CN101358972A - 检测一种或多种猪病毒性腹泻疾病抗体的试纸条 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种检测一种或多种猪病毒性腹泻疾病抗体的试纸条；该试纸条含有支撑层和粘贴在其上面的反应试剂载体吸附层，反应试剂载体吸附层由样品端依次为测试端纤维层、吸附金标SPA蛋白或与待检抗体相应的金标抗原纤维层、纤维素膜层及手柄端的吸水材料层，在纤维素膜层上含有一个或两个或三个用纯化的猪传染性胃肠炎病毒TGEV、猪流行性腹泻病毒PDEV和猪轮状病毒RV溶液中的任一种或任两种或三种印制的检测印迹，纤维素膜层上还含有用羊或兔抗SPA蛋白的IgG溶液或者用羊或兔抗TGEV、PDEV、RV的IgG溶液中的任一种或任两种或三种印制的对照印迹；本发明提供了一种检测准确、快速、使用方便、成本低的检测一种或多种猪病毒性腹泻疾病抗体的试纸条。

Description

检测一种或多种猪病毒性腹泻疾病抗体的试纸条
(一)、技术领域：
本发明涉及一种检测猪病毒性传染病抗体的器具，特别是涉及一种检测一种或多种猪病毒性腹泻疾病抗体的试纸条。
(二)、背景技术：
猪腹泻性疾病是一类严重影响养猪业发展的疾病，其中的病毒性腹泻尤其难以防治。猪流行性腹泻病毒(PEDV，代号P)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV，代号T)和轮状病毒(RV，代号R)是引起猪病毒性腹泻的主要病毒，这三种病毒引起的猪腹泻性疾病，其临床症状相似，而且往往在同一个猪场混合感染的情况比较多。因此，为了及时预防和治疗猪病毒性腹泻，需要快速鉴别诊断猪病毒性腹泻的特异方法，即需要快速检测相关病毒或其特异抗体。目前，实验室检测这3种病毒抗体的方法有：(1)在细胞系上培养相应阳性病毒，以检测血清样品中的相应病毒抗体；(2)用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测血清样品中的相应病毒抗体。以培养病毒来检测抗体，需要实验室条件、高级专业人员和比较昂贵的仪器设备，操作繁琐，检测费时、费力；ELISA需要酶标仪、较多的操作步骤和经验；而且，这些方法一次只检测一种猪病的抗体。可见，上述方法尽管检测特异或敏感，但操作不够简便与快速，均不适合基层或现场快速检测或诊断。因此，研究一种简便而快速的、可以检测这3种猪病病毒抗体的实时在线检测技术，非常重要而迫切。
(三)、发明内容：
本发明要解决的技术问题是：针对现有技术不足，提出一种检测准确、快速、使用方便、成本低的一步检测一种或多种猪病毒性腹泻疾病抗体的试纸条。
本发明的技术方案：
一种检测一种或多种猪病毒性腹泻疾病抗体的试纸条，含有支撑层、反应试剂载体吸附层，支撑层为不吸水薄片条，反应试剂载体吸附层粘贴于支撑层上，反应试剂载体吸附层由样品端依次为测试端纤维层、吸附金标SPA蛋白或与待检抗体相应的金标抗原纤维层、纤维素膜层及手柄端的吸水材料层，在纤维素膜层上含有一个用纯化的猪传染性胃肠炎病毒TGEV、猪流行性腹泻病毒PDEV和猪轮状病毒RV溶液中的任一种印制的检测印迹，或含有纯化的TGEV、PDEV和RV溶液中分别任选两种印制的检测印迹，或含有纯化的TGEV、PDEV和RV三种溶液任选一种排列顺序印制的检测印迹，纤维素膜层上还含有用羊或兔抗SPA蛋白的IgG溶液印制的对照印迹，或者含有用羊或兔抗猪传染性胃肠炎病毒TGEV的IgG溶液、抗猪流行性腹泻病毒PDEV的IgG溶液和抗猪轮状病毒RV的IgG溶液中的任一种或任两种或三种印制的对照印迹。
与待检抗体相应的金标抗原为金标纯化猪传染性胃肠炎病毒TGEV、猪流行性腹泻病毒PDEV和猪轮状病毒RV中的任一种、或任两种、或全部，金标抗原的成分与纤维素膜层上的检测印迹所用的溶液成分对应，纤维素膜层上的羊或兔抗SPA蛋白的IgG与所述金标SPA蛋白对应，纤维素膜层上的羊或兔抗病毒的IgG与所述纤维素膜层上的检测印迹所用的溶液成分对应。
支撑层用硬质塑胶片条，或不吸水的硬纸片条；测试端纤维层用玻璃棉，或尼龙纤维膜，或聚酯纤维膜；吸水材料层用吸水纸；纤维素膜层用硝酸纤维素膜，或纯纤维素膜，或羧化纤维素膜，或聚偏二氟乙烯纤维膜PVDF；吸附金标SPA蛋白或与待检抗体相应的金标抗原纤维层用玻璃棉，或尼龙纤维膜，或聚酯纤维膜。
纤维素膜层上含有一条或个检测印迹时，一条或个检测印迹和对照印迹的排列形式为
Figure A20081014116300051
Figure A20081014116300052
Figure A20081014116300053
Figure A20081014116300054
Figure A20081014116300055
Figure A20081014116300057
Figure A20081014116300058
Figure A20081014116300059
Figure A200810141163000510
Figure A200810141163000511
Figure A200810141163000512
中的任一种；纤维素膜层上含有两条或个检测印迹时，两条或个检测印迹和对照印迹的排列形式为
Figure A200810141163000515
Figure A200810141163000516
Figure A200810141163000517
Figure A200810141163000518
Figure A200810141163000519
Figure A200810141163000520
Figure A200810141163000521
Figure A200810141163000523
Figure A200810141163000524
Figure A200810141163000525
中的任一种；纤维素膜层上含有三条或个检测印迹时，三条或个检测印迹和对照印迹的排列形式为
Figure A200810141163000526
Figure A200810141163000527
Figure A200810141163000528
Figure A200810141163000529
Figure A200810141163000530
Figure A200810141163000531
Figure A200810141163000532
Figure A200810141163000533
Figure A200810141163000534
中的任一种。
纤维素膜层上依次含有用纯化的猪传染性胃肠炎病毒TGEV、猪流行性腹泻病毒PDEV和猪轮状病毒RV溶液中的任一种印制的直线式检测印迹
Figure A200810141163000535
用羊或兔抗SPA蛋白的IgG溶液或者用羊或兔抗猪传染性胃肠炎病毒TGEV的IgG溶液/抗猪流行性腹泻病毒PDEV的IgG溶液/抗猪轮状病毒RV的IgG溶液中的任一种印制的直线式对照印迹
Figure A20081014116300061
纤维素膜层上依次含有用纯化的猪传染性胃肠炎病毒TGEV、猪流行性腹泻病毒PDEV和猪轮状病毒RV溶液中的任两种印制的双平行直线式检测印迹用羊或兔抗SPA蛋白的IgG溶液或者用羊或兔抗猪传染性胃肠炎病毒TGEV的IgG溶液/抗猪流行性腹泻病毒PDEV的IgG溶液/抗猪轮状病毒RV的IgG溶液中的任两种合并印制的一条直线式对照印迹
Figure A20081014116300063
纤维素膜层上依次含有用纯化的猪传染性胃肠炎病毒TGEV、猪流行性腹泻病毒PDEV和猪轮状病毒RV溶液印制的三条平行直线式检测印迹
Figure A20081014116300064
用羊或兔抗SPA蛋白的IgG溶液、或用羊或兔抗猪传染性胃肠炎病毒TGEV的IgG溶液和抗猪流行性腹泻病毒PDEV的IgG溶液和抗猪轮状病毒RV的IgG溶液合并印制的一条直线式对照印迹
Figure A20081014116300065
在测试端纤维层、吸附金标SPA蛋白或金标抗原纤维层及吸水材料层上覆盖有塑胶保护膜，在测试端纤维层与金标SPA蛋白或金标抗原纤维层交界处对应的塑胶保护膜上印制有样品标记线，该标记线偏向测试端纤维层一侧0.5cm处。
本发明的有益效果：
1.本发明的检测特异性强，敏感性高。本发明的检测试纸条以胶体金标记3种纯化的猪病病毒抗原(Wi)或SPA为基础制备而成，金标抗原或SPA中金颗粒与抗原或SPA分子之间无共价键形成，二者通过异性电荷间的范德华力相结合，胶体金对这3种纯化猪病病毒抗原(Wi)的特异性影响很小，也不影响SPA与抗体的结合及抗原与抗体的结合，且具有较高的标记率。因此，该检测试纸条具有较高的特异性和敏感性，可检测到2纳克的相应的抗体蛋白。
2.本发明操作简便，快速。使用本发明试纸条时无需附加任何其它仪器和试剂，只要将其测试端插入待检血清中30秒左右，然后在5分钟左右即可判定检测结果。
3.本发明的检测结果显示直观、准确。本发明的检测试纸条以显示棕红色的检测印迹线和对照印迹线
Figure A20081014116300066
作为检测的阳性和阴性标记，即在纤维素膜上只显示一条棕红色
Figure A20081014116300071
对照印迹线，表示猪病抗体在被检血清中未检出，在纤维素膜上显示一条棕红色
Figure A20081014116300072
对照印迹线和1～3条棕红色检测印迹线，则表示在被检血清中检出相应猪病的抗体，检测结果呈阳性；结果判定直观、准确，简单明了，不易出现假阴性和假阳性误判。
4.本发明的检测投资和检测成本小。使用该快速检测试纸条，不需另配其它仪器、设备和试剂，节省大量仪器、设备和附加试剂费用；一条试纸一次可以检测1～3种猪病抗体，而且专业和非专业人士均可随时随地进行实时在线检测，无需支付专家诊断检查费或送样品去诊断室的路费，节省检测成本，检测费用低。
5.本发明应用范围广，便于普遍推广应用。本发明快速检测试纸操作简单成“一步式”或“傻瓜式”，而且方便携带和保存，能满足不同层次人员的需要，包括专业化验、海关检疫、卫生防疫、质量监测、畜产品加工、集约化养殖到个体养殖等，具有广阔的市场前景和较大的经济、社会效益。
(四)、附图说明：
图1为本发明中试纸条的结构示意图之一；图2为图1的俯视结构示意图；
图3为本发明中试纸条的结构示意图之二；图4为图3的俯视结构示意图；
图5为本发明中试纸条的结构示意图之三；图6为图5的俯视结构示意图；
图7为本发明中试纸条的结构示意图之四；图8为图7的俯视结构示意图；
图9为本发明中试纸条的结构示意图之五；图10为图9的俯视结构示意图；
图11为本发明中试纸条的结构示意图之六；图12为图11的俯视结构示意图。
(五)、具体实施方式：
要制成本发明的检测试纸条，需制备纯化的TGEV、PDEV和RV及其多克隆抗体，以及抗SPA抗体，用于制备金标抗原纤维、检测印迹和对照印迹。
1.羊或兔抗SPA蛋白的IgG的制备
以50μg～100μg SPA/kg体重经皮下和肌肉注射阴性健康羊或家兔3～4次，末次免疫20天后，静脉采血，以ELISA测定其血清抗体效价在1∶2000以上，心脏采血或颈动脉放血，收集其高免血清。取1份血清加2份PBS液(pH7.2)混匀，加等体积饱和硫酸铵液混匀，置4℃冰箱内2h，在4℃、10000r/min离心15min，弃上清液；以适量PBS液(pH7.2)溶解沉淀，加饱和硫酸铵液至其最终浓度为33％，置4℃冰箱内2h，在4℃、10000r/min条件下离心15min，弃上清液，以少量PBS液(pH7.2)溶解沉淀，置4℃冰箱内用PBS液(pH7.2)过夜透析，换液2～3次，在4℃、10000r/min条件下离心15min，收集上清液，以紫外分光光度计测定其蛋白浓度。以饱和硫酸铵法提取的羊或兔抗SPAIgG，用于制备该快速检测试纸条的对照印迹。
2.羊或兔抗TGEV、PDEV和RV的IgG(Xi)的制备
采用国家批准的三种猪病(猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)和轮状病毒(RV))的灭活疫苗或弱毒疫苗，多次免疫接种抗体阴性健康羊或兔。末次免疫20天后静脉采血，以ELISA测定其血清TGEV、PDEV和RV抗体效价均在1∶2000以上，心脏采血或颈动脉放血，收集其高免血清，以饱和硫酸铵法提取血清中IgG抗体(方法与提取抗SPA的IgG相同，不重述)。
3.纯化TGEV、PDEV和RV(Wi)的制备
3.1 TGEV增殖纯化：取适应ST或PK15细胞的猪传染性胃肠炎病毒种毒液，适量接种ST或PK15单层细胞(细胞单层接毒前用PBS洗2遍)，加入不含血清的低糖DMEM维持液(但含有终浓度2g/L的水解乳蛋白)，37℃、5％CO2中静置继续培养。每天观察，当细胞病变达到80％时收获培养物冻存于-30℃。将病毒细胞培养物反复冻融3次，8000r/min离心30min去除细胞碎片沉淀，上清液通过孔径0.3μm无菌滤器过滤。将滤液用饱和硫酸铵沉淀法浓缩至原体积的1/100，以备蔗糖梯度离心。配制20％～50％连续浓度梯度的蔗糖溶液，从离心管底部逐层向上铺设，在蔗糖液上部加浓缩后的病毒液，放入超速离心机，4℃38000r/min离心1.5h，取沉降在36％～40％蔗糖浓度之间的病毒带，透析浓缩即为纯化抗原。-32℃冻存备用。
3.2PDEV增殖纯化：取适应Vero或ST细胞的猪流行性腹泻病毒种毒液，适量接种Vero或ST单层细胞(细胞单层接毒前用PBS洗2遍)，37℃、5％CO2中吸附1h，加入2％血清低糖DMEM维持液(含终浓度5μg/mL的胰酶)，继续静置培养。每天观察，当细胞病变达到80％时收获培养物冻存于-30℃。将病毒细胞培养物反复冻融3次，8000r/min离心30min去除细胞碎片沉淀，上清液通过孔径0.3μm无菌滤器过滤。将滤液用饱和硫酸铵沉淀法浓缩至原体积的1/100，以备蔗糖梯度离心。配制20％～50％连续浓度梯度的蔗糖溶液，从离心管底部逐层向上铺设，在蔗糖液上部加浓缩后的病毒液，放入超速离心机，4℃38000r/min离心1.5h，取沉降在36％～40％蔗糖浓度之间的病毒带，透析浓缩即为纯化抗原。-32℃冻存备用。
3.3RV增殖纯化：取适应猴肾传代细胞系MA-104或PK15的猪轮状病毒种毒液，加入终浓度10μg/ml的胰酶，37℃作用30min，然后适量接种MA-104或PK15单层细胞(细胞单层接毒前用PBS洗2遍)，37℃、5％CO2中静置培养1h后，每瓶加入无血清DMEM液(但含有终浓度1～2μg/ml的胰酶)继续培养。每天观察，当细胞病变达到80％时收毒，冻存于-30℃待用。将猪轮状病毒细胞培养物反复冻融3次，7000r/min离心40min，取上清，40000r/min离心1.5h，以少许的PBS溶解沉淀物。在超离管中加入50％氯化铯溶液作垫，在其上层加入10％～30％蔗糖溶液，最后层加上述病毒液，40000r/min离心2h，吸取氯化铯溶液垫层表面的浓缩病毒液，透析浓缩即为纯化抗原。-32℃保存待用。
4.金标纯化TGEV、PDEV和RV(Wi)玻璃棉或金标SPA玻璃棉的制备
以柠檬酸钠还原法制备金溶胶，即在50～100ml沸腾的0.01～0.05％氯金酸水溶液中加入2～4ml的0.5～2％柠檬酸三钠溶液，获得直径15nm左右的胶体金。以0.1mol/L的K2CO3调胶体金pH至8.5～9.5，以1∶1000～1300的标记比将待标记的纯化病毒TGEV或PDEV或RV(W1或W2或W3)或者SPA加入pH8.5～9.5的金溶胶中，标记10min后，加20％PEG10000至终浓度0.05％，4℃、1500～3000r/min离心20min，除去未结合的胶体金颗粒，4℃、15000r/min离心1h，弃上清，获初步纯化金标病毒或SPA混合物后，用丙烯葡聚糖S-400柱层析，分离纯化金标蛋白，分别获得胶体金标记的TGEV、PDEV和RV或者SPA。将1∶100～500稀释的胶体金标记物吸附于精制玻璃棉中，4℃真空干燥，制备出金标抗原或SPA玻璃棉。
5.该快速检测试纸条实施检测的原理
当该快速检测试纸条测试端插入待检测血清后，待检血清通过虹吸带动待检猪病抗体及金标抗原玻璃棉中的金标抗原(Wi)一起向硝酸纤维素膜扩散，并最终渗入手柄端滤纸中，扩散过程中待检猪病抗体可与相应的金标SPA或病毒抗原(Wi)相结合，该结合物进而与纤维素膜上的纯化病毒抗原检测印迹结合，从而显示出棕红色的检测印迹T、P、R；而羊(或兔)抗SPA的IgG或抗这3种病毒的IgG则可与金标SPA或金标病毒抗原(Wi)结合，形成棕红色对照印迹C。如果待检血清中没有TGEV、PDEV、RV这3种猪病病毒的抗体，试纸条只显示出一条棕红色对照印迹C；血清中含有抗TGEV(PDEV或RV)的抗体，则分别与其金标抗原W1(W2或W3)或SPA结合，再与纤维素膜上的纯化病毒抗原检测印迹T(P或R)结合，显示棕红色检测印迹，为阳性标记；如果纤维素膜上没有任何棕红色印迹显示，则表明试纸条已失效或操作失误。
6.该快速检测试纸条的检测操作方法
(1)检测样品液的制备：无菌取病猪的血液，并分离血清，以生理盐水作1∶10～50倍稀释血清待测。
(2)检测操作：将该快速检测试纸条测试端插入待检测血清中，插入深度不超过标记线9，约30秒后取出试纸条，水平放置约1～5分钟，同时观察结果。
(3)结果判断：如果在检测试纸条纤维素膜上只显示出一条棕红色对照印迹C，表示检测结果呈阴性，说明在被检血清中未检测出抗TGEV、PDEV和RV的抗体；如果检测试纸条上的纤维素膜出现棕红色的对照印迹C和检测印迹T或P或R，表示检测结果呈阳性，即在待检血清中检测出抗TGEV或PDEV或RV的抗体；如果检测印迹T、P、R同时出现，表示在待检血清中检测出抗TGEV、PDEV和RV这3种猪病病毒的抗体；如果纤维素膜上没有任何一条棕红色印迹显示，则表明试纸条已失效或操作有误。
实施例一：参见图1～图2，图中，1为支撑层，用硬质塑胶片条制成，2为测试端纤维层，用玻璃棉制成，3为吸附有金标SPA的纤维层(根据上述具体制备方法4制备的金标SPA玻璃棉)，4为纤维素膜层，采用硝酸纤维素膜，5为吸水材料层，用吸水滤纸制成，将编号2、3、4、5各层依次从左至右粘贴在塑胶薄片条1上，彼此之间交界处纤维互相交叉渗透。在硝酸纤维素膜层4上，分别用纯化TGEV、PDEV和RV病毒溶液印上检测印迹T、P、R，用羊或兔抗SPAIgG溶液印上对照印迹C，印迹T、P、R、C的排列形式为
Figure A20081014116300101
Figure A20081014116300111
Figure A20081014116300112
Figure A20081014116300113
Figure A20081014116300114
Figure A20081014116300115
Figure A20081014116300116
Figure A20081014116300117
中的任一种，8-1为覆盖在纤维层2和金标SPA纤维层3上面的测试端白色塑胶保护膜，在2和3交界处对应塑胶保护膜8-1位置上偏向于玻璃棉2一侧0.5cm处印有标记线9，9的右端印有箭头及max字样，吸水层5(手柄端)上覆盖有黄色塑胶保护膜8-2。待测血清的制备及检测步骤，同具体操作方法6中的检测操作方法，不重述。
实施例二：参见图1～图2，本实施例同实施例一基本相同，相同之处不再重述，不同之处在于：3为吸附金标抗原纤维层，它为吸附有金标纯化TGEV、PDEV和RV病毒的纤维层(根据上述具体制备方法4制备的金标抗原玻璃棉)，在硝酸纤维素膜层4上，C为用抗TGEV、PDEV和RV的IgG溶液合并印制的
Figure A20081014116300118
形对照印迹。
实施例三：参见图1～图2，本实施例同实施例一基本相同，相同之处不再重述，不同之处在于：支撑层1用不吸水的硬纸片条，纤维素膜层4采用聚偏二氟乙烯纤维膜PVDF。
实施例四：参见图1～图2，本实施例同实施例一基本相同，相同之处不再重述，不同之处在于：纤维素膜层4采用纯纤维素膜，吸附有金标SPA的纤维层3用聚酯纤维膜。
实施例五：参见图1～图2，本实施例同实施例一基本相同，相同之处不再重述，不同之处在于：纤维素膜层4采用羧化纤维素膜。
实施例六：参见图1～图2，本实施例同实施例一基本相同，相同之处不再重述，不同之处在于：测试端纤维层2用聚酯纤维膜。
实施例七：参见图1～图2，本实施例同实施例一基本相同，相同之处不再重述，不同之处在于：测试端纤维层2用聚酯纤维膜，纤维素膜层4采用纯纤维素膜。
实施例八：参见图1～图2，本实施例同实施例一基本相同，相同之处不再重述，不同之处在于：测试端纤维层2用聚酯纤维膜，纤维素膜层4采用羧化纤维素膜。
实施例九：参见图1～图2，本实施例同实施例一基本相同，相同之处不再重述，不同之处在于：测试端纤维层2用聚酯纤维膜，纤维素膜层4采用聚偏二氟乙烯纤维膜PVDF。
实施例十：参见图1～图2，本实施例同实施例一基本相同，相同之处不再重述，不同之处在于：测试端纤维层2用尼龙纤维膜。
实施例十一：参见图1～图2，本实施例同实施例一基本相同，相同之处不再重述，不同之处在于：测试端纤维层2用尼龙纤维膜，纤维素膜层4采用纯纤维素膜，吸附有金标SPA的纤维层3用聚酯纤维膜。
实施例十二：参见图1～图2，本实施例同实施例一基本相同，相同之处不再重述，不同之处在于：测试端纤维层2用尼龙纤维膜，纤维素膜层4采用羧化纤维素膜。
实施例十三：参见图1～图2，本实施例同实施例一基本相同，相同之处不再重述，不同之处在于：测试端纤维层2用尼龙纤维膜，纤维素膜层4采用聚偏二氟乙烯纤维膜PVDF。
实施例十四：参见图1～图2，本实施例同实施例二基本相同，相同之处不再重述，不同之处在于：支撑层1用不吸水的硬纸片条，纤维素膜层4采用聚偏二氟乙烯纤维膜PVDF。
实施例十五：参见图1～图2，本实施例同实施例二基本相同，相同之处不再重述，不同之处在于：纤维素膜层4采用纯纤维素膜，吸附金标抗原纤维层3用尼龙纤维膜。
实施例十六：参见图1～图2，本实施例同实施例二基本相同，相同之处不再重述，不同之处在于：纤维素膜层4采用羧化纤维素膜。
实施例十七：参见图1～图2，本实施例同实施例二基本相同，相同之处不再重述，不同之处在于：测试端纤维层2用聚酯纤维膜，吸附金标抗原纤维层3用尼龙纤维膜。
实施例十八：参见图1～图2，本实施例同实施例二基本相同，相同之处不再重述，不同之处在于：测试端纤维层2用聚酯纤维膜，纤维素膜层4采用纯纤维素膜。
实施例十九：参见图1～图2，本实施例同实施例二基本相同，相同之处不再重述，不同之处在于：测试端纤维层2用聚酯纤维膜，纤维素膜层4采用羧化纤维素膜。
实施例二十：参见图1～图2，本实施例同实施例二基本相同，相同之处不再重述，不同之处在于：测试端纤维层2用聚酯纤维膜，纤维素膜层4采用聚偏二氟乙烯纤维膜PVDF。
实施例二十一：参见图1～图2，本实施例同实施例二基本相同，相同之处不再重述，不同之处在于：测试端纤维层2用尼龙纤维膜。
实施例二十二：参见图1～图2，本实施例同实施例二基本相同，相同之处不再重述，不同之处在于：测试端纤维层2用尼龙纤维膜，纤维素膜层4采用纯纤维素膜。
实施例二十三：参见图1～图2，本实施例同实施例二基本相同，相同之处不再重述，不同之处在于：测试端纤维层2用尼龙纤维膜，纤维素膜层4采用羧化纤维素膜。
实施例二十四：参见图1～图2，本实施例同实施例二基本相同，相同之处不再重述，不同之处在于：测试端纤维层2用尼龙纤维膜，纤维素膜层4采用聚偏二氟乙烯纤维膜PVDF。
实施例二十五：参见图3～图4，图中，1为支撑层，用硬质塑胶片条制成，2为测试端纤维层，用玻璃棉制成，3为吸附有金标SPA的纤维层(根据上述具体制备方法4制备的金标SPA玻璃棉)，4为纤维素膜层，采用硝酸纤维素膜，5为吸水材料层，用吸水滤纸制成，将编号2、3、4、5各层从左至右粘贴在塑胶薄片条1上，彼此之间交界处纤维互相交叉渗透。在硝酸纤维素膜层4上，分别用纯化TGEV、PDEV病毒溶液印上检测印迹T、P，用羊或兔抗SPA IgG溶液印上对照印迹C，印迹T、P、C的排列形式为
Figure A20081014116300131
Figure A20081014116300132
Figure A20081014116300133
Figure A20081014116300134
Figure A20081014116300135
Figure A20081014116300136
Figure A20081014116300137
Figure A20081014116300138
Figure A20081014116300139
Figure A200810141163001311
Figure A200810141163001312
中的任一种，8-1为覆盖在纤维层2和金标SPA纤维层3上面的测试端白色塑胶保护膜，在2和3交界处对应塑胶保护膜8-1位置上偏向于玻璃棉2一侧0.5cm处印有标记线9，9的右端印有箭头及max字样，吸水层5(手柄端)上覆盖有黄色塑胶保护膜8-2。待测血清的制备及检测步骤，同具体操作方法6中的检测操作方法，不重述。
实施例二十六：参见图3～图4，本实施例同实施例二十五基本相同，相同之处不再重述，不同之处在于：3为吸附金标抗原纤维层，它为吸附有金标纯化TGEV和PDEV病毒液的纤维层(根据上述具体制备方法4制备的金标抗原玻璃棉)，在硝酸纤维素膜层4上，C为用抗TGEV、PDEV的IgG溶液合并印制的
Figure A20081014116300141
形对照印迹。
实施例二十七：参见图3～图4，本实施例同实施例二十五基本相同，相同之处不再重述，不同之处在于：支撑层1用不吸水的硬纸片条，纤维素膜层4采用聚偏二氟乙烯纤维膜。
实施例二十八：参见图3～图4，本实施例同实施例二十五基本相同，相同之处不再重述，不同之处在于：纤维素膜层4采用纯纤维素膜，吸附有金标SPA的纤维层3用聚酯纤维膜。
实施例二十九：参见图3～图4，本实施例同实施例二十五基本相同，相同之处不再重述，不同之处在于：纤维素膜层4采用羧化纤维素膜。
实施例三十：参见图3～图4，本实施例同实施例二十五基本相同，相同之处不再重述，不同之处在于：测试端纤维层2用聚酯纤维膜。
实施例三十一：参见图3～图4，本实施例同实施例二十五基本相同，相同之处不再重述，不同之处在于：测试端纤维层2用聚酯纤维膜，纤维素膜层4采用纯纤维素膜。
实施例三十二：参见图3～图4，本实施例同实施例二十五基本相同，相同之处不再重述，不同之处在于：测试端纤维层2用聚酯纤维膜，纤维素膜层4采用羧化纤维素膜。
实施例三十三：参见图3～图4，本实施例同实施例二十五基本相同，相同之处不再重述，不同之处在于：测试端纤维层2用聚酯纤维膜，纤维素膜层4采用聚偏二氟乙烯纤维膜PVDF。
实施例三十四：参见图3～图4，本实施例同实施例二十五基本相同，相同之处不再重述，不同之处在于：测试端纤维层2用尼龙纤维膜，吸附有金标SPA的纤维层3用聚酯纤维膜。
实施例三十五：参见图3～图4，本实施例同实施例二十五基本相同，相同之处不再重述，不同之处在于：测试端纤维层2用尼龙纤维膜，纤维素膜层4采用纯纤维素膜。
实施例三十六：参见图3～图4，本实施例同实施例二十五基本相同，相同之处不再重述，不同之处在于：测试端纤维层2用尼龙纤维膜，纤维素膜层4采用羧化纤维素膜。
实施例三十七：参见图3～图4，本实施例同实施例二十五基本相同，相同之处不再重述，不同之处在于：测试端纤维层2用尼龙纤维膜，纤维素膜层4采用聚偏二氟乙烯纤维膜PVDF。
实施例三十八：参见图3～图4，本实施例同实施例二十六基本相同，相同之处不再重述，不同之处在于：支撑层1用不吸水的硬纸片条，纤维素膜层4采用聚偏二氟乙烯纤维膜。
实施例三十九：参见图3～图4，本实施例同实施例二十六基本相同，相同之处不再重述，不同之处在于：纤维素膜层4采用纯纤维素膜，吸附金标抗原纤维层3用尼龙纤维膜。
实施例四十：参见图3～图4，本实施例同实施例二十六基本相同，相同之处不再重述，不同之处在于：纤维素膜层4采用羧化纤维素膜。
实施例四十一：参见图3～图4，本实施例同实施例二十六基本相同，相同之处不再重述，不同之处在于：测试端纤维层2用聚酯纤维膜。
实施例四十二：参见图3～图4，本实施例同实施例二十六基本相同，相同之处不再重述，不同之处在于：测试端纤维层2用聚酯纤维膜，纤维素膜层4采用纯纤维素膜。
实施例四十三：参见图3～图4，本实施例同实施例二十六基本相同，相同之处不再重述，不同之处在于：测试端纤维层2用聚酯纤维膜，纤维素膜层4采用羧化纤维素膜。
实施例四十四：参见图3～图4，本实施例同实施例二十六基本相同，相同之处不再重述，不同之处在于：测试端纤维层2用聚酯纤维膜，纤维素膜层4采用聚偏二氟乙烯纤维膜PVDF。
实施例四十五：参见图3～图4，本实施例同实施例二十六基本相同，相同之处不再重述，不同之处在于：测试端纤维层2用尼龙纤维膜，吸附金标抗原纤维层3用尼龙纤维膜。
实施例四十六：参见图3～图4，本实施例同实施例二十六基本相同，相同之处不再重述，不同之处在于：测试端纤维层2用尼龙纤维膜，纤维素膜层4采用纯纤维素膜。
实施例四十七：参见图3～图4，本实施例同实施例二十六基本相同，相同之处不再重述，不同之处在于：测试端纤维层2用尼龙纤维膜，纤维素膜层4采用羧化纤维素膜。
实施例四十八：参见图3～图4，本实施例同实施例二十六基本相同，相同之处不再重述，不同之处在于：测试端纤维层2用尼龙纤维膜，纤维素膜层4采用聚偏二氟乙烯纤维膜PVDF。
实施例四十九：参见图5～图6，图中，1为支撑层，用硬质塑胶片条制成，2为测试端纤维层，用玻璃棉制成，3为吸附有金标SPA的纤维层(根据上述具体制备方法4制备的金标SPA玻璃棉)，4为纤维素膜层，采用硝酸纤维素膜，5为吸水材料层，用吸水滤纸制成，将编号2、3、4、5各层从左至右粘贴在塑胶薄片条1上，彼此之间交界处纤维互相交叉渗透。在硝酸纤维素膜层4上，用纯化PDEV病毒溶液印上检测印迹P，用羊或兔抗SPA IgG溶液印上对照印迹C，印迹P、C的排列形式为
Figure A20081014116300161
Figure A20081014116300162
Figure A20081014116300163
Figure A20081014116300164
Figure A20081014116300165
Figure A20081014116300166
Figure A20081014116300167
Figure A20081014116300168
Figure A20081014116300169
Figure A200810141163001611
Figure A200810141163001612
中的任一种，8-1为覆盖在纤维层2和金标SPA纤维层3上面的测试端白色塑胶保护膜，在2和3交界处对应塑胶保护膜8-1位置上偏向于玻璃棉2一侧0.5cm处印有标记线9，9的右端印有箭头及max字样，吸水层5(手柄端)上覆盖有黄色塑胶保护膜8-2。待测血清的制备及检测步骤，同具体操作方法6中的检测操作方法，不重述。
实施例五十：参见图5～图6，本实施例同实施例四十九基本相同，相同之处不再重述，不同之处在于：3为吸附金标抗原纤维层，它为吸附有金标纯化PDEV病毒液的纤维层(根据上述具体制备方法4制备的金标抗原玻璃棉)，在硝酸纤维素膜层4上，C为用抗PDEV的IgG溶液印制的
Figure A200810141163001613
形对照印迹。
实施例五十一：参见图5～图6，本实施例同实施例四十九基本相同，相同之处不再重述，不同之处在于：支撑层1用不吸水的硬纸片条，纤维素膜层4采用聚偏二氟乙烯纤维膜PVDF。
实施例五十二：参见图5～图6，本实施例同实施例四十九基本相同，相同之处不再重述，不同之处在于：纤维素膜层4采用纯纤维素膜，吸附有金标SPA的纤维层3用聚酯纤维膜。
实施例五十三：参见图5～图6，本实施例同实施例四十九基本相同，相同之处不再重述，不同之处在于：纤维素膜层4采用羧化纤维素膜。
实施例五十四：参见图5～图6，本实施例同实施例四十九基本相同，相同之处不再重述，不同之处在于：测试端纤维层2用聚酯纤维膜。
实施例五十五：参见图5～图6，本实施例同实施例四十九基本相同，相同之处不再重述，不同之处在于：测试端纤维层2用聚酯纤维膜，纤维素膜层4采用纯纤维素膜。
实施例五十六：参见图5～图6，本实施例同实施例四十九基本相同，相同之处不再重述，不同之处在于：测试端纤维层2用聚酯纤维膜，纤维素膜层4采用羧化纤维素膜。
实施例五十七：参见图5～图6，本实施例同实施例四十九基本相同，相同之处不再重述，不同之处在于：测试端纤维层2用聚酯纤维膜，纤维素膜层4采用聚偏二氟乙烯纤维膜PVDF。
实施例五十八：参见图5～图6，本实施例同实施例四十九基本相同，相同之处不再重述，不同之处在于：测试端纤维层2用尼龙纤维膜，吸附有金标SPA的纤维层3用聚酯纤维膜。
实施例五十九：参见图5～图6，本实施例同实施例四十九基本相同，相同之处不再重述，不同之处在于：测试端纤维层2用尼龙纤维膜，纤维素膜层4采用纯纤维素膜。
实施例六十：参见图5～图6，本实施例同实施例四十九基本相同，相同之处不再重述，不同之处在于：测试端纤维层2用尼龙纤维膜，纤维素膜层4采用羧化纤维素膜。
实施例六十一：参见图5～图6，本实施例同实施例四十九基本相同，相同之处不再重述，不同之处在于：测试端纤维层2用尼龙纤维膜，纤维素膜层4采用聚偏二氟乙烯纤维膜PVDF。
实施例六十二：参见图5～图6，本实施例同实施例五十基本相同，相同之处不再重述，不同之处在于：支撑层1用不吸水的硬纸片条，纤维素膜层4采用聚偏二氟乙烯纤维膜PVDF。
实施例六十三：参见图5～图6，本实施例同实施例五十基本相同，相同之处不再重述，不同之处在于：纤维素膜层4采用纯纤维素膜，吸附金标抗原纤维层3用尼龙纤维膜。
实施例六十四：参见图5～图6，本实施例同实施例五十基本相同，相同之处不再重述，不同之处在于：纤维素膜层4采用羧化纤维素膜。
实施例六十五：参见图5～图6，本实施例同实施例五十基本相同，相同之处不再重述，不同之处在于：测试端纤维层2用聚酯纤维膜，吸附金标抗原纤维层3用尼龙纤维膜。
实施例六十六：参见图5～图6，本实施例同实施例五十基本相同，相同之处不再重述，不同之处在于：测试端纤维层2用聚酯纤维膜，纤维素膜层4采用纯纤维素膜。
实施例六十七：参见图5～图6，本实施例同实施例五十基本相同，相同之处不再重述，不同之处在于：测试端纤维层2用聚酯纤维膜，纤维素膜层4采用羧化纤维素膜。
实施例六十八：参见图5～图6，本实施例同实施例五十基本相同，相同之处不再重述，不同之处在于：测试端纤维层2用聚酯纤维膜，纤维素膜层4采用聚偏二氟乙烯纤维膜PVDF。
实施例六十九：参见图5～图6，本实施例同实施例五十基本相同，相同之处不再重述，不同之处在于：测试端纤维层2用尼龙纤维膜。
实施例七十：参见图5～图6，本实施例同实施例五十基本相同，相同之处不再重述，不同之处在于：测试端纤维层2用尼龙纤维膜，纤维素膜层4采用纯纤维素膜。
实施例七十一：参见图5～图6，本实施例同实施例五十基本相同，相同之处不再重述，不同之处在于：测试端纤维层2用尼龙纤维膜，纤维素膜层4采用羧化纤维素膜。
实施例七十二：参见图5～图6，本实施例同实施例五十基本相同，相同之处不再重述，不同之处在于：测试端纤维层2用尼龙纤维膜，纤维素膜层4采用聚偏二氟乙烯纤维膜PVDF。
实施例七十三：参见图7～图8，本实施例同实施例一基本相同，相同之处不再重述，不同之处在于：在硝酸纤维素膜层4上，分别用纯化RV、PDEV和TGEV病毒溶液印上检测印迹R、P、T，用羊或兔抗SPA IgG溶液印上对照印迹C，印迹R、P、T、C的排列形式为
Figure A20081014116300192
Figure A20081014116300193
Figure A20081014116300194
Figure A20081014116300196
Figure A20081014116300197
Figure A20081014116300198
中的任一种。
实施例七十四：参见图9～图10，本实施例同实施例二十五基本相同，相同之处不再重述，不同之处在于：在硝酸纤维素膜层4上，分别用纯化RV、PDEV病毒溶液印上检测印迹R、P，用羊或兔抗SPAIgG溶液印上对照印迹C，印迹R、P、C的排列形式为
Figure A20081014116300199
Figure A200810141163001910
Figure A200810141163001912
Figure A200810141163001913
Figure A200810141163001919
Figure A200810141163001920
中的任一种。
实施例七十五：参见图11～图12，本实施例同实施例四十九基本相同，相同之处不再重述，不同之处在于：在硝酸纤维素膜层4上，用纯化TGEV病毒溶液印上检测印迹T，用羊或兔抗SPA IgG溶液印上对照印迹C，印迹T、C的排列形式为
Figure A200810141163001921
Figure A200810141163001922
Figure A200810141163001924
Figure A200810141163001925
Figure A200810141163001926
Figure A200810141163001927
Figure A200810141163001928
Figure A200810141163001930
Figure A200810141163001932
中的任一种。

Claims (8)

1.一种检测一种或多种猪病毒性腹泻疾病抗体的试纸条，含有支撑层、反应试剂载体吸附层，支撑层为不吸水薄片条，反应试剂载体吸附层粘贴于支撑层上，其特征是：反应试剂载体吸附层由样品端依次为测试端纤维层、吸附金标SPA蛋白或与待检抗体相应的金标抗原纤维层、纤维素膜层及手柄端的吸水材料层，在纤维素膜层上含有一个用纯化的猪传染性胃肠炎病毒TGEV、猪流行性腹泻病毒PDEV和猪轮状病毒RV溶液中的任一种印制的检测印迹，或含有纯化的TGEV、PDEV和RV溶液中分别任选两种印制的检测印迹，或含有纯化的TGEV、PDEV和RV三种溶液任选一种排列顺序印制的检测印迹，纤维素膜层上还含有用羊或兔抗SPA蛋白的IgG溶液印制的对照印迹，或者含有用羊或兔抗猪传染性胃肠炎病毒TGEV的IgG溶液、抗猪流行性腹泻病毒PDEV的IgG溶液和抗猪轮状病毒RV的IgG溶液中的任一种或任两种或三种印制的对照印迹。
2.根据权利要求1所述的试纸条，其特征是：所述与待检抗体相应的金标抗原为金标纯化猪传染性胃肠炎病毒TGEV、猪流行性腹泻病毒PDEV和猪轮状病毒RV中的任一种、或任两种、或全部，金标抗原的成分与纤维素膜层上的检测印迹所用的溶液成分对应，纤维素膜层上的羊或兔抗SPA蛋白的IgG与所述金标SPA蛋白对应，纤维素膜层上的羊或兔抗病毒的IgG与所述纤维素膜层上的检测印迹所用的溶液成分对应。
3.根据权利要求1或2所述的试纸条，其特征是：所述支撑层用硬质塑胶片条，或不吸水的硬纸片条；所述测试端纤维层用玻璃棉，或尼龙纤维膜，或聚酯纤维膜；所述吸水材料层用吸水纸；所述纤维素膜层用硝酸纤维素膜，或纯纤维素膜，或羧化纤维素膜，或聚偏二氟乙烯纤维膜PVDF；所述吸附金标SPA蛋白或与待检抗体相应的金标抗原纤维层用玻璃棉，或尼龙纤维膜，或聚酯纤维膜。
4.根据权利要求1或2所述的试纸条，其特征是：所述纤维素膜层上含有一条或个检测印迹时，一条或个检测印迹和对照印迹的排列形式为“||”、“＝”、“//”、“\\”、“-|”、“|-”、“+”、“⊥”、
Figure A2008101411630003C1
、“●●”、
Figure A2008101411630003C2
中的任一种；纤维素膜层上含有两条或个检测印迹时，两条或个检测印迹和对照印迹的排列形式为“|||”、
Figure A2008101411630003C3
“///”、“\\\”、“●●●”、
Figure A2008101411630003C4
Figure A2008101411630003C6
Figure A2008101411630003C7
Figure A2008101411630003C9
Figure A2008101411630003C10
中的任一种；纤维素膜层上含有三条或个检测印迹时，三条或个检测印迹和对照印迹的排列形式为“||||”、
Figure A2008101411630003C11
“////”、“\\\\”、
Figure A2008101411630003C12
“●●●●”、
Figure A2008101411630003C13
中的任一种。
5.根据权利要求4所述的试纸条，其特征是：所述纤维素膜层上依次含有用纯化的猪传染性胃肠炎病毒TGEV、猪流行性腹泻病毒PDEV和猪轮状病毒RV溶液中的任一种印制的直线式检测印迹“|”、用羊或兔抗SPA蛋白的IgG溶液或者用羊或兔抗猪传染性胃肠炎病毒TGEV的IgG溶液/抗猪流行性腹泻病毒PDEV的IgG溶液/抗猪轮状病毒RV的IgG溶液中的任一种印制的直线式对照印迹“|”。
6.根据权利要求4所述的试纸条，其特征是：所述纤维素膜层上依次含有用纯化的猪传染性胃肠炎病毒TGEV、猪流行性腹泻病毒PDEV和猪轮状病毒RV溶液中的任两种印制的双平行直线式检测印迹“||”、用羊或兔抗SPA蛋白的IgG溶液或者用羊或兔抗猪传染性胃肠炎病毒TGEV的IgG溶液/抗猪流行性腹泻病毒PDEV的IgG溶液/抗猪轮状病毒RV的IgG溶液中的任两种合并印制的一条直线式对照印迹“|”。
7.根据权利要求4所述的试纸条，其特征是：所述纤维素膜层上依次含有用纯化的猪传染性胃肠炎病毒TGEV、猪流行性腹泻病毒PDEV和猪轮状病毒RV溶液印制的三条平行直线式检测印迹“|||”，用羊或兔抗SPA蛋白的IgG溶液、或用羊或兔抗猪传染性胃肠炎病毒TGEV的IgG溶液和抗猪流行性腹泻病毒PDEV的IgG溶液和抗猪轮状病毒RV的IgG溶液合并印制的一条直线式对照印迹“|”。
8.根据权利要求1或2所述的试纸条，其特征是：在所述测试端纤维层、吸附金标SPA蛋白或金标抗原纤维层及吸水材料层上覆盖有塑胶保护膜，在测试端纤维层与金标SPA蛋白或金标抗原纤维层交界处对应的塑胶保护膜上印制有样品标记线，该标记线偏向测试端纤维层一侧0.5cm处。
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