CN101661040A - 梅毒螺旋体抗体唾液快速检测试纸条 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种梅毒螺旋体抗体唾液快速检测试纸条，包括底板，底板上依次粘贴有样品垫、胶体金垫、硝酸纤维素膜以及吸样垫，其特征在于：所述的胶体金垫上附着有胶体金标记的可与梅毒螺旋体抗体特异性结合的鼠抗人IgG抗体，所述的硝酸纤维素膜上包被有由梅毒螺旋体抗原构成的检测线以及由可与鼠抗人IgG抗体特异性结合的羊抗鼠二抗抗体构成的质控线。本发明试纸条采用胶体金标记技术，检测唾液中的梅毒螺旋体抗体，从而判断是否患有梅毒，具有操作简单、反应快速、敏感性高、特异性强、适合现场检测和自检、经济实用等优点。
Description
技术领域
本发明涉及生物检测技术领域，尤其涉及一种梅毒螺旋体抗体唾液快速检测试纸条。
背景技术
梅毒是由苍白(梅毒)螺旋体引起的慢性、系统性性传播疾病(VD，STD)。绝大多数是通过性途径传播，临床上可表现为一期梅毒、二期梅毒、三期梅毒和潜伏梅毒。它是<中华人民共和国传染病防治法>中列为乙类防治管理的病种。
梅毒螺旋体(Tre-ponema palidum)1905年由法国科学家Schaudinn与Hoffmanu发现并报告的。因其透明不易着色，又称之为苍白螺旋体。梅毒螺旋体是厌氧菌，在体内可长期生存繁殖，只要条件适宜，便以横断裂方式一分为二的进行繁殖。梅毒通过性行为可以在人群中相互传播，并可以由母亲传染给胎儿，危及下一代。极少数患者通过接吻、哺乳、接触病人的日常用品而传染。在性传播疾病中，梅毒的患病人数是低的，但由于其病程长，危害性大，因此得到人们的重视。
梅毒在全世界流行，据WHO估计，全球每年约有1200万新发病例，主要集中在南亚、东南亚和次撒哈拉非洲。梅毒于1505年经印度传入我国广东，至今已近500年。解放前是中国四大性病之首，60年代初基本被消灭，80年代再次发生和流行。1991年报告病例数为1870例，1995年11336例，1997年33668例。1997年以来占报告8种性病的比例在6％以上，呈明显增多趋势，临床经常可见一、二期梅毒，也已发现三期梅毒和先天梅毒。
目前，检测梅毒最常用的方法是免疫检测，此方法以抗原-抗体的特异性识别为基础，包括传统的酶联免疫吸附试验(ELISA)和近来兴起的胶体金法两种。胶体金法分为免疫层析和免疫渗滤两种方式，其中以免疫层析法最为方便、快捷。
免疫层析胶体金技术是新型的诊断技术，已得到较为广泛的应用，基本原理如下：利用胶体金标记一种抗原或抗体，在试纸条的硝酸纤维素膜上包被相应的配对抗原或抗体，检测时当样品中含有相应的特异性抗体或抗原时，胶体金标记颗粒和样品中配体相结合形成复合物，然后在硝酸纤维素膜上层析，再被包被的抗原或抗体捕获，形成肉眼可见的检测线(T线)，通过检测线的有无实现对结果的判定。但现有的试纸条大多以血液为样品，不适合现场检测和自检，检测成本较高。
发明内容
本发明提供了一种梅毒螺旋体抗体唾液快速检测试纸条，该试纸条可以用唾液作为样品，解决了现有试纸条不适合现场检测，检测成本较高的问题。
一种梅毒螺旋体抗体唾液快速检测试纸条，包括底板，底板上依次粘贴有样品垫、胶体金垫、硝酸纤维素膜以及吸样垫，所述的胶体金垫上附着有胶体金标记的可与梅毒螺旋体抗体特异性结合的鼠抗人IgG抗体，所述的硝酸纤维素膜上包被有由梅毒螺旋体抗原构成的检测线以及由可与鼠抗人IgG抗体特异性结合的羊抗鼠二抗抗体构成的质控线。
所述的梅毒螺旋体抗体是医学上检测人体是否感染梅毒螺旋体的标记物，该标记物大量存在于人体血液中，在唾液中也有少量存在。所述的梅毒螺旋体抗原是指人重组梅毒螺旋体抗原，可与梅毒螺旋体抗体特异性结合。人重组梅毒螺旋体抗原、鼠抗人IgG抗体以及羊抗鼠二抗抗体均是市售产品，也可以通过现有方法制备获得。
所述的胶体金垫上附着有0.14～0.23μg/cm2所述的鼠抗人IgG抗体，在该范围内的抗体量满足试纸条以唾液为样品进行检测的灵敏度要求。
所述的胶体金垫制备方法如下：
取胶体直径为15～35nm的胶体金溶液，调节pH值至8.0～8.2，以每100ml胶体金溶液计，加入0.55～1.0mg的可与梅毒螺旋体抗体特异性结合的鼠抗人IgG抗体，搅拌后用牛血清蛋白封闭，离心去上清液，加入相同体积的胶体金溶液复溶，将每毫升溶液均匀铺在40cm2玻璃纤维膜上，干燥后制得胶体金垫。
所述的检测线中梅毒螺旋体抗原的含量为0.04～1.0μg/cm；所述的质控线中可与所述的羊抗鼠二抗抗体含量为0.04～1.0μg/cm。在该范围内的抗体量满足试纸条以唾液为样品进行检测的灵敏度要求。
所述的检测线包被方法如下：
将所述的梅毒螺旋体抗原溶解在磷酸缓冲溶液中制得浓度为0.04～1.0mg/ml溶液，利用该溶液以1～1.5μl/cm的用量在硝酸纤维素膜的一端划线，干燥后即得检测线。
所述的质控线包被方法如下：
将可与所述的鼠抗人IgG抗体特异性结合的羊抗鼠二抗抗体溶解在磷酸缓冲溶液中制得浓度为0.04～1.0mg/ml溶液，利用该溶液以1～1.5μl/cm的用量在硝酸纤维素膜的另一端划线，干燥后即得质控线。
所述的磷酸缓冲溶液浓度优选为0.01M，pH值优选为8.0～8.2。
本发明还提供了上述梅毒螺旋体抗体唾液快速检测试纸条的检测方法，包括以下步骤：
取人唾液，用磷酸缓冲溶液稀释，取50～100μl稀释后的唾液滴在样品垫上，根据检测线(T线)和质控线(C线)的显色状态，判断检测结果。
如C、T线均出现，判定样品为阳性；C线出现，T线不出现，判定样品为阴性；C、T线都不出现或者C线不出现T线出现，均判定检测无效。
本发明试纸条采用胶体金标记技术，检测唾液中的梅毒螺旋体抗体，从而判断是否患有梅毒，具有操作简单、反应快速、敏感性高、特异性强、适合现场检测和自检、经济实用等优点。
具体实施方式
实施例1
胶体金垫的制备
以氯金酸-柠檬酸三钠还原法制备直径15nm的胶体金溶液，制备完成后取100ml胶体金溶液于烧杯内，用0.1M K2CO3调至pH8.0，加入0.55mg可与梅毒螺旋体抗体特异性结合的鼠抗人IgG抗体(上海领潮生物科技有限公司)，室温搅拌1小时，加入重量百分比为5％的牛血清白蛋白(BSA)封闭1小时，12000rpm、4℃离心30分钟，弃上清，用胶体金溶液复溶至100ml，按1ml溶液铺40cm2的比例，将溶液均匀地铺在玻璃纤维膜上，37℃干燥30分钟，制成胶体金垫。
硝酸纤维素膜的包被
将可与梅毒螺旋体抗体特异性结合的人重组梅毒螺旋体抗原(上海领潮生物科技有限公司)溶解在0.01M、pH8.0磷酸缓冲液(PBS)配制成0.04mg/ml的溶液，用喷膜仪在硝酸纤维素膜一端以1μl/cm的参数进行划线。
将可与上述鼠抗人IgG抗体特异性结合的羊抗鼠二抗抗体(上海领潮生物科技有限公司)溶解在0.01M、pH8.0磷酸缓冲液(PBS)配制成0.04mg/ml的溶液，用喷膜仪在硝酸纤维素膜另一端以1μl/cm的参数进行划线。划线后在室温下干燥8小时，分别得到检测线和质控线。
检测试纸的组装
在干燥室内，温度20～25℃，湿度小于30％，将样品垫(玻璃纤维膜)、胶体金垫、硝酸纤维素膜以及吸样垫(吸水试纸)粘贴在底板上，其中硝酸纤维素膜位于底板中部，硝酸纤维素膜包被有T线的一端与胶体金垫的1/3搭接，包被有C线的一端与吸样垫的1/10搭接，样品垫与胶体金垫的1/5搭接。最后切成宽度为2.5mm的试纸条，也可将试纸条装入一个塑料卡中制成检测卡。
实施例2
胶体金垫的制备
以氯金酸-柠檬酸三钠还原法制备直径35nm的胶体金溶液，制备完成后取100ml胶体金溶液于烧杯内，用0.1M K2CO3调至pH8.2，加入1.0mg可与梅毒螺旋体抗体特异性结合的鼠抗人IgG抗体(上海领潮生物科技有限公司)，室温搅拌1小时，加入重量百分比为5％的牛血清白蛋白(BSA)封闭1小时，12000rpm、4℃离心30分钟，弃上清，用胶体金溶液复溶至100ml，按1ml溶液铺40cm2的比例，将溶液均匀地铺在玻璃纤维膜上，37℃干燥30分钟，制成胶体金垫。
硝酸纤维素膜的包被
将可与梅毒螺旋体抗体特异性结合的人重组梅毒螺旋体抗原(上海领潮生物科技有限公司)分别溶解在0.01M、pH8.0磷酸缓冲液(PBS)配制成1.0mg/ml的溶液，用喷膜仪在硝酸纤维素膜一端以1.5μl/cm的参数进行划线。
将可与上述鼠抗人IgG抗体特异性结合的羊抗鼠二抗抗体(上海领潮生物科技有限公司)溶解在0.01M、pH8.0磷酸缓冲液(PBS)配制成1.0mg/ml的溶液，用喷膜仪在硝酸纤维素膜另一端以1.5μl/cm的参数进行划线。划线后在室温下干燥8小时，分别得到检测线和质控线。
检测试纸的组装
在干燥室内，温度20～25℃，湿度小于30％，将样品垫(玻璃纤维膜)、胶体金垫、硝酸纤维素膜以及吸样垫(吸水试纸)粘贴在底板上，其中硝酸纤维素膜位于底板中部，硝酸纤维素膜包被有T线的一端与胶体金垫的1/3搭接，包被有C线的一端与吸样垫的1/10搭接，样品垫与胶体金垫的1/5搭接。最后切成宽度为2.5mm的试纸条，也可将试纸条装入一个塑料卡中制成检测卡。
临床样品试验
待检人在采集唾液样品前30分钟禁食，取每位待检人唾液0.5ml于纸杯中，用吸管取两滴滴加到浓度0.02M、pH8.0的磷酸缓冲溶液中稀释，取稀释的唾液100μl加到样品垫中，肉眼观测30分钟，记录T线和C线的显色状态。同时将唾液样品用梅毒螺旋体抗体ELISA试剂盒检测，若两者检测检测结果不一致，再以另外两种梅毒螺旋体抗体ELISA试剂盒进行检测，若两种或以上的ELISA试剂为阳性，判定结果为阳性，两种或以上的ELISA试剂为阴性，判定结果为阴性。
收集唾液样品163份，其中ELISA试剂盒检测出阳性样品45份，本发明试纸条(实施例1)检测出阳性样品46份，具体结果如下表1所示：
表1本发明试纸条对临床样品梅毒螺旋体抗体的检测结果
灵敏度＝45/45＝100％；特异性＝117/118＝99.2％
Claims (6)
1、一种梅毒螺旋体抗体唾液快速检测试纸条，包括底板，底板上依次粘贴有样品垫、胶体金垫、硝酸纤维素膜以及吸样垫，其特征在于：所述的胶体金垫上附着有胶体金标记的可与梅毒螺旋体抗体特异性结合的鼠抗人IgG抗体，所述的硝酸纤维素膜上包被有由梅毒螺旋体抗原构成的检测线以及由可与鼠抗人IgG抗体特异性结合的羊抗鼠二抗抗体构成的质控线。
2、根据权利要求1所述的梅毒螺旋体抗体唾液快速检测试纸条，其特征在于：所述的胶体金垫上附着有0.14～0.23μg/cm2可与梅毒螺旋体抗体特异性结合的鼠抗人IgG抗体。
3、根据权利要求1或2所述的梅毒螺旋体抗体唾液快速检测试纸条，其特征在于，所述的胶体金垫制备方法如下：
取胶体直径为15～35nm的胶体金溶液，调节pH值至8.0～8.2，以每100ml胶体金溶液计，加入0.55～1.0mg可与梅毒螺旋体抗体特异性结合的鼠抗人IgG抗体，搅拌后用牛血清蛋白封闭，离心去上清液，加入相同体积的胶体金溶液复溶，将每毫升溶液均匀铺在40cm2玻璃纤维膜上，干燥后制得胶体金垫。
4、根据权利要求1所述的梅毒螺旋体抗体唾液快速检测试纸条，其特征在于：所述的检测线中梅毒螺旋体抗原的含量为0.04～1.0μg/cm；所述的质控线中羊抗鼠二抗抗体含量为0.04～1.0μg/cm。
5、根据权利要求1或4所述的梅毒螺旋体抗体唾液快速检测试纸条，其特征在于，所述的检测线包被方法如下：
将所述的梅毒螺旋体抗原溶解在磷酸缓冲溶液中制得浓度为0.04～1.0mg/ml溶液，利用该溶液以1～1.5μl/cm的用量在硝酸纤维素膜的一端划线，干燥后即得检测线；
所述的质控线包被方法如下：
将可与所述的鼠抗人IgG抗体特异性结合的羊抗鼠二抗抗体溶解在磷酸缓冲溶液中制得浓度为0.04～1.0mg/ml溶液，利用该溶液以1～1.5μl/cm的用量在硝酸纤维素膜的另一端划线，干燥后即得质控线。
6、一种权利要求1所述的梅毒螺旋体抗体唾液快速检测试纸条的检测方法，包括以下步骤：
取人唾液，用磷酸缓冲溶液稀释，取50～100μl稀释后的唾液滴在样品垫上，根据检测线和质控线的显色状态，判断检测结果。
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