CN101614743A - 乙型肝炎病毒表面抗原唾液快速检测试纸条 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种乙型肝炎病毒表面抗原唾液快速检测试纸条，包括底板，底板上依次粘贴有样品垫、胶体金垫、硝酸纤维素膜以及吸样垫，所述的胶体金垫上附着有胶体金标记的抗乙型肝炎病毒表面抗原的多克隆抗体或第一单克隆抗体；所述的硝酸纤维素膜上包被有由抗乙型肝炎病毒表面抗原的第二单克隆抗体构成的检测线以及由抗所述的多克隆抗体或第一单克隆抗体的二抗抗体构成的质控线，所述的多克隆抗体或第一单克隆抗体与所述的第二单克隆抗体相配对。本发明试纸条采用胶体金标记技术，检测唾液中的乙型肝炎病毒表面抗原成分，从而判断是否感染乙肝病毒，具有操作简单、反应快速、敏感性高、特异性强、适合现场检测和自检，具有经济实用等优点。
Description
技术领域
本发明涉及生物应用技术领域，特别是涉及一种乙型肝炎病毒表面抗原唾液快速检测试纸条。
背景技术
乙型病毒性肝炎是由乙型肝炎病毒(HBV)引起的一种世界性疾病。发展中国家发病率高，据统计，全世界无症状乙肝病毒携带者(HBsAg携带者)超过2.8亿，我国约占9300万。多数无症状，其中1/3出现肝损害的临床表现。目前我国有乙肝患者3000万。乙肝的特点为起病较缓，以亚临床型及慢性型较常见。无黄疸型HBsAg持续阳性者易慢性化。本病主要通过血液、母婴和性接触进行传播。乙肝疫苗的应用是预防和控制乙型肝炎的根本措施。
中国是人口大国，同时也是″肝炎大国″。我国有40％左右的人感染过HBV，其中约有10％的人携带HBsAg，快速准确地检测和普查HBsAg，对于乙型肝炎的预防、诊断和治疗，具有极大的实用价值。据1992年全国病毒性肝炎流行病学调查，中国有6亿人曾感染过乙型肝炎病毒，大部分已经痊愈，但还有1.2亿人携带乙型肝炎病毒。
目前，检测以上传染病最常用的方法是免疫检测，此方法以抗原-抗体的特异性识别为基础，包括传统的酶联免疫吸附试验(ELISA)和近来兴起的胶体金法两种。胶体金法分为免疫层析和免疫渗滤两种方式，其中以免疫层析法最为方便、快捷。
免疫层析胶体金技术是新型的诊断技术，已得到较为广泛的应用，基本原理如下：利用胶体金标记一种抗原或抗体，在试纸条的硝酸纤维素膜上包被相应的配对抗原或抗体，检测时当样品中含有相应的特异性抗体或抗原时，胶体金标记颗粒和样品中配体相结合形成复合物，然后在硝酸纤维素膜上层析，再被包被的抗原或抗体捕获，形成肉眼可见的检测线(T线)，通过检测线的有无实现对结果的判定。具有操作简便、反应快速、敏感性高、特异性强和经济实用等优点。但现有的试纸条大多以血液为样品，不适合现场检测，检测成本较高。
发明内容
本发明提供了一种乙型肝炎病毒表面抗原唾液快速检测试纸条，该试纸条可以用唾液作为样品，解决了现有试纸条不适合现场检测，检测成本较高的问题。
一种乙型肝炎病毒表面抗原唾液快速检测试纸条，包括底板，底板上依次粘贴有样品垫、胶体金垫、硝酸纤维素膜以及吸样垫，所述的胶体金垫上附着有胶体金标记的抗乙型肝炎病毒表面抗原的多克隆抗体或第一单克隆抗体；所述的硝酸纤维素膜上包被有由抗乙型肝炎病毒表面抗原的第二单克隆抗体构成的检测线以及由抗所述的多克隆抗体或第一单克隆抗体的二抗抗体构成的质控线，所述的多克隆抗体或第一单克隆抗体与所述的第二单克隆抗体相配对。
上述试纸条与传统的免疫层析检测试纸条的检测原理相同，上述多克隆抗体与第二单克隆抗体配对是指多克隆抗体中的所有抗体和第二单克隆抗体与乙型肝炎病毒表面抗原的不同抗原决定簇结合，上述第一单克隆抗体与第二单克隆抗体相配对是指两者与乙型肝炎病毒表面抗原的不同抗原决定簇结合。
所述的胶体金垫上附着有0.15～0.45μg/cm2的胶体金标记的抗乙型肝炎病毒表面抗原的多克隆抗体或第一单克隆抗体，在该浓度范围内，可以和大多数患者唾液中的待测抗原含量相匹配。
所述的胶体金垫通过如下方法制备：
取胶体直径为15～35nm的胶体金溶液，调节pH值至8.0～8.2，按每100ml胶体金溶液加入0.75～1.0mg的抗乙型肝炎病毒表面抗原的多克隆抗体或第一单克隆抗体，搅拌后用牛血清蛋白封闭，离心去上清液，加入相同体积的胶体金溶液复溶，将每毫升溶液均匀铺在22～50cm2玻璃纤维膜上，干燥后制得胶体金垫。
所述的检测线中抗乙型肝炎表面抗原的第二单克隆抗体含量为0.05～1.0μg/cm；所述的质控线中抗所述的多克隆抗体或第一单克隆抗体的二抗抗体含量为0.05～1.0μg/cm。在该浓度下，正好可以和大多数唾液中的抗原相匹配。
所述的检测线和质控线包被方法如下：
取浓度为0.01mol/L、pH为8.0的磷酸缓冲溶液，将第二抗乙型肝炎病毒表面抗原的单克隆抗体和抗所述的多克隆抗体或第一单克隆抗体的二抗抗体分别溶解磷酸缓冲溶液中制得浓度均为0.05～1.0mg/ml的两种溶液，将该两种溶液以1～1.5μl/cm的参数分别在硝酸纤维素膜两端划线，干燥后即得检测线和质控线。
所述的试纸条的宽度为2.5～6mm。
本发明还提供了一种上述试纸条的检测方法，包括以下步骤：取人唾液，用磷酸缓冲溶液稀释，取50～100μl稀释后的唾液滴在样品垫上，根据检测线(T线)和质控线(C线)的显色状态，判断检测结果。
如C、T线均出现，判定样品为阳性；C线出现，T线不出现，判定样品为阴性；C、T线都不出现或者C线不出现T线出现，均判定试纸无效。
本发明试纸条采用胶体金标记技术，检测唾液中的乙型肝炎病毒表面抗原成分，从而判断是否感染乙肝病毒，具有操作简单、反应快速、敏感性高、特异性强、适合现场检测和自检，具有经济实用等优点。
具体实施方式
实施例1
胶体金垫的制备
以氯金酸-柠檬酸三钠还原法制备直径15nm的胶体金溶液，制备完成后取100ml胶体金溶液于烧杯内，用0.1M K2CO3调至pH8.0，按100ml胶体金溶液加入0.75mg相应抗乙型肝炎病毒表面抗原的多克隆抗体(上海领潮生物科技有限公司)，室温搅拌1小时，加入重量百分比为5％的牛血清白蛋白(BSA)封闭1小时，12000rpm、4℃离心30分钟，弃上清，用胶体金溶液复溶至100ml，按1ml溶液铺22cm2的比例，将溶液均匀地铺在玻璃纤维膜上，37℃干燥30分钟，制成胶体金垫。
硝酸纤维素膜的包被
将抗乙型肝炎病毒表面抗原的第二单克隆抗体(上海领潮生物科技有限公司)以及抗上述多克隆抗体的二抗抗体(羊抗鼠、上海领潮生物科技有限公司)溶解在0.01M、pH8.0磷酸缓冲液(PBS)配制成0.05mg/ml的溶液，用喷膜仪分别在硝酸纤维素膜两端以1.5μl/cm的参数进行划线，包被T线和C线，划线后将硝酸纤维素膜在室温干燥8小时。
上述抗乙型肝炎病毒表面抗原的多克隆抗体与第二单克隆抗体相配对。
检测试纸的组装
在干燥室内，温度20～25℃，湿度小于30％，将样品垫(玻璃纤维膜)、胶体金垫、硝酸纤维素膜以及吸样垫(吸水试纸)粘贴在底板上，其中硝酸纤维素膜位于底板中部，硝酸纤维素膜包被有T线的一端与胶体金垫的1/3搭接，包被有C线的一端与吸样垫的1/10搭接，样品垫与胶体金垫的1/5搭接。最后切成宽度为2.5mm的试纸条，也可将试纸条装入一个塑料卡中制成检测卡。
实施例2
胶体金垫的制备
以氯金酸-柠檬酸三钠还原法制备直径35nm的胶体金溶液，制备完成后取100ml胶体金溶液于烧杯内，用0.1M K2CO3调至pH8.2，向胶体金溶液加入1mg相应抗乙型肝炎病毒表面抗原的第一单克隆抗体(上海领潮生物科技有限公司)，室温搅拌1小时，加入重量百分比为5％的牛血清白蛋白(BSA)封闭1小时，12000rpm、4℃离心30分钟，弃上清，用胶体金稀释液复溶至100ml，按1ml溶液铺50cm2的比例，将溶液均匀的铺在玻璃纤维膜上，37℃干燥30分钟，制成胶体金垫。
硝酸纤维素膜的包被
将抗乙型肝炎病毒表面抗原的第二单克隆抗体(上海领潮生物科技有限公司)以及抗上述第一单克隆抗体的二抗抗体(羊抗鼠、上海领潮生物科技有限公司)溶解在0.01M、pH8.2磷酸缓冲液(PBS)配制成0.1mg/ml的溶液，用喷膜仪分别在硝酸纤维素膜两端以1μl/cm的参数进行划线，包被T线和C线，划线后将硝酸纤维素膜在室温干燥8小时。
上述抗乙型肝炎病毒表面抗原的第一单克隆抗体与第二单克隆抗体相配对。
检测试纸的组装
在干燥室内，温度20～25℃，湿度小于30％，将样品垫(玻璃纤维膜)、胶体金垫、硝酸纤维素膜以及吸样垫(吸水试纸)依次粘贴在底板上，其中硝酸纤维素膜位于底板中部，硝酸纤维素膜包被有T线的一端与胶体金垫的1/3搭接，包被有C线的一端与吸样垫的1/10搭接，样品垫与胶体金垫的1/5搭接。最后切成宽度为6mm的试纸条，也可将试纸条装入一个塑料卡中制成检测卡。
临床样品试验
待检人在采集唾液样品前30分钟禁食，取每位待检人唾液0.5ml于纸杯中，用吸管取两滴滴加到浓度0.02M、pH8.0的磷酸缓冲溶液中稀释，取稀释的唾液100μl加到样品垫中，肉眼观测30分钟，记录T线和C线的显色状态。同时将唾液样品用乙肝病毒表面抗原ELISA试剂盒检测，若两者检测检测结果不一致，再以另外两种乙肝病毒表面抗原ELISA试剂盒进行检测，若两种或以上的ELISA试剂盒为阳性，判定结果为阳性，两种或以上的ELISA试剂盒为阴性，判定结果为阴性。
收集唾液样品150份，其中ELISA试剂盒检测出阳性样品34份，本发明试纸条(实施例1)检测出阳性样品35份，具体结果如下表1所示：
表1本发明试纸条对临床样品乙型肝炎病毒表面抗原的检测结果
灵敏度＝34/34＝100％；特异性＝115/116＝99.1％
Claims (7)
1、一种乙型肝炎病毒表面抗原唾液快速检测试纸条，包括底板，底板上依次粘贴有样品垫、胶体金垫、硝酸纤维素膜以及吸样垫，其特征在于：所述的胶体金垫上附着有胶体金标记的抗乙型肝炎病毒表面抗原的多克隆抗体或第一单克隆抗体；所述的硝酸纤维素膜上包被有由抗乙型肝炎病毒表面抗原的第二单克隆抗体构成的检测线以及由抗所述的多克隆抗体或第一单克隆抗体的二抗抗体构成的质控线，所述的多克隆抗体或第一单克隆抗体与所述的第二单克隆抗体相配对。
2、根据权利要求1所述的乙型肝炎病毒表面抗原唾液快速检测试纸条，其特征在于：所述的胶体金垫上附着有0.15～0.45ug/cm2的胶体金标记的抗乙型肝炎病毒表面抗原的多克隆抗体或第一单克隆抗体。
3、根据权利要求2所述的乙型肝炎病毒表面抗原唾液快速检测试纸条，其特征在于，所述的胶体金垫通过如下方法制备：
取胶体直径为15～35nm的胶体金溶液，调节pH值至8.0～8.2，按每100ml胶体金溶液加入0.75～1.0mg的抗乙型肝炎病毒表面抗原的多克隆抗体或第一单克隆抗体，搅拌后用牛血清蛋白溶液封闭，离心去上清液，加入相同体积的胶体金溶液复溶，然后将每毫升溶液均匀铺在22～50cm2玻璃纤维膜上，干燥后制得胶体金垫。
4、根据权利要求1所述的乙型肝炎病毒表面抗原唾液快速检测试纸条，其特征在于：所述的检测线中抗乙型肝炎表面抗原的第二单克隆抗体含量为0.05～1μg/cm；所述的质控线中抗所述的多克隆抗体或第一单克隆抗体的二抗抗体含量为0.05～1μg/cm。
5、根据权利要求4所述的乙型肝炎病毒表面抗原唾液快速检测试纸条，其特征在于，所述的检测线和质控线包被方法如下：
取浓度为0.01mol/L、pH为8.0～8.2的磷酸缓冲溶液，将抗乙型肝炎病毒表面抗原的第二单克隆抗体和抗所述的多克隆抗体或第一单克隆抗体的二抗抗体分别溶解磷酸缓冲溶液中制得浓度均为0.05～1mg/ml的两种溶液，将该两种溶液以1～1.5μl/cm的参数分别在硝酸纤维素膜两端划线，干燥后即得检测线和质控线。
6、根据权利要求1所述的乙型肝炎病毒表面抗原唾液快速检测试纸条，其特征在于：所述的试纸条的宽度为2.5～6mm。
7、一种权利要求1所述的乙型肝炎病毒表面抗原唾液快速检测试纸条的检测方法，包括以下步骤：取人唾液，用磷酸缓冲溶液进行稀释，取50-100μl稀释后的唾液滴在样品垫上，根据检测线和质控线的显色状态，判断检测结果。
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| CN106706908A (zh) * | 2016-12-23 | 2017-05-24 | 苏州万木春生物技术有限公司 | 一种乙型肝炎病毒表面抗原检测试纸的制备方法 |
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