CN111638331A - 尿液中梅毒螺旋体抗体检测试剂盒、制备方法及使用方法 - Google Patents

尿液中梅毒螺旋体抗体检测试剂盒、制备方法及使用方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了尿液中梅毒螺旋体抗体检测试剂盒、制备方法及使用方法，包括检测试纸条，检测试纸条包括样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜、吸水纸和PVC底板，所述样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水纸依次粘附在PVC底板上，所述结合垫上包被有重组蛋白A（SPA）‑胶体金标记物，所述硝酸纤维素膜上分别包被有TP重组抗原构成的检测线和兔抗SPA构成的质控线。另外，本发明通过浓缩介质将尿液标本浓缩，以提高尿液中梅毒螺旋体抗体的含量，从而提高了梅毒螺旋体抗体胶体金检测试剂盒的灵敏度。可使检测灵敏度提高2‑6倍。本发明以尿液为检测样本，取样安全、简便、无创。且灵敏度高，特异性强，操作便捷，适于各种条件的检测。

Description

尿液中梅毒螺旋体抗体检测试剂盒、制备方法及使用方法
技术领域
本发明涉及尿液中梅毒螺旋体抗体检测技术领域，具体为尿液中梅毒螺旋体抗体检测试剂盒、制备方法及使用方法。
背景技术
梅毒是由梅毒螺旋体感染所致的慢性性传播疾病，主要通过性接触直接传播，接吻、手术、哺乳、输血和接触污染物也可被传染，可侵犯多系统多脏器，其临床症状复杂，易被漏诊和误诊。梅毒实验室诊断方法主要有分子生物学诊断、病原学诊断和血清学诊断三大类，因前两类方法实验条件要求高，仅限于科研单位和教学机构使用，血清学诊断是临床广泛使用的方法。目前，临床实验室血清学诊断最常用的梅毒抗体检测方法为梅毒螺旋体抗体酶联免疫吸附试验（ＴＰ－ＥＬＩＳＡ）、梅毒甲苯胺红血清不加热血清试验（ＴＲＵＳＴ）、梅毒螺旋体抗体明胶颗粒凝集试验（ＴＰＰＡ）。
梅毒作为一种严重危害人类健康的性传播疾病，选择敏感性高、特异性强的检测方法对于梅毒的确证和临床指导应用均具有很重要的意义。血清学梅毒螺旋体抗体检测法是目前梅毒实验室诊断的主要方法，但血清取样麻烦、有创、且有感染风险。尿液取样方便、安全、无创，但尿液中梅毒螺旋体抗体含量很低，试剂灵敏度很难达到检测水平。
发明内容
本发明要解决的技术问题是克服现有的缺陷，提供尿液中梅毒螺旋体抗体检测试剂盒、制备方法及使用方法，检测样本为尿液，和血清相比，取样无创、方便、安全、易得，操作便捷，安全无创，不需要特殊设备及专业培训，适于各种条件下的应用，通过浓缩介质对尿液进行浓缩，对试剂灵敏度有很大提高可以有效解决背景技术中的问题。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：尿液中梅毒螺旋体抗体检测试剂盒，包括检测试纸条，所述检测试纸条由在PVC板上固定的样品垫、结合垫、包被检测线和质控线的硝酸纤维素膜、吸水纸组成，结合垫上包被有金标SPA，硝酸纤维素膜检测线上包被有梅毒螺旋体重组抗原，质控线上包被有兔抗SPA。
尿液中梅毒螺旋体抗体检测试剂盒的制备方法，包括以下步骤；
1）胶体金的制备：用氯金酸溶液和柠檬酸三钠溶液制备小颗粒胶体金溶液；
2）重组蛋白A标记：将重组蛋白A加入小颗粒胶体金溶液中，制备重组蛋白A-胶体金标记物；
3）结合垫的制备：将重组蛋白A-胶体金标记物浸泡玻璃纤维，制得结合垫；
4）TP重组抗原包被：在硝酸纤维素膜上分别包被TP重组抗原构成的检测线和兔抗SPA构成的质控线；
5）试纸的制备：将样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水纸依次固定在PVC底板上，即得。
进一步的，在结合垫的制备时，以氯金酸-柠檬酸钠还原法制备25nm胶体金溶液，制备完成后取100ml，用0.2M K2CO3调PH至8.0，按15ug/ml标记浓度加入SPA，室温搅拌30min，按0.5%终浓度加入10%BSA，室温搅拌30min，11000rpm转速于离心机中离心50分钟后，弃上清，加入胶体金复溶液定容至100ml，按照30cm2/ml比例将溶液均匀地铺在玻璃纤维上，干燥制成胶体金垫。
进一步的，在硝酸纤维素膜的包被时，将梅毒螺旋体重组抗原及兔抗SPA分别溶解在包被液中，配制成0.8mg/ml 质控线、检测线包被液，用划膜仪在硝酸纤维素膜上以1ul/cm参数进行划线，包被质控线、检测线。
进一步的，包被好的硝酸纤维素膜在35℃±3℃，30%±3%湿度环境下干燥6-12小时。
进一步的，样品垫的制备：将玻璃纤维或无纺布中的一种浸泡于0.05M PH=8.0的Tris-Hcl缓冲液中1小时，取出室温晾干，密封备用。
进一步的，试纸条的组装时，将制备好的硝酸纤维素膜、胶体金垫、样品垫及吸水纸分别粘附在PVC大板上，粘贴不干胶保护金垫，切条后包装。
尿液中梅毒螺旋体抗体检测试剂盒的使用方法，使用浓缩介质，利用其理化特性对尿液样本进行浓缩，然后使用检测试纸条对尿液样本检测。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：本尿液中梅毒螺旋体抗体检测试剂盒、制备方法及使用方法，具有以下好处：
1、本发明检测样本为尿液，和血清相比，取样无创、方便、安全、易得；
2、本发明通过浓缩介质对尿液进行浓缩，操作简单，回收率高。
3、本发明通过浓缩介质对尿液进行浓缩，对试剂灵敏度有很大提高，约2-6倍。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明提供一种技术方案：尿液中梅毒螺旋体抗体检测试剂盒，包括检测试纸条，所述检测试纸条由在PVC板上固定的样品垫、结合垫、包被检测线和质控线的硝酸纤维素膜、吸水纸组成，结合垫上包被有金标SPA，硝酸纤维素膜检测线上包被有梅毒螺旋体重组抗原，质控线上包被有兔抗SPA。
尿液中梅毒螺旋体抗体检测试剂盒的制备方法，包括以下步骤；
1）胶体金的制备：用氯金酸溶液和柠檬酸三钠溶液制备小颗粒胶体金溶液；
2）重组蛋白A标记：将重组蛋白A加入小颗粒胶体金溶液中，制备重组蛋白A-胶体金标记物；
3）结合垫的制备：将重组蛋白A-胶体金标记物浸泡玻璃纤维，制得结合垫；
4）TP重组抗原包被：在硝酸纤维素膜上分别包被TP重组抗原构成的检测线和兔抗SPA构成的质控线；
5）试纸的制备：将样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水纸依次固定在PVC底板上，即得。
尿液中梅毒螺旋体抗体检测试剂盒的使用方法，使用浓缩介质，利用其理化特性对尿液样本进行浓缩，然后使用检测试纸条对尿液样本检测。
使用时：
1.硝酸纤维素膜的包被；
将梅毒螺旋体重组抗原及兔抗SPA分别溶解在包被液（20mM PB，2%蔗糖）中，配制成0.8mg/ml 质控线、检测线包被液，用划膜仪在硝酸纤维素膜上以1ul/cm参数进行划线，包被质控线、检测线。包被好的硝酸纤维素膜在35℃±3℃，30%±3%湿度环境下干燥6-12小时。
2.结合垫的制备；
以氯金酸-柠檬酸钠还原法制备25nm胶体金溶液。制备完成后取100ml，用0.2M K2CO3调PH至8.0，按15ug/ml标记浓度加入SPA，室温搅拌30min；按0.5%终浓度加入10%BSA，室温搅拌30min。11000rpm转速于离心机中离心50分钟后，弃上清。加入胶体金复溶液定容至100ml，按照30cm2/ml比例将溶液均匀地铺在玻璃纤维上，干燥制成胶体金垫。
3.样品垫的制备；
将玻璃纤维或无纺布浸泡于0.05M PH=8.0的Tris-Hcl缓冲液中1小时，取出室温晾干，密封备用。
4.试纸条的组装；
将制备好的硝酸纤维素膜、胶体金垫、样品垫及吸水纸分别粘附在PVC大板上，粘贴不干胶保护金垫，切条后包装。
5.检测方法；
a.对照组；
胶体金试纸条插入到尿样中，15到20min，观测结果。
b.实验组；
取0.6ml尿液垂直加入到含100mg浓缩介质的样品管中，静置2至3分钟；将胶体金试纸条插入到样品管底部，15到20min，观测结果。
6.检测结果的解释
阳性（+）：质控线和检测线均显色。
阴性（-）：仅质控线显色。
无效：质控线不显色。（试纸条因变质损坏或不正确操作而失效，建议重新检测。）
检测10份阳性样本和10份阴性样本，对比对照组和实验组检测线显色深浅。结果显示10份阳性样本实验组比对照组检测线明显变深，说明尿液经过浓缩介质浓缩，梅毒螺旋体抗体浓度变高，显著提高了梅毒螺旋体抗体检测试剂盒的灵敏度；10份阴性样本，实验组和对照组检测线均不显色，说明该浓缩介质并不影响试剂的特异性。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。

Claims (8)

1.尿液中梅毒螺旋体抗体检测试剂盒，其特征在于：包括检测试纸条，所述检测试纸条由在PVC板上固定的样品垫、结合垫、包被检测线和质控线的硝酸纤维素膜、吸水纸组成，结合垫上包被有金标SPA，硝酸纤维素膜检测线上包被有梅毒螺旋体重组抗原，质控线上包被有兔抗SPA。
2.如权利要求1所述的尿液中梅毒螺旋体抗体检测试剂盒的制备方法，其特征在于：包括以下步骤；
1）胶体金的制备：用氯金酸溶液和柠檬酸三钠溶液制备小颗粒胶体金溶液；
2）重组蛋白A标记：将重组蛋白A加入小颗粒胶体金溶液中，制备重组蛋白A-胶体金标记物；
3）结合垫的制备：将重组蛋白A-胶体金标记物浸泡玻璃纤维，制得结合垫；
4）TP重组抗原包被：在硝酸纤维素膜上分别包被TP重组抗原构成的检测线和兔抗SPA构成的质控线；
5）试纸的制备：将样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水纸依次固定在PVC底板上，即得。
3. 根据权利要求2所述的尿液中梅毒螺旋体抗体检测试剂盒的制备方法，其特征在于：在结合垫的制备时，以氯金酸-柠檬酸钠还原法制备25nm胶体金溶液，制备完成后取100ml，用0.2M K2CO3调PH至8.0，按15ug/ml标记浓度加入SPA，室温搅拌30min，按0.5%终浓度加入10%BSA，室温搅拌30min，11000rpm转速于离心机中离心50分钟后，弃上清，加入胶体金复溶液定容至100ml，按照30cm2/ml比例将溶液均匀地铺在玻璃纤维上，干燥制成胶体金垫。
4. 根据权利要求2所述的尿液中梅毒螺旋体抗体检测试剂盒的制备方法，其特征在于：在硝酸纤维素膜的包被时，将梅毒螺旋体重组抗原及兔抗SPA分别溶解在包被液中，配制成0.8mg/ml 质控线、检测线包被液，用划膜仪在硝酸纤维素膜上以1ul/cm参数进行划线，包被质控线、检测线。
5.根据权利要求4所述的尿液中梅毒螺旋体抗体检测试剂盒的制备方法，其特征在于：包被好的硝酸纤维素膜在35℃±3℃，30%±3%湿度环境下干燥6-12小时。
6. 根据权利要求2所述的尿液中梅毒螺旋体抗体检测试剂盒的制备方法，其特征在于：样品垫的制备：将玻璃纤维或无纺布中的一种浸泡于0.05M PH=8.0的Tris-Hcl缓冲液中1小时，取出室温晾干，密封备用。
7.根据权利要求2所述的尿液中梅毒螺旋体抗体检测试剂盒的制备方法，其特征在于：试纸条的组装时，将制备好的硝酸纤维素膜、胶体金垫、样品垫及吸水纸分别粘附在PVC大板上，粘贴不干胶保护金垫，切条后包装。
8.如权利要求1所述的尿液中梅毒螺旋体抗体检测试剂盒的使用方法，其特征在于：使用浓缩介质，利用其理化特性对尿液样本进行浓缩，然后使用检测试纸条对尿液样本检测。
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