CN102109523A - 丙型肝炎病毒IgG、IgM抗体联检试剂盒及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种丙型肝炎IgG、IgM抗体联检试剂盒及其制备方法。该试剂盒以胶体金为标记物，在底板(5)上顺次相互搭接地粘附有样品垫(1)、以胶体金标记的丙型肝炎(HCV)混合抗原玻璃纤维或无纺布构成的胶体金垫(2)、分别包被了抗人IgM抗体、HCV混合抗原作为检测线，包被了抗HCV抗体作为质控线的硝酸纤维素膜(3)、吸样垫(4)。本发明采用胶体金免疫层析技术测定丙型肝炎IgG、IgM抗体，通过一次操作即可联合检测出丙型肝炎IgG、IgM抗体，简化了操作过程，具有操作简单、反应迅速、灵敏度高、经济实用等特点。

Description

丙型肝炎病毒IgG、IgM抗体联检试剂盒及其制备方法

技术领域

本发明属于生物应用技术领域，特别涉及一种丙型肝炎病毒IgG、IgM抗体联检试剂盒及其制备方法。

背景技术

丙型肝炎病毒简称为HCV，在病毒分类上属于正链RNA病毒，呈球形，直径小于80nm(在肝细胞中为36～40nm，在血液中为36-62nm)。丙型肝炎是由HCV所引起，是严重威胁人类健康的传染病之一，由于至今尚无预防疫苗问世，也没有特效药物治疗，因此早期诊断是防止HCV传播的有效手段。丙型肝炎是通过输血或血制品、血透析、单采血浆还输血球、肾移植、静脉注射毒品、性传播、母婴传播等传染引起的。在预防丙肝的措施上，筛选献血员是重要一环，凡血中抗-HCV阳性或HCVRNA阳性均不能作为献血员，国外30-90％输血后肝炎为丙型肝炎，我国输血后肝炎中丙型肝炎占1/3。建立HCV快速、准确的检测方法是预防的关键所在。

IgM和IgG是人或动物体内最重要的两种抗体。当一种抗原(病毒或细菌)进入机体后，免疫应答中首先分泌的抗体是IgM抗体，它们在与抗原结合后启动补体的级联反应，同时还把入侵者相互连接起来，聚成一堆便于巨噬细胞的吞噬，因此IgM在机体的早期防御中起着重要的作用；而IgG抗体是血清免疫球蛋白的主要成分，它占总的免疫球蛋白的75％，是初级免疫应答中最持久、最重要的抗体，它仅以单体形式存在，大多是抗菌性、抗毒性和抗病毒抗体属于IgG，在抗感染中起到主力军作用，能够促进单核巨噬细胞的吞噬作用(调理作用)，中和细菌毒素的毒性(中和毒素)和病毒抗原结合使病毒失去感染宿主细胞的能力(中和病毒)。仅对IgG检测，不能说明患者是现症感染或既往感染，虽然IgM的检出率要比IgG的检出率低，但是IgM检测阳性基本说明患者是现症感染。由于IgM抗体半衰期较短，所以IgM的检测阴性并不能证明机体未受到感染，还需要检测半衰期较长，含量最高的IgG抗体，以明确诊断。因此，要明确诊断机体对特定抗原的免疫反应状态，可以同时检测机体内IgG、IgM抗体的存在。因此本发明提供一种丙型肝炎病毒IgG、IgM抗体联检试剂盒以明确诊断HCV感染。

目前单独检测丙型肝炎病毒IgG、IgM抗体的方法很多，例如酶联免疫吸附法(ELISA)、免疫胶体金渗滤法、乳胶凝集法、免疫荧光法(IFA)等。但还未有通过一次操作即可联检丙型肝炎病毒IgG、IgM抗体的方法。虽然分别单独检测丙型肝炎病毒IgG抗体和IgM抗体后，再综合分析检测结果对疾病的诊断并无影响，但操作过程繁琐，检测不够方便快捷。

本发明提供一种丙型肝炎病毒IgG、IgM抗体联检试剂盒及其制备方法，能够一次性检测丙型肝炎病毒IgG、IgM抗体，从而简化了操作过程，实现了快速检测的目的。本发明采用胶体金免疫层析法(Immunochromatography Assay)，这种方法开始于上个世纪90年代中期，是在免疫渗滤法的基础上发展起来的，是免疫亲和技术、印刷技术、免疫标记技术和层析技术的结合。这种方法目前已得到较为广泛的运用，它的基本原理是：利用胶体金标记一种抗原或抗体，相应的配对抗原或抗体包被在硝酸纤维素膜上，检测样品时，胶体金标记物和样品中的配体相结合形成复合物，然后再通过层析作用向上移动，与包被抗原或抗体结合而凝聚显色，从而实现对样品检测结果的判定。此方法操作简单、反应快速、敏感性高、特异性强、稳定性好，经济实用，适合于现场检测。

发明内容

本发明的目的是提供一种方便、快捷、灵敏，用于检测丙型肝炎病毒IgG、IgM抗体的试剂盒，检测人类样本中丙型肝炎病毒IgG，IgM抗体，用于丙型肝炎病毒感染的辅助诊断和鉴别。

本发明提供了一种丙型肝炎病毒IgG，IgM抗体联检试剂盒。包括样品垫(1)、紧密连接于样品垫一端的含有标记HCV多表位复合抗原的胶体金垫(2)、与胶体金垫的另一端紧密相连的硝酸纤维素膜(3)和紧密连接于硝酸纤维素膜另一端的吸样垫(4)。硝酸纤维素膜包被了三条线，其中两条检测线(T₁，T₂线)，一条质控线(C线)。样品垫、胶体金垫、硝酸纤维素膜和吸样垫粘贴在PVC支撑板(5)上形成试剂条，试剂条也可以装入塑料卡中形成检测卡。其特征在于检测线为分别包被在硝酸纤维素膜上的鼠抗人IgM抗体(T₁线)、HCV多表位复合抗原(T₂线)；所述胶体金垫为胶体金标记的HCV多表位复合抗原玻璃纤维(或无纺布)；所述的底板为PVC板，样品垫为玻璃纤维或无纺布，吸样垫为吸水滤纸。

本发明还提供了一种丙型肝炎病毒IgG，IgM抗体联检试剂盒的制备方法，包括以下步骤：

(1)制备HCV多表位复合抗原

选取5个丙型肝炎病毒高度保守的T细胞和B细胞表位，利用大肠杆菌表达、并经过高度纯化的丙型肝炎病毒多表位复合抗原。

(2)制备抗人IgM抗体

用纯化的高浓度人IgM免疫BALB/C小鼠，取免疫小鼠的脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合，抗体阳性孔细胞经3次克隆，扩增后注入BALB/C小鼠腹腔制备腹水，经正辛酸方法提纯单克隆抗体。保存在0-4℃冰箱中备用。

(3)制备胶体金颗粒

取0.01％的氯金酸水溶液100ml，加热煮沸。根据需要迅速加入1％枸橼酸三钠水溶液0.75-2.5ml，继续煮沸约5min，出现橙红色。这样制成的胶体金颗粒的大小为20-40nm。

(4)胶体金垫的制备

取颗粒大小为20-40nm的胶体金溶液，用0.1mol/L K₂CO₃将胶体金溶液的pH值调至8.0左右，按100ml胶体金溶液加入1.5mgHCV多表位复合抗原的比例混合均匀，室温搅拌30分钟；加入10％牛血清蛋白(BSA)溶液，室温搅拌5分钟；加入10％聚乙二醇(PEG)2000溶液，室温搅拌5分钟；11000r/min离心60分钟，仔细吸取上清液，弃去；用胶体金复溶液复溶至100ml，按1ml溶液铺28cm²的比例均匀铺在玻璃纤维膜或无纺布上，再置干燥间，在温度20℃，湿度小于30％的条件下干燥2小时，制成胶体金垫。

(5)样品垫的处理

将玻璃纤维或无纺布浸泡于50ml 0.01M pH 7.4的磷酸缓冲溶液(含有5ml 10％BSA，2.5ml 10％Tween-20)中30min，于38℃烘干，真空封装，储存于4℃，备用。

(6)包被鼠抗人IgM抗体、HCV多表位复合抗原，抗HCV抗体

设定划膜仪涂覆参数1μL/cm，分别用微量进样器取1ml抗人IgM抗体、HCV多表位复合抗原、抗HCV抗体，按顺序接到划膜仪的A、B、C管道接口。将贴有硝酸纤维素膜的PVC板置于划膜仪的往复运动平台上，开启划膜仪，在硝酸纤维素膜上涂覆抗人IgM抗体(T₁线)、HCV多表位复合抗原(T₂线)、抗HCV抗体(C线)。划线后将硝酸纤维素膜烘箱中，温度38℃，干燥24小时，备用。

(7)试剂盒的组装

将样品垫、胶体金垫、硝酸纤维素膜、吸样垫按图1所示，依次搭接粘贴在底板上，切成2.5mm宽的小条，制成试剂条，试剂条也可以装在塑料卡中形成检测卡。

本发明所述试剂盒的检测方法为：将被检血清或血浆或全血平衡至室温；取出丙型肝炎病毒IgG，IgM抗体联检装置，水平放置；在样品垫中加入2-3滴样品，15分钟内观察并记录C、T₁、T₂线的显色情况，判断检测结果。

本发明的检测试剂盒采用胶体金免疫层析技术测定丙型肝炎病毒IgG、IgM抗体，检测时，将被测样品加在试纸条(卡)上的样品垫上，可以直接观察到免疫反应的结果，完成样品检测。本发明可用于定性检测样本中可能存在的丙型肝炎病毒IgG、IgM抗体，达到快速筛检病人的目的。可通过一次操作即可联合检测出丙型肝炎病毒IgG、IgM抗体，简化了操作过程，且检测结果具有较高的总体符合率，具有操作简单、反应迅速、灵敏度高、经济适用等特点。

附图说明

图1丙型肝炎病毒IgG、IgM抗体联检试剂盒结构示意图；

附图符号说明：

1：样品垫；

2：含有标记HCV多表位复合抗原的胶体金垫；

3：硝酸纤维素膜(T₁，T₂：分别包被了鼠抗人IgM抗体、HCV多表位复合抗原的两条检测线；C：包被抗HCV抗体的质控线)；

4：吸样垫；

5：底板；

图2本发明试剂盒的检测结果示意图。

自左至右依次是：T₁、C两条线阳性，T₂、C两条线阳性，T₁、T₂、C三条线阳性；C一条线阴性；无效。

具体实施方式

实施例1：制备丙型肝炎病毒IgG、IgM抗体联检试剂盒

1.制备HCV多表位复合抗原

选取5个丙型肝炎病毒高度保守的T细胞和B细胞表位，分别来自核心蛋白(1-16aa，132-141aa)，E1(126-135aa)，NS3(139-147aa)及NS5(768-775aa)，利用大肠杆菌表达、并经过高度纯化制得丙型肝炎病毒多表位复合抗原。

2.制备抗人IgM抗体

用纯化的高浓度人IgM免疫BALB/C小鼠，取免疫小鼠的脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合，抗体阳性孔细胞经3次克隆，扩增后注入BALB/C小鼠腹腔制备腹水，经正辛酸方法提纯单克隆抗体。保存在0-4℃并向中备用。

3.制备胶体金颗粒

取0.01％的氯金酸水溶液100ml，加热煮沸。根据需要迅速加入1％枸橼酸三钠水溶液1ml，继续煮沸约5min，出现橙红色。这样制成的胶体金颗粒的大小为20-40nm。

4.胶体金垫的制备

取颗粒大小为20-40nm的胶体金溶液，用0.1mol/L K₂CO₃将胶体金溶液的pH值调至8.0左右，按100ml胶体金溶液加入2.0mgHCV多表位复合抗原的比例混合均匀，室温搅拌30分钟；加入10％牛血清蛋白(BSA)溶液，室温搅拌5分钟；加入10％聚乙二醇(PEG)2000溶液，室温搅拌5分钟；11000r/min离心60分钟，仔细吸取上清液，弃去；用胶体金复溶液复溶至100ml，按1ml溶液铺28cm²的比例均匀铺在玻璃纤维膜或无纺布上，再置干燥间，在温度20℃，湿度小于30％的条件下干燥2小时，制成胶体金垫。

5.样品垫的处理

将玻璃纤维或无纺布浸泡于50ml 0.01M pH 7.4的磷酸缓冲溶液(含有5ml 10％BSA，2.5ml 10％Tween-20)中30min，于38℃烘干，真空封装，储存于4℃，备用。

6.包被鼠抗人IgM抗体、HCV多表位复合抗原，抗HCV抗体

设定划膜仪涂覆参数1μL/cm，分别用微量进样器取1ml抗人IgM抗体、HCV多表位复合抗原、抗HCV抗体，按顺序接到划膜仪的A、B、C管道接口。将贴有硝酸纤维素膜的PVC板置于划膜仪的往复运动平台上，开启划膜仪，在硝酸纤维素膜上分别涂覆浓度为2.0mg/ml的抗人IgM抗体(T₁线)、浓度为1.5mg/ml的HCV多表位复合抗原(T₂线)、浓度为2.0mg/ml的抗HCV抗体(C线)。划线后将硝酸纤维素膜烘箱中，温度38℃，干燥24小时，备用。

7.试剂盒的组装

将样品垫、胶体金垫、硝酸纤维素膜、吸样垫按图1所示，依次搭接粘贴在底板上，切成2.5mm宽的小条，制成试剂条，试剂条也可以装在塑料卡中形成检测卡。

将被检血清或血浆或全血平衡至室温；取出丙型肝炎病毒IgG，IgM抗体联检装置，水平放置；在样品垫中加入2滴样品，15分钟内观察并记录C、T₁、T₂线的显色情况，判断检测结果。

检测样品(血清、血浆或全血)时，若是阳性，样品与胶体金标记丙型肝炎病毒结合，由于层析作用复合物沿纸条向前移动，当样品-胶体金标记丙型肝炎病毒复合物移动到鼠抗人IgM单克隆抗体包被线(T₁)时，若样品中含有丙型肝炎病毒IgM抗体，则IgM抗体与包被线上的鼠抗人IgM单克隆抗体结合，形成胶体金-HCV多表位复合抗原-IgM抗体-鼠抗人IgM单克隆抗体夹心物而凝聚显色，此时T₁包被线可观察到红色条带；当样品-胶体金标记丙型肝炎病毒复合物移动到HCV多表位复合抗原包被线(T₂)时，若样品中含有丙型肝炎病毒IgG抗体，则形成胶体金-HCV多表位复合抗原-IgG抗体-HCV多表位复合抗原夹心物而凝聚显色，此时T₂包被线可观察到红色条带，表明样品中含有丙型肝炎病毒IgG抗体；当胶体金标记丙型肝炎病毒复合物移动到抗HCV抗体包被线(C)时，与抗HCV抗体结合而显色，此时C包被线可观察到红色条带。在T₁包被线观察到红色条带，判定为样品中含有丙型肝炎病毒IgM抗体；在T₂包被线可观察到红色条带，判定为样品中含有丙型肝炎病毒IgG抗体；若T₁、T₂包被线处同时可观察到红色条带，只能判定为被检测样品中含有丙型肝炎病毒IgM抗体；若T₁、T₂包被线处同时不能观察到红色条带，则判定为被检测样品中不含有丙型肝炎病毒IgG，IgM抗体；无论丙型肝炎病毒IgG，IgM抗体是否存在于样本中，一条红色条带都会出现在质控线(C)。质控区线(C)所显现的红色条带是判定是否有足够样本，层析过程是否正常的标准，同时也作为试剂的内控标准。

Claims (8)

1.一种利用胶体金免疫层析技术制备的丙型肝炎病毒IgG、IgM抗体联检试剂盒，包括样品垫(1)、胶体金垫(2)、硝酸纤维素膜(3)、吸样垫(4)及底板(6)，其中，胶体金垫为胶体金标记的HCV多表位复合抗原玻璃纤维(或无纺布)，硝酸纤维素膜上分别包被了抗人IgM抗体、HCV多表位复合抗原作为检测线，抗HCV抗体作为质控线。

2.一种如权利要求1所述的丙型肝炎病毒IgG、IgM抗体联检试剂盒，其特征在于，所述的底板为PVC板，样品垫为玻璃纤维或无纺布，吸样垫为吸水滤纸。

3.一种如权利要求1所述的丙型肝炎病毒IgG、IgM抗体联检试剂盒，其特征在于，所述的胶体金是由氯金酸(HAuCl₄)在还原剂枸橼酸三钠作用下，聚合成为大小为20-40nm的胶体金颗粒。

4.一种如权利要求1所述的丙型肝炎病毒IgG、IgM抗体联检试剂盒，其特征在于，所述的胶体金标记HCV多表位复合抗原的pH值为8.0，胶体金与抗原的配比为15μg/ml胶体金。

5.一种如权利要求1所述的丙型肝炎病毒IgG、IgM抗体联检试剂盒，其特征在于所述的硝酸纤维素膜上包被的抗人IgM抗体的浓度为1.0mg/ml，HCV多表位复合抗原的浓度为1.5mg/ml，抗HCV抗体的浓度为1.0mg/ml。

6.一种如权利要求1和6所述的丙型肝炎病毒IgG、IgM抗体联检试剂盒，其特征在于，所述的硝酸纤维素膜上三条包被线的划线方法为：将配制好的抗人IgM抗体溶液与HCV多表位复合抗原溶液，用划膜仪在硝酸纤维素膜的上部和中部以1μL/cm的参数进行划线，包被T1和T2线，同时在硝酸纤维素膜的下部包被抗HCV抗体作为C线，划线后将硝酸纤维素膜烘箱中，温度38℃，干燥24小时。

7.一种如权利要求1所述的丙型肝炎病毒IgG、IgM抗体联检试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒的组装方法为：将样品垫、胶体金垫、硝酸纤维素膜、吸样垫依次粘贴在底板上，且成小条，制成试剂条，也可以将试剂条装在塑料卡中形成检测卡。

8.一种如权利要求1所述的丙型肝炎病毒IgG、IgM抗体联检试剂盒，其特征在于，检测方法为：将被检血清或血浆或全血平衡至室温，将试纸条或检测卡平放，在上样垫中加入2-3滴样品，15分钟内观察并记录C、T₁、T₂线的显色情况，判断检测结果。

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