第四方面所述的制备方法制备的。

在第六方面，本发明提供了一种胶体金属标记的药物或毒素抗体，其包括胶体金属、抗药物或毒素抗体的抗体与药物或毒素抗体，优选其由胶体金属、抗药物或毒素抗体的抗体与药物或毒素抗体组成。其中，抗体是单克隆抗体或多克隆抗体。其中，药物或毒素优选是莱克多巴胺、盐酸克伦特罗、氯霉素或肉毒素，最优选是莱克多巴胺。其中，胶体金属优选选自胶体Ag、Au、Pd、Pt、Rh、Ir、Ru和Os，更优选选自胶体金和胶体银，最优选选自胶体金。其中，层析优选为分子筛层析，更优选选自Sephacryl-S200、Sephacryl-S300、Sephedex G-25和Sephedex G-100，最优选是Sephacryl-S200或Sephacryl-S300。最优选该方面的胶体金属标记的药物或毒素抗体是由本发明第四方面所述的制备方法制备的。

为了便于理解，以下将通过具体的附图、实施例对本发明进行详细地描述。需要特别指出的是，这些描述仅仅是示例性的描述，并不构成对本发明范围的限制。依据本说明书的论述，本发明的许多变化、改变对所属领域技术人员来说都是显而易见的。另外，本发明引用了公开文献，这些文献是为了更清楚地描述本发明，它们的全文内容均纳入本文进行参考，就好像它们的全文已经在本文中重复叙述过一样。

附图说明

图l：胶体金标记的莱克多巴胺抗体的层析纯化图谱，其中标上箭头的是收集的目标产物(即标记了单一抗体的胶体金标记的莱克多巴胺抗体)。

图2：采用二级抗体制备的胶体金标记的莱克多巴胺抗体的层析纯化图谱，其中标上箭头的是收集的目标产物(即标记了单一抗体的胶体金标记的莱克多巴胺抗体)。

图3：胶体金标记的盐酸克伦特罗抗体的层析纯化图谱，其中标上箭头的是收集的目标产物(即标记了单一抗体的胶体金标记的盐酸克伦特罗抗体)。

图4：用现有常规技术和本发明实施例的新方法制备的胶体金标记的抗体制成的检测试纸对猪尿液的检测结果。其中，当样品阴性时，常规方法制备的试纸条检测线比用新方法的检测线淡很多。当样品阳性(1ng/ml)时，常规方法制备的试纸条检测线处还有比较明显的红色条带，而用新方法的检测线处没有条带。另一条在所有图中都显色的是质控线。其中，图4A：常规方法试纸阴性猪尿液检测结果；图4B：常规方法试纸阳性猪尿液检测结果；图4C：新方法试纸阴性猪尿液检测结果；图4D：新方法试纸阳性猪尿液检测结果。

具体实施方式

实施例1、胶体金标记的莱克多巴胺抗体的制备方法

先以柠檬酸钠还原法制备胶体金，即在沸腾的0.01％氯金酸水溶液中加入1ml 1％的柠檬酸三钠，边加热边搅拌15分钟，冷却后用蒸馏水恢复到原体积，获得直径为40nm的胶体金用于后续的实验。以0.1mol/L K₂CO₃调胶体金pH到9.0，加入1mg的兔抗莱克多巴胺抗体(购自美国IDS公司)，搅拌标记10分钟后，4℃、12000rpm离心1小时，弃上清，用5mlPBS重悬胶体金，用于过Sephacryl-S200层析柱(2.6×100cm)(购自美国GE公司)来分离胶体金标记的莱克多巴胺抗体(以下缩写为RacAb-Au)。

我们用蛋白质纯化层析系统(FPLC)来进行RacAb-Au的纯化。流速为1ml/min，吸收波长为525nm。如图1所示，结果表明，Sephacryl-S200层析柱将胶体金混合物分成3个峰。我们将每个峰分别收集，用PBS调成同样浓度后鉴定抗体的效价。结果表明第一个峰每个胶体金颗粒上标记了2个以上的抗体，第二个峰(用箭头标记)上每个胶体金颗粒上标记了1个抗体分子，而第三个峰不的胶体金颗粒上不含有抗体。后面的洗脱液我们也进行了抗体的检测，发现虽然没有出现峰，但里面也含有一部分抗体。这是由于Sephacryl-S200是一种分子筛层析柱，胶体金上标记了多个抗体，颗粒直径较大，首先被洗脱出来；而标记了一个抗体或没有标记上抗体的胶体金颗粒，颗粒直径依次边小，所以依次被洗脱出峰。残留的抗体直径最小，最后被洗脱，但由于蛋白最大吸收峰在280nm处，因此在检测波长为525nm时没有出现吸收峰。从以上结果可以看出，我们运用Sephacryl-S200分子筛层析柱，得到了标记了单一抗体的RacAb-Au。从峰面积进行计算，标记了单一抗体的RacAb-Au占总胶体金颗粒的70％，并进行了有效的纯化。

实施例2、采用二级抗体制备胶体金标记的莱克多巴胺抗体的方法

先以柠檬酸钠还原法制备胶体金，即在沸腾的0.01％氯金酸水溶液100ml中加入1ml 1％的柠檬酸三钠，边加热边搅拌15分钟，冷却后用蒸馏水恢复到原体积，以0.1mol/L K₂CO₃调胶体金pH到9.0，获得直径为40nm的胶体金用于后续的实验。

将1mg的羊抗兔(或羊抗鼠)IgG抗体(购自美国IDS公司)溶解于50ml浓度为0.01mol/L，pH9.0的K₂CO₃。用蠕动泵将40nm的胶体金以1ml/分钟的速度泵入带有磁力搅拌的烧杯中；同时，用另一蠕动泵将羊抗兔IgG抗体溶液以0.5ml/分钟的速度泵入带有同一烧杯中。这样，使得同样量的抗体在整个标记的过程中和等量的胶体金接触，每个胶体金颗粒上标记的抗体数目更加均一。等全部抗体和胶体金都泵入烧杯后，继续搅拌标记30分钟。在溶液中加入10％的BSA到终浓度0.5％，继续搅拌30分钟。

再在4℃、12000rpm离心1小时，弃上清，用50ml PBS重悬胶体金，加入兔抗莱克多巴胺多克隆抗体(或鼠抗莱克多巴胺单克隆抗体)0.5mg，室温下继续搅拌标记30分钟，使得莱克多巴胺抗体和胶体金颗粒上的二级抗体结合。4℃、12000rpm离心1小时，弃上清，用10ml PBS重悬胶体金，用于过Sephacryl-S300层析柱(2.6×100cm)(购自美国GE公司)来分离RacAb-Au。

我们用蛋白质纯化层析系统(FPLC)来进行RacAb-Au的纯化。流速为1ml/min，吸收波长为525nm。如图2所示，结果表明，Sephacryl-S300层析柱将胶体金混合物分成3个峰。我们将每个峰分别收集，用PBS调成同样浓度后鉴定抗体的效价。按公式”n＝3m/4π.r³.s(n：每毫升溶液的金颗粒数目；m：每毫升溶液的含金量(g)；r：金颗粒的半径(cm)；s：金的特殊比重19.3)，计算每个金颗粒表面结合个莱克多巴胺抗体分子数目。

结果表明第一个峰为胶体金颗粒上标记了多个以上莱克多巴胺抗体或胶体金聚合物；第二个峰(用箭头标记)上每个胶体金颗粒上标记了约1个莱克多巴胺抗体分子，而第三个峰不的胶体金颗粒上不含有抗体。后面的洗脱液我们也进行了抗体的检测，发现虽然没有出现峰，但里面也含有一部分抗体。这是由于Sephacryl-S300是一种分子筛层析柱，胶体金聚合物或胶体金上标记了多个抗体，颗粒直径较大，首先被洗脱出来；而标记了一个抗体或没有标记上抗体的胶体金颗粒，颗粒直径依次边小，所以依次被洗脱出峰。残留的抗体直径最小，最后被洗脱，但由于蛋白最大吸收峰在280nm处，因此在检测波长为525nm时没有出现吸收峰。从以上结果可以看出，我们运用Sephacryl-S300分子筛层析柱，得到了标记了单一抗体的RacAb-Au。从峰面积进行计算，标记了单一抗体的RacAb-Au占总胶体金颗粒的70％，并进行了有效的纯化。

实施例3、制备胶体金标记的盐酸克伦特罗抗体的方法

先以柠檬酸钠还原法制备胶体金，即在沸腾的0.01％氯金酸水溶液100ml中加入1ml 1％的柠檬酸三钠，边加热边搅拌15分钟，冷却后用蒸馏水恢复到原体积，以0.1mol/L K₂CO₃调胶体金pH到9.0，获得直径为40nm的胶体金用于后续的实验。

将1mg的羊抗兔(或羊抗鼠)IgG抗体(购自美国IDS公司)溶解于50ml浓度为0.01mol/L，pH9.0的K₂CO₃。用蠕动泵将40nm的胶体金以1ml/分钟的速度泵入带有磁力搅拌的烧杯中；同时，用另一蠕动泵将羊抗兔IgG抗体溶液以0.5ml/分钟的速度泵入带有同一烧杯中。这样，使得同样量的抗体在整个标记的过程中和等量的胶体金接触，每个胶体金颗粒上标记的抗体数目更加均一。等全部抗体和胶体金都泵入烧杯后，继续搅拌标记30分钟。在溶液中加入10％的BSA到终浓度0.5％，继续搅拌30分钟。

再在4℃、12000rpm离心1小时，弃上清，用50ml PBS重悬胶体金，加入兔抗盐酸克伦特罗多克隆抗体(或鼠抗盐酸克伦特罗单克隆抗体)0.5mg，室温下继续搅拌标记30分钟，使得盐酸克伦特罗抗体和胶体金颗粒上的二级抗体结合。4℃、12000rpm离心1小时，弃上清，用10ml PBS重悬胶体金，用于过Sephacryl-S300层析柱(2.6×100cm)来分离盐酸克伦特罗抗体-Au。

我们用蛋白质纯化层析系统(FPLC)来进行盐酸克伦特罗抗体-Au的纯化。流速为1ml/min，吸收波长为525nm。如图3所示，结果表明，Sephacryl-S300层析柱将胶体金混合物分成几个峰。我们将每个峰分别收集，用PBS调成同样浓度后鉴定抗体的效价。按公式”n＝3m/4π.r³.s(n：每毫升溶液的金颗粒数目；m：每毫升溶液的含金量(g)；r：金颗粒的半径(cm)；s：金的特殊比重19.3)，计算每个金颗粒表面结合个盐酸克伦特罗抗体分子数目。

结果表明我们运用Sephacryl-S300分子筛层析柱，得到了标记了单一抗体的盐酸克伦特罗抗体-Au。从峰面积进行计算，标记了单一抗体的盐酸克伦特罗抗体-Au占总胶体金颗粒的70％，并进行了有效的纯化。

实施例4、制备胶体金标记的莱克多巴胺残留检测试纸的方法

按羿国香等所述的方法(羿国香等，氯嘧磺隆胶体金免疫检测试纸条的制备与应用，分析化学，2006，34(12)1679-1682)，分别检测不同浓度的莱克多巴胺标样和空白对照样品，通过观察检测线和对照线来筛选莱克多巴胺-BSA联结物、二抗和胶体金标记抗体的最佳浓度。用筛选的最佳浓度分别计算出BioJet Quanti 3000kit微定量喷头和AirJetQuanti 3000kit气动定量喷头在硝酸纤维膜和胶体金释放垫上每厘米的喷样量。最佳条件为0.5g/L的莱克多巴胺-BSA联结物(检测线)、1g/L羊抗兔鼠IgG(质控线)用BioJet Quanti 3000kit微定量喷头在硝酸纤维膜上每厘米喷1μL。制备好的胶体金标记抗体稀释1倍后，用AirJetQuanti 3000kit气动定量喷头在每厘米的玻璃纤维膜(胶体金释放垫)上的喷样量为5μL。将硝酸纤维膜和供胶体金释放的纤维膜(胶体金释放垫)放入25℃烘箱中烘干24小时，将样品垫、胶体金释放垫、硝酸纤维膜、吸水垫按次序粘在塑料背衬上。以0.4厘米/条的宽度用切割机进行切割，并将切割下来的试纸条装入塑料外壳中，即成为莱克多巴胺残留检测试纸。

如图4所示，本发明制备出了莱克多巴胺残留金标检测试纸，经测试表明，这种方法制备的试纸条灵敏度大大提高。我们制备的试纸条在样品阴性时，检测线处红色条带明显。当样品中含有1ng/ml的莱克多巴胺时，检测线处就不出现条带。灵敏度大大高于国家规定的3ng/ml。

最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

Claims (14)

1、检测药物或毒素残留的免疫层析设备，其包括，包含胶体金属标记的药物或毒素抗体的固相介质以及连接于所述固相介质一端的纤维膜，所述纤维膜上固定有药物或毒素，其特征在于：

胶体金属标记的药物或毒素抗体由如下方法制备：

1)、将胶体金属与药物或毒素抗体混合，形成胶体金属与药物或毒素抗体的复合物；

2)、层析纯化上述复合物；

或者，其中胶体金属标记的药物或毒素抗体由如下方法制备：

1)、将胶体金属与抗药物或毒素抗体的抗体混合，形成胶体金属与抗药物或毒素抗体的抗体的复合物；

2)、将第1)步得到的复合物与药物或毒素抗体混合，形成胶体金属、抗药物或毒素抗体的抗体与药物或毒素抗体的复合物；

3)、层析纯化第2)步得到的复合物。

2、根据权利要求1所述的免疫层析设备，其特征在于：所述抗体是单克隆抗体或多克隆抗体；所述药物或毒素是莱克多巴胺、盐酸克伦特罗、氯霉素或肉毒素，优选是莱克多巴胺；所述胶体金属选自胶体Ag、Au、Pd、Pt、Rh、Ir、Ru和Os，优选选自胶体金和胶体银，最优选选自胶体金。

3、根据权利要求1或2所述的免疫层析设备，其特征在于：所述层析为分子筛层析，优选选自Sephacryl-S200、Sephacryl-S300、Sephedex G-25和Sephedex G-100，最优选是Sephacryl-S200或Sephacryl-S300。

4、根据权利要求3所述的免疫层析设备，其特征在于：所述固相介质是纤维膜，优选是玻璃纤维膜。

5、根据权利要求4所述的免疫层析设备，其特征在于：所述将胶体金属与药物或毒素抗体混合是将胶体金属与药物或毒素抗体同步加入到同一容器而混合；所述将胶体金属与抗药物或毒素抗体的抗体混合是将胶体金属与抗药物或毒素抗体的抗体同步加入到同一容器而混合。

6、根据权利要求5所述的免疫层析设备，其特征在于：所述设备是试纸，其包括背衬，所述固相介质和纤维膜粘贴在背衬上。

7、使用权利要求1～6中任意一种免疫层析设备进行检测药物或毒素残留的方法，其特征在于：将样品上样于所述的免疫层析设备，观察样品与胶体金属标记的药物或毒素抗体的反应。

8、一种胶体金属标记的药物或毒素抗体的制备方法，其特征在于包括：

1)、将胶体金属与药物或毒素抗体混合，形成胶体金属与药物或毒素抗体的复合物；

2)、层析纯化上述复合物；

或者包括：

1)、将胶体金属与抗药物或毒素抗体的抗体混合，形成胶体金属与抗药物或毒素抗体的抗体的复合物；

2)、将第1)步得到的复合物与药物或毒素抗体混合，形成胶体金属、抗药物或毒素抗体的抗体与药物或毒素抗体的复合物；

3)、层析纯化第2)步得到的复合物。

9、根据权利要求8所述的胶体金属标记的药物或毒素抗体的制备方法，其特征在于：所述抗体是单克隆抗体或多克隆抗体；所述药物或毒素是莱克多巴胺、盐酸克伦特罗、氯霉素或肉毒素，优选是莱克多巴胺；所述胶体金属选自胶体Ag、Au、Pd、Pt、Rh、Ir、Ru和Os，优选选自胶体金和胶体银，最优选选自胶体金。

10、根据权利要求9所述的胶体金属标记的药物或毒素抗体的制备方法，其特征在于：层析为分子筛层析，优选选自Sephacryl-S200、Sephacryl-S300、Sephedex G-25和SephedexG-100，最优选是Sephacryl-S200或Sephacryl-S300。

11、根据权利要求8～10中任意一种胶体金属标记的药物或毒素抗体的制备方法，其特征在于：所述将胶体金属与药物或毒素抗体混合是将胶体金属与药物或毒素抗体同步加入到同一容器而混合，所述将胶体金属与抗药物或毒素抗体的抗体混合是将胶体金属与抗药物或毒素抗体的抗体同步加入到同一容器而混合。

12、如权利要求8～11中任意一种制备方法制得的胶体金属标记的药物或毒素抗体。

13、根据权利要求12所述的胶体金属标记的药物或毒素抗体，其特征在于：其包括胶体金属、抗药物或毒素抗体的抗体与药物或毒素抗体，优选其由胶体金属、抗药物或毒素抗体的抗体与药物或毒素抗体组成。

14、根据权利要求13所述的胶体金属标记的药物或毒素抗体，其特征在于：所述抗体是单克隆抗体或多克隆抗体；所述药物或毒素是莱克多巴胺、盐酸克伦特罗、氯霉素或肉毒素，优选是莱克多巴胺；所述胶体金属选自胶体Ag、Au、Pd、Pt、Rh、Ir、Ru和Os，优选选自胶体金和胶体银，最优选选自胶体金。

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