CN101509920A - 尘螨过敏原快速检测试剂盒及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了尘螨过敏原快速检测试剂盒及其制备方法,试剂盒组成包括置于加样槽中的已固化了粉尘螨与户尘螨过敏原蛋白和人IgE抗体的硝酸纤维膜条,胶体金标记的抗体,缓冲液,分级比色卡。采用该试剂盒,通过目测可定性判断结果,通过使用比色卡可对检测结果进行半定量分级,通过使用定量金标检测仪检测结果进行定量分级。本发明具有简便、快速、灵敏、稳定的优点,为体外辅助诊断确定使患者致敏的尘螨过敏原及过敏反应程度提供了有效的手段。
Description
技术领域
本发明涉及一种检测人血液中尘螨类过敏原特异性抗体IgE含量的尘螨过敏原快速检测试剂盒及其制备方法。
背景技术
过敏性疾病(变态反应疾病)被世界卫生组织(WHO)认为是当今世界性的重大卫生学问题,世界各国变态反应疾病的总发病率约为15%-30%,此类疾病包括过敏性哮喘(外源性哮喘)、过敏性鼻炎、过敏性皮炎等,是临床上的常见病、多发病。
随着我国医疗卫生事业的发展和人们生活水平的提高,许多严重危害人们身体健康的传染病、寄生虫病的发病率、死亡率有较大幅度的下降,但人们生活方式的变化和环境污染,过敏性疾病的发病率却不断上升,严重影响了人们的生活和生存质量。如何防治过敏性哮喘等过敏性疾病是我国医药卫生界急需要迫切解决的任务之一。
过敏性疾病是由于人体吸入、食入或接触过敏原引起的。其中,尘螨是最常见的过敏原(变应原)之一,尘螨过敏占所有过敏性疾病的首位。在哮喘死亡率高的地区,哮喘发作与对尘螨过敏有关,两者之间存在一定的因果关系。
Voorhorst等早在1964年就报道了屋尘中的过敏原主要来自尘螨,尘螨的分泌物、排泄物及其尸体的降解产物都是引起过敏性疾病的过敏原。引起变态反应主要的尘螨种类有屋尘螨(Dermatophagoides pteronyssius)、粉尘螨(Dermatophagoides farinae)等。调查结果显示:在中国华南地区,最主要的室内尘螨为粉尘螨,其次为屋尘螨。近十几年来,逐步证实了尘螨过敏原的组成非常复杂,约含有30种以上的过敏原成份。
IgE介导的过敏反应的致敏过敏原检测在临床上可以通过皮肤试验及各种体外检测方法,如放射性过敏原吸附检测(RAST)、免疫印迹(IS)及酶免疫分析(EIA)等,结合病史、病症的问诊来确定致敏的过敏原。体外检测是测定血液样本中的IgE,特别是过敏原特异性IgE(sIgE)抗体浓度。酶免疫分析中有多种检测结合酶的方法,即荧光法,化学发光法和免疫层析法等,且均有产品被美国FDA批准(Chapman JA et al,2006,Food allergy:a practiceparameter,Ann Allergy Asthma Immunol,96:S1-S68)。美国临床实验室标准化委员会(CLSI)专门制定了人IgE抗体免疫分析方法评价的纲要(I/LA20—A,NCCLS,1997,17(20))。使用免疫层析法,仅用少量样品就可以简便、快速地检测尘螨过敏原,通过目测可定性判断结果,通过使用比色卡可对检测结果进行半定量分级,通过使用定量金标检测仪检测结果进行定量分级,试剂操作方便,既可用于医院床边快速诊断,也可用于社区诊所或乡村医院甚至家庭。尤其适合我国当前的国情。
免疫层析法,采用高度特异性的抗原抗体反应及免疫层析分析技术来定性和半定量检测血清中的特异性IgE抗体。当固化于硝酸纤维膜载体表面的致敏性抗原与病人血清在一起反应后,血清中特异性IgE就会特异地结合到抗原上,此特异结合的抗体被标记的抗人IgE抗体所识别,颜色的强度与血清中特异性IgE含量成比例;根据人血清中特异性IgE的浓度,评判的过敏原的致敏程度。
免疫层析法应用的多种技术,如尘螨过敏原蛋白的提取纯化方法,人IgE抗体和抗人IgE抗体的制备、纯化,胶体金标记抗人IgE抗体的制取纯化等均已成熟,为尘螨过敏原快速检测试剂的商品化生产奠定了技术基础。
发明内容
本发明的目的在于提供一种尘螨过敏原快速检测试剂盒及其制备方法。
本发明的尘螨过敏原快速检测试剂盒,其组成包括:置于加样槽中的已固化了粉尘螨与户尘螨过敏原蛋白和人IgE抗体的硝酸纤维膜条,胶体金标记的抗体,缓冲液,分级比色卡;
其中:
胶体金标记的抗体:胶体金标记的抗人IgE抗体;
缓冲液:0.05mol/L pH8.0的Tris—HCl中含2%胎牛血清,0.15mol/L NaCl,0.5% Tween-20和20mg/L庆大霉素;
分级比色卡:根据国际上通用的特异性IgE抗体浓度和分级标准关系制作的分级比色卡。
本发明中的分级比色卡的颜色强度与血清中特异性IgE含量成比例,随特异性IgE浓度的升高,颜色逐渐变深。
本发明的尘螨过敏原快速检测试剂盒的制备方法,包括如下步骤:
1)粉尘螨与户尘螨过敏原蛋白的制备:将含粉尘螨与户尘螨过敏原蛋白的饲养尘螨经粉碎、脱脂、提取、SDS-PAGE电泳确证、洗脱、干燥;
2)胶体金标记抗体的制备:用胶体金标记抗人IgE抗体;
3)用粉尘螨与户尘螨过敏原蛋白和人IgE抗体固化硝酸纤维膜条,构成测试区和质控区,并封闭;
4)将固化处理过的硝酸纤维膜条放入加样槽中;
5)配制缓冲液:0.05mol/L pH8.0的Tris—HCl中含2%胎牛血清,0.15mol/L NaCl,0.5% Tween-20和20mg/L庆大霉素;
6)根据国际上通用的特异性IgE抗体浓度和分级标准的关系,制作分级比色卡。
上述的加样槽为由聚苯乙烯或聚氯乙烯材料制造的加样槽;
本发明的试剂盒的使用方法,包括如下操作步骤:
(1)将被检测样品加入到加样槽的加样孔中,样品液中的过敏原特异性IgE抗体各自与相应的固相尘螨过敏原蛋白结合,过敏原特异性IgE抗体再与胶体金标记的抗人IgE抗体结合,胶体金标记的抗人IgE抗体同时也与质控区中人IgE相结合。
(2)再将缓冲液加入到加样槽的加样孔中,加快血清标本迁移速度,被结合区域显色;
(3)20—30分钟后,通过目测可定性判断结果,通过使用比色卡可对检测结果进行半定量分级。
为对检测结果进行定量分级,也可使用定量金标检测仪检测结果,定量金标检测仪自身带百分比浓度的计算,是商品化仪器。
本发明的试剂盒的检测原理:固化在硝酸纤维膜条表面上的抗原(粉尘螨与户尘螨过敏原)捕获样品血清中的特异性IgE抗体,胶体金标记抗人IgE抗体识别特异性IgE并与之结合,形成抗原—特异性IgE—胶体金标记抗人IgE抗体的复合物,颜色的强度与血清中特异性IgE含量成比例,通过目测可定性判断结果,通过使用比色卡可对检测结果进行半定量分级,通过使用定量金标检测仪检测结果进行定量分级。
本发明的有益效果在于:
本发明建立了免疫层析法测定样品液中的尘螨过敏原特异性IgE抗体含量,定性或半定量或定量检测致敏过敏原,检测灵敏度小于0.35IU/ml,通过目测可定性判断结果,通过使用比色卡可对检测结果进行半定量分级,通过使用定量金标检测仪检测结果进行定量分级。
本发明的试剂盒具有简便、快速、灵敏、稳定的优点,为体外辅助诊断确定使患者致敏的尘螨过敏原及过敏反应程度提供了有效的手段。既可用于医院床边快速诊断,也可用于社区诊所或乡村医院甚至家庭。
具体实施方式
以下结合实施例进一步说明本发明。
本发明的尘螨过敏原快速检测试剂盒组成包括:置于加样槽中的已固化了粉尘螨与户尘螨过敏原蛋白和人IgE抗体的硝酸纤维膜条,胶体金标记的抗体,缓冲液,分级比色卡;
其中:
胶体金标记的抗体:胶体金标记的抗人IgE抗体;
缓冲液:0.05mol/L pH8.0的Tris—HCl中含2%胎牛血清,0.15mol/L NaCl,0.5% Tween-20和20mg/L庆大霉素;
分级比色卡:根据国际上通用的特异性IgE抗体浓度和分级标准关系制作的分级比色卡。
实施例1
本发明的尘螨过敏原快速检测试剂盒的制备方法:
1.粉尘螨与户尘螨过敏原蛋白的制备
1.1 尘螨蛋白浸提液的制备
取50g饲养的尘螨,加入80ml丙酮或无水乙醇清洗灭活后用多层纱布过滤除去溶剂,风干、研细,再加入100ml乙醚,反复振摇1小时脱脂;挥净乙醚的脱脂粉以1:100(w/v)的量加入0.125mol/l NH4HCO3缓冲液(pH8.3),内含0.1%NaN3溶液室温提取3小时,期间经常搅拌;10000g离心20分钟,上清浸提液-20℃下贮存。
1.2 尘螨过敏原蛋白的提取
(1)将上清浸提液在透析袋(MWCO 10000)中用10mmol/L PBS(pH7.2)透析48小时,期间缓缓搅动PBS溶液,并更换PBS液4次;
(2)透析后的尘螨过敏原蛋白溶液过0.45μm滤膜,并稀释成4mg/ml的蛋白溶液;
(3)尘螨过敏原蛋白溶液灌入SDS-PAGE的胶柱,电泳分离;在分子量10-100kD的区域用病人阳性血清在一个电泳胶柱进行免疫印迹,显色;
(4)切割下其余胶柱过敏原蛋白定位的相应条带,加入适量PBS溶液后,室温2000g离心10分钟;
(5)测出过敏原蛋白溶液的浓度,加入适量防腐剂,-20℃下冷冻贮存。
2.胶体金标记抗体的制备
2.1 胶体金制备
胶体金的制备采用还原法。氯金酸(HAuCl4)与柠檬酸钠反应制备胶体金,具体操作方法如下:a.将HAuCl4先配制成0.01%水溶液,取100ml加热至沸;b.搅动下加入质量浓度1%柠檬酸三钠(Na3C6H5O7·2H2O)水溶液;c.继续加热煮沸15min。此时可观察到淡黄色的氯金酸水溶液在柠檬酸钠加入后很快变灰色,续而转成黑色,随后逐渐稳定成红色。全过程约2~3min;冷却至室温后用蒸馏水恢复至原体积。用此法可制备5nm~80nm粒径的胶体金。胶体金颗粒的大小取决于制备时加入的柠檬酸三钠的量。
2.2 胶体金标记抗人IgE抗体
用胶体金标记蛋白质,就是指蛋白质吸附到胶体金颗粒表面。胶体金表面带有负电荷,能与蛋白质的正电荷静电吸引而形成牢固的结合。由于这种结合主要是物理作用,所以不会引起蛋白质活性的改变。标记前,需确定胶体金与待标记蛋白质的比例和将pH值调节到标记蛋白质IgE的等电点或略高(pH8.2)。标记时,将待标记抗人IgE抗体1mg加15ml胶体金溶液(1OD),混合,室温搅拌15分钟,在磁性搅拌下加入质量浓度5%的牛血清白蛋白(BSA)使其终浓度为1%,混合5分钟,离心,再通过离心法或凝胶层析法纯化标记的抗人IgE抗体。放在4℃达2年半仍然保持良好性能。
3.用尘螨过敏原蛋白固化硝酸纤维膜条
3.1 材料和仪器
(1)活化处理过的硝酸纤维素膜(Millipore,MDI,S&S,whatman等国外公司的硝酸纤维素膜),能与蛋白质分子中的氨基基团反应形成稳定的共价键。
(2)尘螨过敏原蛋白;
(3)0.05mol/L Tris—HCl缓冲液(pH8.0)或活化增强剂;
(4)0.01mol/L PBS溶液;
(5)3%BSA封闭液;
(6)微量点样系统;
(7)金属箔袋及真空封口机等。
3.2 步骤
(1)尘螨过敏原蛋白的硝酸纤维素膜条制备
采用Millipore,MDI,S&S,whatman中等流速的硝酸纤维素滤膜。试剂垫、样本垫、吸收垫采用Millipore公司产品,与玻片相比,膜的优点是与蛋白亲和力强,检测技术成熟,通常无需另外修饰。硝酸纤维素膜、尼龙膜、PVDF膜等都是带有微孔的滤膜,其孔径一般在0.45μm左右,在显微镜下这种膜就是一个立体的纤维网络,可以结合更多的蛋白质探针,使检测更加灵敏。同时,这种多孔结构可使液体在其中进行自由扩散,当在膜的一端给以液体扩散压力时,液体将沿一定方向扩散,是层析的良好材料,是制作层析过敏原蛋白的非常理想的载体。
(2)点样
具体采用0.05mol/L碳酸缓冲液,pH9.6或根据尘螨过敏原蛋白的特性选择的缓冲液适当稀释过敏原蛋白溶液成0.05μg/ml-10μg/ml的浓度。稀释后将尘螨过敏原蛋白(100μl)加到喷样储液瓶内,应用微量连续型点膜机(如BIO-DOT公司的产品),将变应原溶液喷线于膜的相应的位点非接触式连续点样,即喷点,每次点样1μl连续3次;喷点后的硝酸纤维素膜放置2—8℃下反应过夜。用3%BSA封闭液,37℃下保温2小时。层析膜条一般25—30mm长,可以喷线2—10条线或喷点2—30点。
(3)固化人IgE阳性的质控区
a.材料
人IgE抗体:来源于人血浆中经亲和色谱纯化,纯度>95%的人IgE抗体(购自美国Biodesign公司)。
b.步骤
用样品稀释液将人IgE抗体配制成浓度为50IU/ml,在过敏原蛋白硝酸纤维素膜条上端固化人IgE抗体即为阳性质控区。
4.将尘螨过敏原蛋白固化硝酸纤维膜条放入加样槽中
采用切割机将固化好的尘螨过敏原蛋白硝酸纤维素膜条切成所需的规格和形状,放入加样槽中,再加入干燥剂装入金属箔袋内密封,在2—8℃下贮存。
5.配制缓冲液:0.05mol/L pH8.0的Tris—HCl中含2%胎牛血清,0.15mol/L NaCl,0.5% Tween-20和20mg/L庆大霉素;
6.分级比色卡制作
根据国际上特异性IgE抗体浓度和分级标准的关系,印制分级比色卡。
本发明的尘螨过敏原快速检测试剂盒的使用方法
1.检测步骤
(1)将所有试剂平衡至室温(20—25℃)。
(2)测定时用加样吸管向加样槽标本孔内加入2~3滴血清(若使用定量加样器,每孔加100~150μl血清),血清标本迁移至质控区指示线时加入缓冲液1滴。
(3)20—30分钟观察结果。
2.结果判断
a.目测:
(1)阳性结果:在检测板上质控区和相应的过敏原平行处的检测线出现红色反应带。
(2)阴性:仅质控区出现一条红色条带
(3)无效:质控区未出现红色条带
b.使用分级比色卡可半定量分级判断阳性结果:
c.使用定量金标检测仪检测可定量分级判断阳性结果。
呈阳性的指标应与分级比色卡级别基本一致,其分级结果只允许在相邻两个级别间变化。
国际上过敏原特异性IgE浓度的分级方法:
实施例2 用尘螨过敏原快速检测试剂试验
对200例过敏患者(2—18岁的120人,18—70岁的80人),抽取血液制备血清筛查尘螨过敏原。
按上述尘螨过敏原快速检测试剂盒的使用方法测出患者血清的不同过敏原特异性IgE浓度,采用分级比色卡或定量金标检测仪判断检测结果。检测结果如下表:
过敏性哮喘患者中尘螨致敏筛查结果
检测结果表明,采用本发明的试剂盒能够简便、快速、准确地检测出致敏过敏原,灵敏度达93.0%,特异性达85.0%,准确性87.0%。
Claims (2)
1、尘螨过敏原快速检测试剂盒,其特征在于该试剂盒组成包括:置于加样槽中的已固化了粉尘螨与户尘螨过敏原蛋白和人IgE抗体的硝酸纤维膜条,胶体金标记的抗体,缓冲液,分级比色卡;
其中:
胶体金标记的抗体:胶体金标记的抗人IgE抗体;
缓冲液:0.05mol/L pH8.0的Tris—HCl中含2%胎牛血清,0.15mol/LNaCl,0.5%Tween-20和20mg/L庆大霉素;
分级比色卡:根据国际上通用的特异性IgE抗体浓度和分级标准关系制作的分级比色卡。
2.根据权利要求1所述的尘螨过敏原快速检测试剂盒的制备方法,其特征在于包括如下步骤:
1)粉尘螨与户尘螨过敏原蛋白的制备:将含粉尘螨与户尘螨过敏原蛋白的饲养尘螨经粉碎、脱脂、提取、SDS-PAGE电泳确证、洗脱、干燥;
2)胶体金标记抗体的制备:用胶体金标记抗人IgE抗体;
3)用粉尘螨与户尘螨过敏原蛋白和人IgE抗体固化硝酸纤维膜条,构成测试区和质控区,并封闭;
4)将步骤3)固化处理过的硝酸纤维膜条放入加样槽中;
5)配制缓冲液:0.05mol/L pH8.0的Tris—HCl中含2%胎牛血清,0.15mol/L NaCl,0.5%Tween-20和20mg/L庆大霉素;
6)根据国际上通用的特异性IgE抗体浓度和分级标准的关系,制作分级比色卡。
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