CN111856003A - 一种新型冠状病毒（2019-nCoV）IgM、IgG抗体检测试纸条、试剂盒及方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种新型冠状病毒（2019‑nCoV）IgM、IgG抗体检测试纸条，包括金标垫层和硝酸纤维素膜，所述金标垫层固相化有2019‑nCoV抗原‑胶体金复合物或2019‑nCoV抗原‑抗体‑胶体金复合物，所述硝酸纤维素膜包被有鼠抗人IgM抗体的检测线和鼠抗人IgG抗体的检测线；新型冠状病毒（2019‑nCoV）目前无血清学诊断试纸条及试剂盒，本发明所述试纸条及试剂盒一次操作即可联合检测IgM、IgG抗体，简化了操作过程，有效地诊断了机体免疫反应状态，达到真正的POCT检测的目的。
Description
技术领域
本发明涉及人呼吸道病毒检测领域，具体地说，是一种利用胶体金免疫测定技术检测血清、血浆、全血中新型冠状病毒（2019-nCoV）特异性IgM、IgG抗体的试纸条、试剂盒及方法。
背景技术
新型冠状病毒，即“2019-nCoV”，2020年1月12日被世界卫生组织命名。新型冠状病毒（2019-nCoV）属于β冠状病毒属，有包膜，颗粒呈圆形或椭圆形，常为多形性，直径60-140nm，与蝙蝠 SARS 样冠状病毒（bat-SL-CoVZC45）同源性达 85%以上。
流行病学调查发现，新型冠状病毒（2019-nCoV）潜伏期一般为3-7天，最长不超过14天，主要通过呼吸道飞沫传播，亦可通过接触传播；临床表现为发热、乏力、干咳，少数患者伴有鼻塞、流涕、腹泻等症状，重症病例多在一周后出现呼吸困难、严重者快速进展为急性呼吸窘迫综合征、脓毒症休克、难以纠正的代谢性酸中毒和出凝血功能障碍。
目前，临床上病毒检测的金标准仍是病毒培养法，但该法耗时长、敏感性低且对实验操作要求高，大大限制了其在临床上的应用。分子生物学平台目前已有数家荧光PCR法和一家联合探针锚定综合测序法检测新型冠状病毒（2019-nCoV）的试剂，但是由于操作复杂，对操作人员的技术要求较高，也限制其POCT领域的推广使用。
血清学检测是国内外公认的临床诊断较为可靠的指标之一，目前尚无新型冠状病毒（2019-nCoV）IgM或IgG抗体的检测试剂。特异性IgM抗体，表明有近期感染的发生，但IgM的检测阴性并不能证明机体未受到感染，还需要检测半衰期较长，含量最高的特异性IgG抗体，以明确诊断。特异性IgM、IgG抗体的同时检测，可以有效诊断机体对特定病原体的免疫反应状态。
新型冠状病毒（2019-nCoV）潜伏期长，其与其他冠状病毒同源性高，亟待有高灵敏度、高特异性的新型冠状病毒（2019-nCoV）IgM、IgG抗体胶体金法检测试剂盒的出现，以降低潜伏期带来的隐形传播风险，有效控制疫情的大规模传播。
发明内容
本发明要解决的技术问题是针对以上不足，提供一种新型冠状病毒（2019-nCoV）IgM、IgG抗体检测试纸条，其检测灵敏度高、特异性好、操作简单。
还提供一种检测新型冠状病毒（2019-nCoV）IgM、IgG抗体的试剂盒，其使用便捷、操作简单，可以快速、准确检测2019-nCoV的IgM、IgG抗体。
还提供一种检测新型冠状病毒（2019-nCoV）IgM、IgG抗体的检测方法，该方法简单、操作性强、耗时短。
为了解决以上技术问题，本发明采用的技术方案如下：
一种新型冠状病毒（2019-nCoV）IgM、IgG抗体检测试纸条，包括金标垫层和硝酸纤维素膜，所述金标垫层固相化有2019-nCoV抗原-胶体金复合物或2019-nCoV抗原-抗体-胶体金复合物，所述硝酸纤维素膜包被有鼠抗人IgM抗体的检测线和鼠抗人IgG抗体的检测线。
作为一种优化方案，所述金标垫层胶体金颗粒标记2019-nCoV重组抗原或者胶体金颗粒标记2019-nCoV单克隆抗体，再偶联1：5~1：1（抗原：抗体）的2019-nCoV天然抗原。
较重组抗原，天然抗原构象更接近机体感染的2019-nCoV病毒，应用天然抗原代替重组抗原有利于提高试剂灵敏度；通过胶体金颗粒标记2019-nCoV单克隆抗体，再偶联天然抗原，较胶体金颗粒直接偶联重组抗原，可减少待测物与胶体金复合物间的空间位阻，更有利于提高灵敏度。
作为一种优化方案，所述金标垫层2019-nCoV抗原-抗体-胶体金复合物的制备包括以下步骤：
采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金，在金溶胶中按15~20μg/mL比例缓慢加入2019-nCoV单克隆抗体，充分反应后，以8000~10000rpm离心30分钟，弃上清，10倍浓缩，然后加入1：5~1：1（抗原：抗体）的2019-nCoV天然抗原，静置反应10~20min，制得2019-nCoV抗原-抗体-胶体金复合物。
作为一种优化方案，所述金标垫层还固相化有羊IgG抗体-胶体金复合物或兔IgG抗体-胶体金复合物或鸡IgY抗体-胶体金复合物，所述硝酸纤维素膜还包被有兔抗羊IgG抗体或羊抗兔IgG抗体或山羊抗鸡IgY抗体的质控线。
鸡IgY较常见的羊IgG或兔IgG，种系距离相差大，与哺乳动物免疫球蛋白（如类风湿因子、自身抗体）之间不会发生交叉血清学反应，避免了假阳性的产生。
作为一种优化方案，所述鸡IgY抗体-胶体金复合物的制备包括以下步骤：
在金溶胶中按10~15μg/mL比例缓慢加入鸡IgY抗体，充分反应后，以8000~10000rpm离心30分钟，弃上清，10倍浓缩，制得鸡IgY抗体-胶体金复合物；
2019-nCoV抗原-抗体-胶体金复合物按10~15%浓度，鸡IgY抗体-胶体金复合物按3~5%浓度，涂布于玻璃纤维素膜上，干燥。
作为一种优化方案，所述硝酸纤维素膜包被步骤如下：
鼠抗人IgM 抗体、鼠抗人IgG抗体以1.2~1.5mg/mL浓度，山羊抗鸡IgY抗体以1.5~2.0mg/mL浓度喷于硝酸纤维素膜上包被并干燥。
作为一种优化方案，所述样品垫层的制备方法如下：
还包括样品垫层和吸水层，所述吸水层位于硝酸纤维素膜的上方；所述金标垫层及样品垫层位于硝酸纤维素膜的下方，样品垫层一端压住金标垫层一端0.5~1mm，金标垫层另一端压住硝酸纤维素膜一端0.5~1mm，吸水层的一端压住硝酸纤维素膜另一端0.5~1mm。
作为一种优化方案，所述样品垫层的制备方法如下：
样品垫处理液为50mM Tris-HCL缓冲液，pH9.0，含0.5%大分子聚合物PVP、0.05~0.2%吐温20、0.01~0.05%曲拉通X-100、0.5%封闭剂酪蛋白、0.1~0.2%抗RBC单抗，涂布于玻璃纤维素膜上，干燥。
一种新型冠状病毒（2019-nCoV）IgM、IgG抗体检测试剂盒，包括上述的试纸条和样本稀释液，所述样本稀释液由牛血清白蛋白BSA、曲拉通X-100以及防腐剂配制而成。
一种新型冠状病毒（2019-nCoV）IgM、IgG抗体检测方法，其特征在于：所述检测方法包括以下步骤：
（1）检测
a、检测样本为血清、血浆、全血；
b、取血清、血浆10µL，全血20µL到检测卡的加样孔，滴加2滴样本稀释液，15分钟观察结果，20分钟后结果无效；
（2）结果判断
阴性：仅质控线C处出现一条红色条带，在检测线T1、检测线T2处无红色条带出现，阴性结果表明：样本中不含待测抗体；
b、阳性：
（1）、三条红色条带出现，两条红色条带分别出现于检测线T1、检测线T2处，另一条红色条带出现于质控线C处，阳性结果表明：样本中同时含有2019-nCoV IgG、IgM抗体；
（2）、两条红色条带出现，一条红色条带分别出现于检测线T1处，另一条红色条带出现于质控线C处，阳性结果表明：样本中含有2019-nCoV IgG抗体；
（3）、两条红色条带出现，一条红色条带分别出现于检测线T2处，另一条红色条带出现于质控线C处，阳性结果表明：样本中含有2019-nCoV IgM抗体；
c、无效：质控线C处未出现红色条带，表明操作失误或试剂失效。
本发明采取以上技术方案，具有以下优点：
1、新型冠状病毒（2019-nCoV）目前无血清学诊断试纸条及试剂盒，本发明所述试纸条及试剂盒一次操作即可联合检测IgM、IgG抗体，简化了操作过程，有效地诊断了机体免疫反应状态，达到真正的POCT检测的目的。
2、本发明所述试纸条及试剂盒采用免疫捕获法原理，通过“标记抗体，偶联天然抗原”的方式制备金标物，相比通用的标记重组抗原技术，最大限度的提高了试剂的灵敏度，减少了由于新型冠状病毒（2019-nCoV）潜伏期长带来的隐形传播风险。
较重组抗原，天然抗原构象更接近机体感染的2019-nCoV病毒，应用天然抗原代替重组抗原有利于提高试剂灵敏度；通过胶体金颗粒标记2019-nCoV单克隆抗体，再偶联天然抗原，较胶体金颗粒直接偶联重组抗原，可减少待测物与胶体金复合物间的空间位阻，更有利于提高灵敏度。
3、本发明所述试纸条及试剂盒采用“山羊抗鸡IgY抗体-鸡IgY抗体” 干扰最小的配对作为质控体系，将质控系统对检测体系的干扰降至最低，显著提高了试剂的特异性。
鸡IgY较常见的羊IgG或兔IgG，种系距离相差大，与哺乳动物免疫球蛋白（如类风湿因子、自身抗体）之间不会发生交叉血清学反应，避免了假阳性的产生。
4、本发明的检测方法，步骤简单，可操作性强，可以快速、便捷的实现新型冠状病毒（2019-nCoV）IgM、IgG抗体的检测。
下面结合实施例对本发明作进一步说明。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，实施例中未注明具体条件，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市场购买获得的常规产品。
所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例，基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1：一种新型冠状病毒（2019-nCoV）IgM、IgG抗体检测试纸条，包括底板，底板为PVC板，所述底板上粘贴有依次搭接的样品垫层、金标垫层、硝酸纤维素膜和吸水层，吸水层为吸水纸，样品垫层一端压住金标垫层一端0.5~1mm，金标垫层另一端压住硝酸纤维素膜一端0.5~1mm，吸水层的一端压住硝酸纤维素膜另一端0.5~1mm，在底板的中间位置粘贴制备的硝酸纤维素膜，在底板固定硝酸纤维素膜位置的上方粘贴吸水层；在底板固定硝酸纤维素膜位置的下方粘贴制备的金标垫层及样品垫层，将上述步骤得到的产品压平整后，切成4.0mm宽的试纸条。
所述样品垫层使用样品垫处理液处理，按以下配方配制1L样品垫处理液：称取6.057g Tris，超纯水900mL溶解，依次加入5g大分子聚合物PVP、5g酪蛋白、2mL吐温20、0.1mL曲拉通X-100、1g抗RBC单抗，HCL调节pH至9.0，超纯水定容至1L。
使用配置好的样品垫处理液处理样品垫：每张30cm×25cm的样品垫，用50mL所述处理液均匀涂布后置于37℃电热鼓风干燥箱中干燥12小时，干燥保存备用。
所述金标垫层的制备包括以下步骤：
采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金，在50mL金溶胶中缓慢加入1mg 2019-nCoV单克隆抗体，充分反应后，以10000rpm离心30分钟，弃上清，10倍浓缩，然后加入0.25mg 2019-nCoV天然抗原，静置反应15min。
在10mL金溶胶中缓慢加入0.15mg鸡IgY抗体，充分反应后，以8000rpm离心30分钟，弃上清，10倍浓缩。
使用前述金标液处理金标垫：取玻璃纤维放入不锈钢盘，量取45mL复溶后胶体金标记物（含4.5mL胶体金标记的2019-nCoV抗原-抗体-胶体金复合物和1.35mL胶体金标记的鸡IgY抗体）倒入不锈钢盘，使金溶液完全均匀吸收，置于37℃电热鼓风干燥箱中干燥12小时，干燥保存备用。
将鼠抗人IgG抗体、鼠抗人IgM抗体和山羊抗鸡IgY抗体分别包被在硝酸纤维素膜的指定位置上，形成IgG检测线、IgM检测线和质控线；其中，所述鼠抗人IgG抗体、鼠抗人IgM抗体浓度为1.2mg/mL，所述山羊抗鸡IgY抗体浓度为1.5mg/mL，45℃电热鼓风干燥箱中干燥2小时，干燥保存备用。
实施例2：一种新型冠状病毒（2019-nCoV）IgM、IgG抗体检测试纸条，包括底板，底板为PVC板，所述底板上粘贴有依次搭接的样品垫层、金标垫层、硝酸纤维素膜和吸水层，吸水层为吸水纸，样品垫层一端压住金标垫层一端0.5~1mm，金标垫层另一端压住硝酸纤维素膜一端0.5~1mm，吸水层的一端压住硝酸纤维素膜另一端0.5~1mm，在底板的中间位置粘贴制备的硝酸纤维素膜，在底板固定硝酸纤维素膜位置的上方粘贴吸水层；在底板固定硝酸纤维素膜位置的下方粘贴制备的金标垫层及样品垫层，将上述步骤得到的产品压平整后，切成4.0mm宽的试纸条。
所述样品垫层使用样品垫处理液处理，按以下配方配制1L样品垫处理液：称取6.057g Tris，超纯水900mL溶解，依次加入5g大分子聚合物PVP、5g酪蛋白、0.5mL吐温20、0.5mL曲拉通X-100、1.5g抗RBC单抗，HCL调节pH至9.0，超纯水定容至1L。
使用配置好的样品垫处理液处理样品垫：每张30cm×25cm的样品垫，用50mL所述处理液均匀涂布后置于37℃电热鼓风干燥箱中干燥12小时，干燥保存备用。
所述金标垫层的制备包括以下步骤：
采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金，在50mL金溶胶中缓慢加入0.75mg 2019-nCoV单克隆抗体，充分反应后，以10000rpm离心30分钟，弃上清，10倍浓缩，然后加入0.25mg 2019-nCoV天然抗原，静置反应10min。
在10mL金溶胶中缓慢加入0.1mg鸡IgY抗体，充分反应后，以8000rpm离心30分钟，弃上清，10倍浓缩。
使用前述金标液处理金标垫：取玻璃纤维放入不锈钢盘，量取45mL复溶后胶体金标记物（含6.75mL胶体金标记的2019-nCoV抗原-抗体-胶体金复合物和2.25mL胶体金标记的鸡IgY抗体）倒入不锈钢盘，使金溶液完全均匀吸收，置于37℃电热鼓风干燥箱中干燥12小时，干燥保存备用。
将鼠抗人IgG抗体、鼠抗人IgM抗体和山羊抗鸡IgY抗体分别包被在硝酸纤维素膜的指定位置上，形成IgG检测线、IgM检测线和质控线；其中，所述鼠抗人IgG抗体、鼠抗人IgM抗体浓度为1.2mg/mL，所述山羊抗鸡IgY抗体浓度为1.8mg/mL，45℃电热鼓风干燥箱中干燥2小时，干燥保存备用。
实施例3：一种新型冠状病毒（2019-nCoV）IgM、IgG抗体检测试纸条，包括底板，底板为PVC板，所述底板上粘贴有依次搭接的样品垫层、金标垫层、硝酸纤维素膜和吸水层，吸水层为吸水纸，样品垫层一端压住金标垫层一端0.5~1mm，金标垫层另一端压住硝酸纤维素膜一端0.5~1mm，吸水层的一端压住硝酸纤维素膜另一端0.5~1mm，在底板的中间位置粘贴制备的硝酸纤维素膜，在底板固定硝酸纤维素膜位置的上方粘贴吸水层；在底板固定硝酸纤维素膜位置的下方粘贴制备的金标垫层及样品垫层，将上述步骤得到的产品压平整后，切成4.0mm宽的试纸条。
所述样品垫层使用样品垫处理液处理，按以下配方配制1L样品垫处理液：称取6.057g Tris，超纯水900mL溶解，依次加入5g大分子聚合物PVP、5g酪蛋白、1mL吐温20、0.25mL曲拉通X-100、2g抗RBC单抗，HCL调节pH至9.0，超纯水定容至1L。
使用配置好的样品垫处理液处理样品垫：每张30cm×25cm的样品垫，用50mL所述处理液均匀涂布后置于37℃电热鼓风干燥箱中干燥12小时，干燥保存备用。
所述金标垫层的制备包括以下步骤：
采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金，在50mL金溶胶中缓慢加入0.85mg 2019-nCoV单克隆抗体，充分反应后，以10000rpm离心30分钟，弃上清，10倍浓缩，然后加入0.4mg 2019-nCoV天然抗原，静置反应12min。
在10mL金溶胶中缓慢加入0.12mg鸡IgY抗体，充分反应后，以8000rpm离心30分钟，弃上清，10倍浓缩。
使用前述金标液处理金标垫：取玻璃纤维放入不锈钢盘，量取45mL复溶后胶体金标记物（含5.85mL胶体金标记的2019-nCoV抗原-抗体-胶体金复合物和1.8mL胶体金标记的鸡IgY抗体）倒入不锈钢盘，使金溶液完全均匀吸收，置于37℃电热鼓风干燥箱中干燥12小时，干燥保存备用。
将鼠抗人IgG抗体、鼠抗人IgM抗体和山羊抗鸡IgY抗体分别包被在硝酸纤维素膜的指定位置上，形成IgG检测线、IgM检测线和质控线；其中，所述鼠抗人IgG抗体、鼠抗人IgM抗体浓度为1.5mg/mL，所述山羊抗鸡IgY抗体浓度为2.0mg/mL，45℃电热鼓风干燥箱中干燥2小时，干燥保存备用。
实施例4：一种新型冠状病毒（2019-nCoV）IgM、IgG抗体检测试纸条，包括底板，底板为PVC板，所述底板上粘贴有依次搭接的样品垫层、金标垫层、硝酸纤维素膜和吸水层，吸水层为吸水纸，样品垫层一端压住金标垫层一端0.5~1mm，金标垫层另一端压住硝酸纤维素膜一端0.5~1mm，吸水层的一端压住硝酸纤维素膜另一端0.5~1mm，在底板的中间位置粘贴制备的硝酸纤维素膜，在底板固定硝酸纤维素膜位置的上方粘贴吸水层；在底板固定硝酸纤维素膜位置的下方粘贴制备的金标垫层及样品垫层，将上述步骤得到的产品压平整后，切成4.0mm宽的试纸条。
所述样品垫层使用样品垫处理液处理，按以下配方配制1L样品垫处理液：称取6.057g Tris，超纯水900mL溶解，依次加入5g大分子聚合物PVP、5g酪蛋白、0.5mL吐温20、0.5mL曲拉通X-100、1.5g抗RBC单抗，HCL调节pH至9.0，超纯水定容至1L。
使用配置好的样品垫处理液处理样品垫：每张30cm×25cm的样品垫，用50mL所述处理液均匀涂布后置于37℃电热鼓风干燥箱中干燥12小时，干燥保存备用。
所述金标垫层的制备包括以下步骤：
采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金，在50mL金溶胶中缓慢加入0.75mg 2019-nCoV单克隆抗体，充分反应后，以9000rpm离心30分钟，弃上清，10倍浓缩，然后加入0.75mg 2019-nCoV天然抗原，静置反应20min。
在10mL金溶胶中缓慢加入0.1mg鸡IgY抗体，充分反应后，以9000rpm离心30分钟，弃上清，10倍浓缩。
使用前述金标液处理金标垫：取玻璃纤维放入不锈钢盘，量取45mL复溶后胶体金标记物（含4.5mL胶体金标记的2019-nCoV抗原-抗体-胶体金复合物和2.25mL胶体金标记的鸡IgY抗体）倒入不锈钢盘，使金溶液完全均匀吸收，置于37℃电热鼓风干燥箱中干燥12小时，干燥保存备用。
将鼠抗人IgG抗体、鼠抗人IgM抗体和山羊抗鸡IgY抗体分别包被在硝酸纤维素膜的指定位置上，形成IgG检测线、IgM检测线和质控线；其中，所述鼠抗人IgG抗体、鼠抗人IgM抗体浓度为1.4mg/mL，所述山羊抗鸡IgY抗体浓度为1.8mg/mL，45℃电热鼓风干燥箱中干燥2小时，干燥保存备用。
实施例5：一种新型冠状病毒（2019-nCoV）IgM、IgG抗体检测试纸条，包括底板，底板为PVC板，所述底板上粘贴有依次搭接的样品垫层、金标垫层、硝酸纤维素膜和吸水层，吸水层为吸水纸，样品垫层一端压住金标垫层一端0.5~1mm，金标垫层另一端压住硝酸纤维素膜一端0.5~1mm，吸水层的一端压住硝酸纤维素膜另一端0.5~1mm，在底板的中间位置粘贴制备的硝酸纤维素膜，在底板固定硝酸纤维素膜位置的上方粘贴吸水层；在底板固定硝酸纤维素膜位置的下方粘贴制备的金标垫层及样品垫层，将上述步骤得到的产品压平整后，切成4.0mm宽的试纸条。
所述样品垫层使用样品垫处理液处理，按以下配方配制1L样品垫处理液：称取6.057g Tris，超纯水900mL溶解，依次加入5g大分子聚合物PVP、5g酪蛋白、1mL吐温20、0.25mL曲拉通X-100、1g抗RBC单抗，HCL调节pH至9.0，超纯水定容至1L。
使用配置好的样品垫处理液处理样品垫：每张30cm×25cm的样品垫，用50mL所述处理液均匀涂布后置于37℃电热鼓风干燥箱中干燥12小时，干燥保存备用。
所述金标垫层的制备包括以下步骤：
采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金，在50mL金溶胶中缓慢加入1mg 2019-nCoV单克隆抗体，充分反应后，以8000rpm离心30分钟，弃上清，10倍浓缩，然后加入0.2mg 2019-nCoV天然抗原，静置反应10min。
在10mL金溶胶中缓慢加入0.15mg鸡IgY抗体，充分反应后，以10000rpm离心30分钟，弃上清，10倍浓缩。
使用前述金标液处理金标垫：取玻璃纤维放入不锈钢盘，量取45mL复溶后胶体金标记物（含4.5mL胶体金标记的2019-nCoV抗原-抗体-胶体金复合物和1.35mL胶体金标记的鸡IgY抗体）倒入不锈钢盘，使金溶液完全均匀吸收，置于37℃电热鼓风干燥箱中干燥12小时，干燥保存备用。
将鼠抗人IgG抗体、鼠抗人IgM抗体和山羊抗鸡IgY抗体分别包被在硝酸纤维素膜的指定位置上，形成IgG检测线、IgM检测线和质控线；其中，所述鼠抗人IgG抗体、鼠抗人IgM抗体浓度为1.5mg/mL，所述山羊抗鸡IgY抗体浓度为1.5mg/mL，45℃电热鼓风干燥箱中干燥2小时，干燥保存备用。
实施例6：一种新型冠状病毒（2019-nCoV）IgM、IgG抗体检测试剂盒，包括实施例1-5其中之一所述的试纸条和样本稀释液。
所述样本稀释液由牛血清白蛋白BSA、曲拉通X-100以及防腐剂配制而成，进一步的，样本稀释液为20mM的磷酸盐缓冲液（pH7.0），含0.3% NaCl、0.05% BSA、0.012%曲拉通X-100、0.1%Proclin-300。
按以下配方配制1L样本稀释液：
200mM A液：取NaH2PO4.2H2O 3.12g溶于超纯水，定溶至100mL；
200mM B液：取Na2HPO4.12H2O 7.17g溶于超纯水，定溶至100mL；
取A液39mL，B液61mL，依次加入3g NaCl、0.5g BSA、0.12mL曲拉通X-100、1mL Proclin-300，超纯水定容至1L。
将试纸条置于检测卡中，试纸条位于检测卡卡体的凹槽内，将卡盖和卡体扣合，得到新型冠状病毒（2019-nCoV）IgM、IgG抗体检测卡，装入铝箔袋中封口；将配制的样本稀释液液装入瓶内，与检测卡分别置于盒体内，得到新型冠状病毒（2019-nCoV）IgM、IgG抗体检测试剂盒。
实施例7：一种新型冠状病毒（2019-nCoV）IgM、IgG抗体检测方法，所述检测方法包括以下步骤：
（1）检测
a、检测样本为血清、血浆、全血；血清、血浆样本2～8℃可存放3天，超过3天-20℃冷冻保存，反复冻融不超过3次；加抗凝剂的全血样本2～8℃可存放3天，不可冻存；未加抗凝剂的全血样本需立即使用（若样本发生凝集现象，可用血清进行检测）。
b、取血清、血浆10µL，全血20µL到检测卡的加样孔，滴加2滴样本稀释液（80-100µL），15分钟观察结果，20分钟后结果无效。
（2）结果判断
本发明所述试纸条观测区包括C线、T1线和T2线，其中C线代表质控线，T1代表IgG抗体检测线，T2代表IgM抗体检测线。
a、阴性：
仅质控线C处出现一条红色条带，在检测线T1、检测线T2处无红色条带出现。阴性结果表明：样本中不含待测抗体。
b、阳性：
（1）、三条红色条带出现；两条红色条带分别出现于检测线T1、检测线T2处，另一条红色条带出现于质控线C处；阳性结果表明：样本中同时含有2019-nCoV IgG、IgM抗体。
（2）、两条红色条带出现；一条红色条带分别出现于检测线T1处，另一条红色条带出现于质控线C处。阳性结果表明：样本中含有2019-nCoV IgG抗体。
（3）、两条红色条带出现；一条红色条带分别出现于检测线T2处，另一条红色条带出现于质控线C处。阳性结果表明：样本中含有2019-nCoV IgM抗体。
c、无效：质控线C处未出现红色条带，表明操作失误或试剂失效，请重试。
本发明试剂盒的灵敏度试验：
从确诊的临床样本中选取中阳性样本，按1:4、1:8、1:16、1:32做系列稀释，平行检测20次，将检测结果不低于95%为阳性的稀释比例定为灵敏度。检测结果1:4阳性检出率为100%，1:8阳性检出率为95%，1:16阳性检出率为70%，1:32阳性检出率为20%，因此将1:8稀释比例定为灵敏度。
本发明试剂盒的特异性（抗干扰能力）试验：
临床检验中，血红蛋白浓度为10g/L的溶血、甘油三酯浓度为6mmol/L的脂血、胆红素浓度为1000μmol/L的黄疸，或低于上述浓度时，对本发明试剂盒无干扰。本发明试剂盒不受类风湿因子、抗核抗体的干扰。
选取临床与新型冠状病毒（2019-nCoV）结构相近或临床症状相似的其他病原体IgM、IgG阳性样本（副流感病毒（混合）、肺炎衣原体、肺炎支原体、腺病毒、呼吸道合胞病毒、肺炎链球菌、流感病毒A型、流感病毒B型）各10例，用本发明的试剂盒检测均为阴性，证明本试剂盒特异性好，不与上述常见呼吸道病原体IgM、IgG阳性样本产生交叉反应。
本发明试剂盒临床样本的验证试验：
由于目前临床阳性样本较难验证，目前仅在2家机构收集了20例PCR确诊核酸阳性样本。采用本发明提供的新型冠状病毒（2019-nCoV）IgM、IgG抗体检测试剂盒检测上述20例阳性样本，100例阴性样本，结果见表1：
表1新型冠状病毒（2019-nCoV）临床验证
由以上表格可以看出，特异性IgM、IgG抗体联合检测与PCR核酸检测的符合率为100%。
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，实施方式的举例，其中未详细述及的部分均为本领域普通技术人员的公知常识，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种新型冠状病毒（2019-nCoV）IgM、IgG抗体检测试纸条，包括金标垫层和硝酸纤维素膜，其特征在于：所述金标垫层固相化有2019-nCoV抗原-胶体金复合物或2019-nCoV抗原-抗体-胶体金复合物，所述硝酸纤维素膜包被有鼠抗人IgM抗体的检测线和鼠抗人IgG抗体的检测线。
2.如权利要求1所述的一种新型冠状病毒（2019-nCoV）IgM、IgG抗体检测试纸条，其特征在于：所述金标垫层胶体金颗粒标记2019-nCoV重组抗原或者胶体金颗粒标记2019-nCoV单克隆抗体，再偶联1：5~1：1（抗原：抗体）的2019-nCoV天然抗原。
3.如权利要求1所述的一种新型冠状病毒（2019-nCoV）IgM、IgG抗体检测试纸条，其特征在于：所述金标垫层2019-nCoV抗原-抗体-胶体金复合物的制备包括以下步骤：
采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金，在金溶胶中按15~20μg/mL比例缓慢加入2019-nCoV单克隆抗体，充分反应后，以8000~10000rpm离心30分钟，弃上清，10倍浓缩，然后加入1：5~1：1（抗原：抗体）的2019-nCoV天然抗原，静置反应10~20min，制得2019-nCoV抗原-抗体-胶体金复合物。
4.如权利要求1-3任一项权利要求所述的一种新型冠状病毒（2019-nCoV）IgM、IgG抗体检测试纸条，其特征在于：所述金标垫层还固相化有羊IgG抗体-胶体金复合物或兔IgG抗体-胶体金复合物或鸡IgY抗体-胶体金复合物，所述硝酸纤维素膜还包被有兔抗羊IgG抗体或羊抗兔IgG抗体或山羊抗鸡IgY抗体的质控线。
5.如权利要求4所述的一种新型冠状病毒（2019-nCoV）IgM、IgG抗体检测试纸条，其特征在于：所述鸡IgY抗体-胶体金复合物的制备包括以下步骤：
在金溶胶中按10~15μg/mL比例缓慢加入鸡IgY抗体，充分反应后，以8000~10000rpm离心30分钟，弃上清，10倍浓缩，制得鸡IgY抗体-胶体金复合物；
2019-nCoV抗原-抗体-胶体金复合物按10~15%浓度，鸡IgY抗体-胶体金复合物按3~5%浓度，涂布于玻璃纤维素膜上，干燥。
6.如权利要求4所述的一种新型冠状病毒（2019-nCoV）IgM、IgG抗体检测试纸条，其特征在于：所述硝酸纤维素膜包被步骤如下：
鼠抗人IgM 抗体、鼠抗人IgG抗体以1.2~1.5mg/mL浓度，山羊抗鸡IgY抗体以1.5~2.0mg/mL浓度喷于硝酸纤维素膜上包被并干燥。
7.如权利要求1-3任一项权利要求所述的一种新型冠状病毒（2019-nCoV）IgM、IgG抗体检测试纸条，其特征在于：还包括样品垫层和吸水层，所述吸水层位于硝酸纤维素膜的上方；所述金标垫层及样品垫层位于硝酸纤维素膜的下方，样品垫层一端压住金标垫层一端0.5~1mm，金标垫层另一端压住硝酸纤维素膜一端0.5~1mm，吸水层的一端压住硝酸纤维素膜另一端0.5~1mm。
8.如权利要求7所述的一种新型冠状病毒（2019-nCoV）IgM、IgG抗体检测试纸条，其特征在于：所述样品垫层的制备方法如下：
样品垫处理液为50mM Tris-HCL缓冲液，pH9.0，含0.5%大分子聚合物PVP、0.05~0.2%吐温20、0.01~0.05%曲拉通X-100、0.5%封闭剂酪蛋白、0.1~0.2%抗RBC单抗，涂布于玻璃纤维素膜上，干燥。
9.一种新型冠状病毒（2019-nCoV）IgM、IgG抗体检测试剂盒，其特征在于：包括权利要求1-8任一项权利要求所述的试纸条和样本稀释液，所述样本稀释液由牛血清白蛋白BSA、曲拉通X-100以及防腐剂配制而成。
10. 一种新型冠状病毒（2019-nCoV）IgM、IgG抗体检测方法，其特征在于：所述检测方法包括以下步骤：
（1）检测
a、检测样本为血清、血浆、全血；
b、取血清、血浆10µL，全血20µL到检测卡的加样孔，滴加2滴样本稀释液，15分钟观察结果，20分钟后结果无效；
（2）结果判断
a、阴性：
仅质控线C处出现一条红色条带，在检测线T1、检测线T2处无红色条带出现，阴性结果表明：样本中不含待测抗体；
b、阳性：
（1）、三条红色条带出现，两条红色条带分别出现于检测线T1、检测线T2处，另一条红色条带出现于质控线C处，阳性结果表明：样本中同时含有2019-nCoV IgG、IgM抗体；
（2）、两条红色条带出现，一条红色条带分别出现于检测线T1处，另一条红色条带出现于质控线C处，阳性结果表明：样本中含有2019-nCoV IgG抗体；
（3）、两条红色条带出现，一条红色条带分别出现于检测线T2处，另一条红色条带出现于质控线C处，阳性结果表明：样本中含有2019-nCoV IgM抗体；
c、无效：质控线C处未出现红色条带，表明操作失误或试剂失效。
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