CN102109523A - 丙型肝炎病毒IgG、IgM抗体联检试剂盒及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种丙型肝炎IgG、IgM抗体联检试剂盒及其制备方法。该试剂盒以胶体金为标记物,在底板(5)上顺次相互搭接地粘附有样品垫(1)、以胶体金标记的丙型肝炎(HCV)混合抗原玻璃纤维或无纺布构成的胶体金垫(2)、分别包被了抗人IgM抗体、HCV混合抗原作为检测线,包被了抗HCV抗体作为质控线的硝酸纤维素膜(3)、吸样垫(4)。本发明采用胶体金免疫层析技术测定丙型肝炎IgG、IgM抗体,通过一次操作即可联合检测出丙型肝炎IgG、IgM抗体,简化了操作过程,具有操作简单、反应迅速、灵敏度高、经济实用等特点。
Description
技术领域
本发明属于生物应用技术领域,特别涉及一种丙型肝炎病毒IgG、IgM抗体联检试剂盒及其制备方法。
背景技术
丙型肝炎病毒简称为HCV,在病毒分类上属于正链RNA病毒,呈球形,直径小于80nm(在肝细胞中为36~40nm,在血液中为36-62nm)。丙型肝炎是由HCV所引起,是严重威胁人类健康的传染病之一,由于至今尚无预防疫苗问世,也没有特效药物治疗,因此早期诊断是防止HCV传播的有效手段。丙型肝炎是通过输血或血制品、血透析、单采血浆还输血球、肾移植、静脉注射毒品、性传播、母婴传播等传染引起的。在预防丙肝的措施上,筛选献血员是重要一环,凡血中抗-HCV阳性或HCVRNA阳性均不能作为献血员,国外30-90%输血后肝炎为丙型肝炎,我国输血后肝炎中丙型肝炎占1/3。建立HCV快速、准确的检测方法是预防的关键所在。
IgM和IgG是人或动物体内最重要的两种抗体。当一种抗原(病毒或细菌)进入机体后,免疫应答中首先分泌的抗体是IgM抗体,它们在与抗原结合后启动补体的级联反应,同时还把入侵者相互连接起来,聚成一堆便于巨噬细胞的吞噬,因此IgM在机体的早期防御中起着重要的作用;而IgG抗体是血清免疫球蛋白的主要成分,它占总的免疫球蛋白的75%,是初级免疫应答中最持久、最重要的抗体,它仅以单体形式存在,大多是抗菌性、抗毒性和抗病毒抗体属于IgG,在抗感染中起到主力军作用,能够促进单核巨噬细胞的吞噬作用(调理作用),中和细菌毒素的毒性(中和毒素)和病毒抗原结合使病毒失去感染宿主细胞的能力(中和病毒)。仅对IgG检测,不能说明患者是现症感染或既往感染,虽然IgM的检出率要比IgG的检出率低,但是IgM检测阳性基本说明患者是现症感染。由于IgM抗体半衰期较短,所以IgM的检测阴性并不能证明机体未受到感染,还需要检测半衰期较长,含量最高的IgG抗体,以明确诊断。因此,要明确诊断机体对特定抗原的免疫反应状态,可以同时检测机体内IgG、IgM抗体的存在。因此本发明提供一种丙型肝炎病毒IgG、IgM抗体联检试剂盒以明确诊断HCV感染。
目前单独检测丙型肝炎病毒IgG、IgM抗体的方法很多,例如酶联免疫吸附法(ELISA)、免疫胶体金渗滤法、乳胶凝集法、免疫荧光法(IFA)等。但还未有通过一次操作即可联检丙型肝炎病毒IgG、IgM抗体的方法。虽然分别单独检测丙型肝炎病毒IgG抗体和IgM抗体后,再综合分析检测结果对疾病的诊断并无影响,但操作过程繁琐,检测不够方便快捷。
本发明提供一种丙型肝炎病毒IgG、IgM抗体联检试剂盒及其制备方法,能够一次性检测丙型肝炎病毒IgG、IgM抗体,从而简化了操作过程,实现了快速检测的目的。本发明采用胶体金免疫层析法(Immunochromatography Assay),这种方法开始于上个世纪90年代中期,是在免疫渗滤法的基础上发展起来的,是免疫亲和技术、印刷技术、免疫标记技术和层析技术的结合。这种方法目前已得到较为广泛的运用,它的基本原理是:利用胶体金标记一种抗原或抗体,相应的配对抗原或抗体包被在硝酸纤维素膜上,检测样品时,胶体金标记物和样品中的配体相结合形成复合物,然后再通过层析作用向上移动,与包被抗原或抗体结合而凝聚显色,从而实现对样品检测结果的判定。此方法操作简单、反应快速、敏感性高、特异性强、稳定性好,经济实用,适合于现场检测。
发明内容
本发明的目的是提供一种方便、快捷、灵敏,用于检测丙型肝炎病毒IgG、IgM抗体的试剂盒,检测人类样本中丙型肝炎病毒IgG,IgM抗体,用于丙型肝炎病毒感染的辅助诊断和鉴别。
本发明提供了一种丙型肝炎病毒IgG,IgM抗体联检试剂盒。包括样品垫(1)、紧密连接于样品垫一端的含有标记HCV多表位复合抗原的胶体金垫(2)、与胶体金垫的另一端紧密相连的硝酸纤维素膜(3)和紧密连接于硝酸纤维素膜另一端的吸样垫(4)。硝酸纤维素膜包被了三条线,其中两条检测线(T1,T2线),一条质控线(C线)。样品垫、胶体金垫、硝酸纤维素膜和吸样垫粘贴在PVC支撑板(5)上形成试剂条,试剂条也可以装入塑料卡中形成检测卡。其特征在于检测线为分别包被在硝酸纤维素膜上的鼠抗人IgM抗体(T1线)、HCV多表位复合抗原(T2线);所述胶体金垫为胶体金标记的HCV多表位复合抗原玻璃纤维(或无纺布);所述的底板为PVC板,样品垫为玻璃纤维或无纺布,吸样垫为吸水滤纸。
本发明还提供了一种丙型肝炎病毒IgG,IgM抗体联检试剂盒的制备方法,包括以下步骤:
(1)制备HCV多表位复合抗原
选取5个丙型肝炎病毒高度保守的T细胞和B细胞表位,利用大肠杆菌表达、并经过高度纯化的丙型肝炎病毒多表位复合抗原。
(2)制备抗人IgM抗体
用纯化的高浓度人IgM免疫BALB/C小鼠,取免疫小鼠的脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合,抗体阳性孔细胞经3次克隆,扩增后注入BALB/C小鼠腹腔制备腹水,经正辛酸方法提纯单克隆抗体。保存在0-4℃冰箱中备用。
(3)制备胶体金颗粒
取0.01%的氯金酸水溶液100ml,加热煮沸。根据需要迅速加入1%枸橼酸三钠水溶液0.75-2.5ml,继续煮沸约5min,出现橙红色。这样制成的胶体金颗粒的大小为20-40nm。
(4)胶体金垫的制备
取颗粒大小为20-40nm的胶体金溶液,用0.1mol/L K2CO3将胶体金溶液的pH值调至8.0左右,按100ml胶体金溶液加入1.5mgHCV多表位复合抗原的比例混合均匀,室温搅拌30分钟;加入10%牛血清蛋白(BSA)溶液,室温搅拌5分钟;加入10%聚乙二醇(PEG)2000溶液,室温搅拌5分钟;11000r/min离心60分钟,仔细吸取上清液,弃去;用胶体金复溶液复溶至100ml,按1ml溶液铺28cm2的比例均匀铺在玻璃纤维膜或无纺布上,再置干燥间,在温度20℃,湿度小于30%的条件下干燥2小时,制成胶体金垫。
(5)样品垫的处理
将玻璃纤维或无纺布浸泡于50ml 0.01M pH 7.4的磷酸缓冲溶液(含有5ml 10%BSA,2.5ml 10%Tween-20)中30min,于38℃烘干,真空封装,储存于4℃,备用。
(6)包被鼠抗人IgM抗体、HCV多表位复合抗原,抗HCV抗体
设定划膜仪涂覆参数1μL/cm,分别用微量进样器取1ml抗人IgM抗体、HCV多表位复合抗原、抗HCV抗体,按顺序接到划膜仪的A、B、C管道接口。将贴有硝酸纤维素膜的PVC板置于划膜仪的往复运动平台上,开启划膜仪,在硝酸纤维素膜上涂覆抗人IgM抗体(T1线)、HCV多表位复合抗原(T2线)、抗HCV抗体(C线)。划线后将硝酸纤维素膜烘箱中,温度38℃,干燥24小时,备用。
(7)试剂盒的组装
将样品垫、胶体金垫、硝酸纤维素膜、吸样垫按图1所示,依次搭接粘贴在底板上,切成2.5mm宽的小条,制成试剂条,试剂条也可以装在塑料卡中形成检测卡。
本发明所述试剂盒的检测方法为:将被检血清或血浆或全血平衡至室温;取出丙型肝炎病毒IgG,IgM抗体联检装置,水平放置;在样品垫中加入2-3滴样品,15分钟内观察并记录C、T1、T2线的显色情况,判断检测结果。
本发明的检测试剂盒采用胶体金免疫层析技术测定丙型肝炎病毒IgG、IgM抗体,检测时,将被测样品加在试纸条(卡)上的样品垫上,可以直接观察到免疫反应的结果,完成样品检测。本发明可用于定性检测样本中可能存在的丙型肝炎病毒IgG、IgM抗体,达到快速筛检病人的目的。可通过一次操作即可联合检测出丙型肝炎病毒IgG、IgM抗体,简化了操作过程,且检测结果具有较高的总体符合率,具有操作简单、反应迅速、灵敏度高、经济适用等特点。
附图说明
图1丙型肝炎病毒IgG、IgM抗体联检试剂盒结构示意图;
附图符号说明:
1:样品垫;
2:含有标记HCV多表位复合抗原的胶体金垫;
3:硝酸纤维素膜(T1,T2:分别包被了鼠抗人IgM抗体、HCV多表位复合抗原的两条检测线;C:包被抗HCV抗体的质控线);
4:吸样垫;
5:底板;
图2本发明试剂盒的检测结果示意图。
自左至右依次是:T1、C两条线阳性,T2、C两条线阳性,T1、T2、C三条线阳性;C一条线阴性;无效。
具体实施方式
实施例1:制备丙型肝炎病毒IgG、IgM抗体联检试剂盒
1.制备HCV多表位复合抗原
选取5个丙型肝炎病毒高度保守的T细胞和B细胞表位,分别来自核心蛋白(1-16aa,132-141aa),E1(126-135aa),NS3(139-147aa)及NS5(768-775aa),利用大肠杆菌表达、并经过高度纯化制得丙型肝炎病毒多表位复合抗原。
2.制备抗人IgM抗体
用纯化的高浓度人IgM免疫BALB/C小鼠,取免疫小鼠的脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合,抗体阳性孔细胞经3次克隆,扩增后注入BALB/C小鼠腹腔制备腹水,经正辛酸方法提纯单克隆抗体。保存在0-4℃并向中备用。
3.制备胶体金颗粒
取0.01%的氯金酸水溶液100ml,加热煮沸。根据需要迅速加入1%枸橼酸三钠水溶液1ml,继续煮沸约5min,出现橙红色。这样制成的胶体金颗粒的大小为20-40nm。
4.胶体金垫的制备
取颗粒大小为20-40nm的胶体金溶液,用0.1mol/L K2CO3将胶体金溶液的pH值调至8.0左右,按100ml胶体金溶液加入2.0mgHCV多表位复合抗原的比例混合均匀,室温搅拌30分钟;加入10%牛血清蛋白(BSA)溶液,室温搅拌5分钟;加入10%聚乙二醇(PEG)2000溶液,室温搅拌5分钟;11000r/min离心60分钟,仔细吸取上清液,弃去;用胶体金复溶液复溶至100ml,按1ml溶液铺28cm2的比例均匀铺在玻璃纤维膜或无纺布上,再置干燥间,在温度20℃,湿度小于30%的条件下干燥2小时,制成胶体金垫。
5.样品垫的处理
将玻璃纤维或无纺布浸泡于50ml 0.01M pH 7.4的磷酸缓冲溶液(含有5ml 10%BSA,2.5ml 10%Tween-20)中30min,于38℃烘干,真空封装,储存于4℃,备用。
6.包被鼠抗人IgM抗体、HCV多表位复合抗原,抗HCV抗体
设定划膜仪涂覆参数1μL/cm,分别用微量进样器取1ml抗人IgM抗体、HCV多表位复合抗原、抗HCV抗体,按顺序接到划膜仪的A、B、C管道接口。将贴有硝酸纤维素膜的PVC板置于划膜仪的往复运动平台上,开启划膜仪,在硝酸纤维素膜上分别涂覆浓度为2.0mg/ml的抗人IgM抗体(T1线)、浓度为1.5mg/ml的HCV多表位复合抗原(T2线)、浓度为2.0mg/ml的抗HCV抗体(C线)。划线后将硝酸纤维素膜烘箱中,温度38℃,干燥24小时,备用。
7.试剂盒的组装
将样品垫、胶体金垫、硝酸纤维素膜、吸样垫按图1所示,依次搭接粘贴在底板上,切成2.5mm宽的小条,制成试剂条,试剂条也可以装在塑料卡中形成检测卡。
将被检血清或血浆或全血平衡至室温;取出丙型肝炎病毒IgG,IgM抗体联检装置,水平放置;在样品垫中加入2滴样品,15分钟内观察并记录C、T1、T2线的显色情况,判断检测结果。
检测样品(血清、血浆或全血)时,若是阳性,样品与胶体金标记丙型肝炎病毒结合,由于层析作用复合物沿纸条向前移动,当样品-胶体金标记丙型肝炎病毒复合物移动到鼠抗人IgM单克隆抗体包被线(T1)时,若样品中含有丙型肝炎病毒IgM抗体,则IgM抗体与包被线上的鼠抗人IgM单克隆抗体结合,形成胶体金-HCV多表位复合抗原-IgM抗体-鼠抗人IgM单克隆抗体夹心物而凝聚显色,此时T1包被线可观察到红色条带;当样品-胶体金标记丙型肝炎病毒复合物移动到HCV多表位复合抗原包被线(T2)时,若样品中含有丙型肝炎病毒IgG抗体,则形成胶体金-HCV多表位复合抗原-IgG抗体-HCV多表位复合抗原夹心物而凝聚显色,此时T2包被线可观察到红色条带,表明样品中含有丙型肝炎病毒IgG抗体;当胶体金标记丙型肝炎病毒复合物移动到抗HCV抗体包被线(C)时,与抗HCV抗体结合而显色,此时C包被线可观察到红色条带。在T1包被线观察到红色条带,判定为样品中含有丙型肝炎病毒IgM抗体;在T2包被线可观察到红色条带,判定为样品中含有丙型肝炎病毒IgG抗体;若T1、T2包被线处同时可观察到红色条带,只能判定为被检测样品中含有丙型肝炎病毒IgM抗体;若T1、T2包被线处同时不能观察到红色条带,则判定为被检测样品中不含有丙型肝炎病毒IgG,IgM抗体;无论丙型肝炎病毒IgG,IgM抗体是否存在于样本中,一条红色条带都会出现在质控线(C)。质控区线(C)所显现的红色条带是判定是否有足够样本,层析过程是否正常的标准,同时也作为试剂的内控标准。
Claims (8)
1.一种利用胶体金免疫层析技术制备的丙型肝炎病毒IgG、IgM抗体联检试剂盒,包括样品垫(1)、胶体金垫(2)、硝酸纤维素膜(3)、吸样垫(4)及底板(6),其中,胶体金垫为胶体金标记的HCV多表位复合抗原玻璃纤维(或无纺布),硝酸纤维素膜上分别包被了抗人IgM抗体、HCV多表位复合抗原作为检测线,抗HCV抗体作为质控线。
2.一种如权利要求1所述的丙型肝炎病毒IgG、IgM抗体联检试剂盒,其特征在于,所述的底板为PVC板,样品垫为玻璃纤维或无纺布,吸样垫为吸水滤纸。
3.一种如权利要求1所述的丙型肝炎病毒IgG、IgM抗体联检试剂盒,其特征在于,所述的胶体金是由氯金酸(HAuCl4)在还原剂枸橼酸三钠作用下,聚合成为大小为20-40nm的胶体金颗粒。
4.一种如权利要求1所述的丙型肝炎病毒IgG、IgM抗体联检试剂盒,其特征在于,所述的胶体金标记HCV多表位复合抗原的pH值为8.0,胶体金与抗原的配比为15μg/ml胶体金。
5.一种如权利要求1所述的丙型肝炎病毒IgG、IgM抗体联检试剂盒,其特征在于所述的硝酸纤维素膜上包被的抗人IgM抗体的浓度为1.0mg/ml,HCV多表位复合抗原的浓度为1.5mg/ml,抗HCV抗体的浓度为1.0mg/ml。
6.一种如权利要求1和6所述的丙型肝炎病毒IgG、IgM抗体联检试剂盒,其特征在于,所述的硝酸纤维素膜上三条包被线的划线方法为:将配制好的抗人IgM抗体溶液与HCV多表位复合抗原溶液,用划膜仪在硝酸纤维素膜的上部和中部以1μL/cm的参数进行划线,包被T1和T2线,同时在硝酸纤维素膜的下部包被抗HCV抗体作为C线,划线后将硝酸纤维素膜烘箱中,温度38℃,干燥24小时。
7.一种如权利要求1所述的丙型肝炎病毒IgG、IgM抗体联检试剂盒,其特征在于,所述的试剂盒的组装方法为:将样品垫、胶体金垫、硝酸纤维素膜、吸样垫依次粘贴在底板上,且成小条,制成试剂条,也可以将试剂条装在塑料卡中形成检测卡。
8.一种如权利要求1所述的丙型肝炎病毒IgG、IgM抗体联检试剂盒,其特征在于,检测方法为:将被检血清或血浆或全血平衡至室温,将试纸条或检测卡平放,在上样垫中加入2-3滴样品,15分钟内观察并记录C、T1、T2线的显色情况,判断检测结果。
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---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20110629 |