CN102109520A - 单纯疱疹病毒Ⅰ、Ⅱ型IgM抗体联检试剂盒及其制备方法 - Google Patents

单纯疱疹病毒Ⅰ、Ⅱ型IgM抗体联检试剂盒及其制备方法 Download PDF

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陈立柱
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Abstract

本发明涉及一种单纯疱疹病毒I、II型IgM抗体联检试剂盒及其制备方法。试剂盒包括样品垫(1)、胶体金垫(2)、硝酸纤维素膜(3)、吸样垫(4)和底板(5)。其中，所述胶体金垫为胶体金标记的鼠抗人IgM单抗玻璃纤维或无纺布；所述硝酸纤维素膜上分别包被了单纯疱疹病毒I型抗原、单纯疱疹病毒II型抗原作为检测线，包被了羊抗鼠IgM抗体作为质控线。本发明利用免疫层析胶体金技术原理测定单纯疱疹病毒I、II型IgM抗体，通过一次操作即可联合检测出单纯疱疹病毒I、II型IgM抗体，简化了操作过程，具有操作简单、反应迅速、灵敏度高、经济实用等特点。

Description

单纯疱疹病毒Ⅰ、Ⅱ型IgM抗体联检试剂盒及其制备方法
技术领域
本发明属于生物应用技术领域，特别涉及一种单纯疱疹病毒I、II型IgM抗体联检试剂盒及其制备方法。
背景技术
单纯疱疹病毒(herpes simplex virus)属于疱疹病毒科a病毒亚科，病毒质粒大小约180nm。根据抗原性的差别目前把人类单纯疱疹病毒分为两型，即单纯疱疹病毒I型(HSV-I)和单纯疱疹病毒II型(HSV-II)。I型疱疹病主要是通过呼吸道、皮肤和粘膜密切接触传播，感染腰以上部位的皮肤粘膜和器官。如引起口唇粘膜、鼻前庭、眼结膜、咽喉部的炎症及疱疹，口和口周围发生的疱疹，99％是由I型疱疹病毒感染引起的。II型疱疹病毒主要存在于女性宫颈、阴道、外阴皮肤及男性的阴茎、尿道等处，是引起生殖器发炎和疱疹的罪魁祸首。据有关统计资料显示，生殖器疱疹的病原体90％为II型疱疹病毒。单纯疱疹病毒是可以导致畸胎的传染病的病原体，若孕妇感染单纯疱疹病毒，妊娠早期可引起死胎、流产、小头畸形、脑内钙化等神经系统的畸形，其症状与巨细胞病毒相似。因此，建立单纯疱疹病毒I、II型快速、准确的检测方法是预防的关键所在。
当一种抗原(病毒或细菌)进入机体后，免疫应答中首先分泌的抗体是IgM抗体，它们在与抗原结合后启动补体的级联反应，同时还把入侵者相互连接起来，聚成一堆便于巨噬细胞的吞噬，因此IgM在机体的早期防御中起着重要的作用，IgM的检测具有重要的参考意义。
目前单独检测单纯疱疹病毒I或II型IgM抗体的方式很多，例如酶联免疫吸附法(ELISA)、免疫胶体金渗滤法、乳胶凝集法、免疫荧光法(IFA)等。但还未有通过一次操作即可联检单纯疱疹病毒I、II型IgM抗体的方法。虽然分别单独检测单纯疱疹病毒I和II型IgM后，再综合分析检测结果对疾病的诊断并无影响，但操作过程繁琐，检测不够方便快捷。
本发明提供一种单纯疱疹病毒I、II型IgM抗体联检试剂盒及其制备方法，能够一次性检测单纯疱疹病毒I、II型IgM抗体，从而简化了操作过程，实现了快速检测的目的。
发明内容
本发明的目的是提供一种方便、快捷、灵敏，用于检测单纯疱疹病毒I、II型IgM抗体的试剂盒，检测人类样本中单纯疱疹病毒I、II型IgM抗体，用于单纯疱疹病毒感染的辅助诊断和鉴别。
本发明提供了一种单纯疱疹病毒I、II型IgM抗体联检试剂盒。包括样品垫(1)、紧密连接于样品垫一端的胶体金垫(2)、与胶体金垫的另一端紧密相连的硝酸纤维素膜(3)和紧密连接于硝酸纤维素膜另一端的吸样垫(4)，硝酸纤维素膜包被了三条线，其中两条检测线(T1，T2线)，一条质控线(C线)，样品垫、胶体金垫、硝酸纤维素膜和吸样垫粘贴在底板(5)上形成试剂条，试剂条也可以装入塑料卡中形成检测卡，其特征在于检测线为分别包被在硝酸纤维素膜上的单纯疱疹病毒I型抗原(T1线)、单纯疱疹病毒II型抗原(T2线)；所述胶体金垫为胶体金标记的鼠抗人IgM单抗玻璃纤维(或无纺布)；所述的底板为PVC板，样品垫为玻璃纤维或无纺布，吸样垫为吸水滤纸。
本发明还提供了一种单纯疱疹病毒I、II型IgM抗体联检试剂盒的制备方法，包括以下步骤：
(1)制备鼠抗人IgM单抗
采用单克隆抗体制备法，取杂交瘤细胞株在体外常规培养、传代，用人源性的IgM注射BALB/C小鼠腹腔，收取腹水，以亲和层析法提纯鼠抗人IgM单抗；
(2)制备单纯疱疹病毒I型抗原与单纯疱疹病毒II型抗原
分别选取单纯疱疹病毒I型、单纯疱疹病毒II型敏感细胞株，接种单纯疱疹病毒I型毒株、单纯疱疹病毒II型毒株，经细胞培养，获取抗原。
(3)制备胶体金颗粒
取0.01％的氯金酸水溶液100ml，加热煮沸。根据需要迅速加入1％枸橼酸三钠水溶液1.0ml，继续煮沸约5min，出现橙红色。这样制成的胶体金颗粒的大小为20-40nm。
(4)胶体金垫的制备
取颗粒大小为20-40nm的胶体金溶液，用0.1mol/L K2CO3将胶体金溶液的pH值调至8.0，按100ml胶体金溶液加入1.5mg鼠抗人IgM单抗的比例混合均匀，室温搅拌30分钟；加入10％牛血清蛋白(BSA)溶液，室温搅拌5分钟；加入10％聚乙二醇(PEG)2000溶液，室温搅拌5分钟；11000r/min离心60分钟，仔细吸取上清液，弃去；用胶体金复溶液复溶至100ml，按1ml溶液铺28cm2的比例均匀铺在玻璃纤维膜或无纺布上，再置干燥间，在温度25℃，湿度小于30％的条件下干燥2小时，制成胶体金垫。
(5)样品垫的处理
将玻璃纤维或无纺布浸泡于含有5ml 10％ BSA，2.5ml 10％Tween-20的0.01M pH7.4的磷酸缓冲溶液50ml中30min，于38℃烘干，真空封装，置4℃备用。
(6)包被单纯疱疹病毒I型抗原、单纯疱疹病毒II型抗原，羊抗鼠IgM抗体
设定划膜仪涂覆参数1μL/cm，分别用微量进样器取1ml单纯疱疹病毒I型抗原、单纯疱疹病毒II型抗原、羊抗鼠IgM抗体，按顺序接到划膜仪的A、B、C管道接口。将贴有硝酸纤维素膜的PVC板置于划膜仪的往复运动平台上，开启划膜仪，在硝酸纤维素膜上涂覆单纯疱疹病毒I型抗原(T1线)、单纯疱疹病毒II型抗原(T2线)、羊抗鼠IgM抗体(C线)。划线后将硝酸纤维素膜烘箱中，温度38℃，干燥24小时，备用。
(7)试剂盒的组装
将样品垫、胶体金垫、硝酸纤维素膜、吸样垫按图1所示的顺序依次粘贴在底板上，切成2.5mm宽的小条，制得试剂条，也可以将试剂条装在塑料卡中形成检测卡。
本发明所述试剂盒的检测方法为：将被检血清或血浆或全血平衡至室温；取出单纯疱疹病毒I、II型IgM抗体联检装置，水平放置；在样品垫中加入2-3滴样品，15分钟内观察并记录C、T1、T2线的显色情况，判断检测结果。
本发明的检测试剂盒采用免疫层析胶体金技术测定单纯疱疹病毒I、II型IgM抗体，检测时，将被测样品加在试纸条(卡)上的样品垫上，可以直接观察到免疫反应的结果，完成样品检测。本发明可用于定性检测样本中可能存在的单纯疱疹病毒I、II型IgM抗体，达到快速筛检病人，及时控制疫情的目的。通过一次操作即可联合检测出单纯疱疹病毒I、II型IgM抗体，简化了操作过程，且检测结果具有较高的总体符合率，具有操作简单、反应迅速、灵敏度高、经济适用等特点。
附图说明
图1单纯疱疹病毒I、II型IgM抗体联检试剂盒结构示意图；
附图符号说明：
1：样品垫；
2：含有标记鼠抗人IgM单抗的胶体金垫；
3：硝酸纤维素膜(T1和T2线：单纯疱疹病毒I型抗原、单纯疱疹病毒II型抗原包被线；C线：羊抗鼠IgM抗体包被线)；
4：吸样垫；
5：底板；
图2本发明试剂盒的检测结果示意图。
自左至右依次为T1、C两条线阳性检测结果；T2、C两条线阳性检测结果；T1、T2、C三条线阳性检测结果；C一条线阴性检测结果；无效。
具体实施方式
实施例1：制备单纯疱疹病毒I、II型IgM抗体联检试剂盒
1.制备鼠鼠抗人IgM单抗抗体
采用单克隆抗体制备法，取杂交瘤细胞株在体外常规培养、传代，用人源性的IgM注射BALB/C小鼠腹腔，收取腹水，以亲和层析法提纯鼠抗人IgM单抗。
2.制备单纯疱疹病毒I型抗原与单纯疱疹病毒II型抗原
将人胚二倍体细胞培养至单层，接种单纯疱疹病毒I型标准毒株，待单纯疱疹病毒I型毒株接种2-3天后，100％细胞病变，收集培养液和/病变细胞，PBS洗3次，加入pH 9.0的甘氨酸-氢氧化钠缓冲液。冻融3次后超声波处理，差速离心后取上清，测定蛋白含量和包被工作浓度后，储存于-20℃，备用。
采用同样的方法，接种单纯疱疹病毒II型标准毒株，经细胞培养，获得单纯疱疹病毒II型抗原，储存于-20℃，备用。
3.制备胶体金颗粒
取0.01％的氯金酸水溶液100ml，加热煮沸。根据需要迅速加入1％枸橼酸三钠水溶液1ml，继续煮沸约5min，出现橙红色。这样制成的胶体金颗粒的大小为20-40nm。
4.样品垫的处理
将玻璃纤维或无纺布浸泡于含有5ml 10％BSA，2.5ml 10％Tween-20的0.01M pH 7.4的磷酸缓冲溶液50ml中30min，于38℃烘干，真空封装，置4℃备用。
5.胶体金垫的制备
取颗粒大小为20-40nm的胶体金溶液，用0.1mol/L K2CO3将胶体金溶液的pH值调至8.0左右，按100ml胶体金溶液加入1.5mg鼠抗人IgM单抗的比例混合均匀，室温搅拌30分钟；加入10％牛血清蛋白(BSA)溶液，室温搅拌5分钟；加入10％聚乙二醇(PEG)2000溶液，室温搅拌5分钟；11000r/min离心60分钟，仔细吸取上清液，弃去；用胶体金复溶液复溶至100ml，按1ml溶液铺28cm2的比例均匀铺在玻璃纤维膜或无纺布上，再置干燥间，在温度25℃，湿度小于30％的条件下干燥2小时，制成胶体金垫。
6.包被单纯疱疹病毒I型抗原、单纯疱疹病毒II型抗原，羊抗鼠IgM抗体
设定划膜仪涂覆参数1μL/cm，分别用微量进样器取1ml单纯疱疹病毒I型抗原、单纯疱疹病毒II型抗原、羊抗鼠IgM抗体，按顺序接到划膜仪的A、B、C管道接口。将贴有硝酸纤维素膜的PVC板置于划膜仪的往复运动平台上，开启划膜仪，在硝酸纤维素膜上分别涂覆浓度为2.5mg/ml的单纯疱疹病毒I型抗原(T1线)、浓度为3.0mg/ml的单纯疱疹病毒II型抗原(T2线)、浓度为3.0mg/ml的羊抗鼠IgM抗体(C线)。划线后将硝酸纤维素膜烘箱中，温度38℃，干燥24小时，备用。
7.试剂盒的组装
将样品垫、胶体金垫、硝酸纤维素膜、吸样垫按图1所示的顺序依次粘贴在底板上，切成2.5mm宽的小条，制得试剂条，也可以将试剂条装在塑料卡中形成检测卡。
将被检血清或血浆或全血平衡至室温；取出单纯疱疹病毒I、II型IgM抗体联检装置，水平放置；在样品垫中加入2滴样品，15分钟内观察并记录C、T1、T2线的显色情况，判断检测结果。
检测样品(血清、血浆或全血)时，若是阳性，样品与胶体金标记鼠抗人IgM单抗复合物结合，由于层析作用复合物沿纸条向前移动，当样品-胶体金标记鼠抗人IgM单抗复合物移动到单纯疱疹病毒I型抗原抗体包被线(T1)时，若样品中含有单纯疱疹病毒I型IgM抗体，则IgM抗体与包被线上的单纯疱疹病毒I型抗原结合，形成胶体金-鼠抗人IgM单抗-IgM抗体-单纯疱疹病毒I型抗原夹心物而凝聚显色，此时T1包被线可观察到红色条带；当样品-胶体金标记鼠抗人IgM单抗复合物移动到单纯疱疹病毒II型抗原包被线(T2)时，若样品中含有单纯疱疹病毒II型IgM抗体，则形成胶体金-鼠抗人IgM单抗-IgM抗体-单纯疱疹病毒II型抗原夹心物而凝聚显色，此时T2包被线可观察到红色条带；当胶体金标记鼠抗人IgM单抗复合物移动到羊抗鼠IgM抗体包被线(C)时，与羊抗鼠IgM抗体结合而显色，此时C包被线可观察到红色条带。在T1包被线观察到红色条带，判定为样品中含有单纯疱疹病毒I型IgM抗体；在T2包被线可观察到红色条带，判定为样品中含有单纯疱疹病毒II型IgM抗体；若T1、T2包被线处同时可观察到红色条带，判定为被检测样品中同时含有单纯疱疹病毒I、II型IgM抗体；若T1、T2包被线处同时不能观察到红色条带，则判定为被检测样品中不含有单纯疱疹病毒I、II型IgM抗体；无论单纯疱疹病毒I、II型IgM抗体是否存在于样本中，一条红色条带都会出现在质控线(C)。质控线(C)所显现的红色条带是判定是否有足够样本，层析过程是否正常的标准，同时也作为试剂的内控标准。

Claims (7)

1.一种利用特异性的抗原抗体反应及胶体金免疫层析技术制备的单纯疱疹病毒I、II型IgM抗体联检试剂盒，其特征在于由样品垫(1)、胶体金垫(2)、硝酸纤维素膜(3)、吸样垫(4)和底板(5)组成，底板上依次粘贴样品垫、胶体金垫、硝酸纤维素膜和吸样垫，其中胶体金垫为胶体金标记的鼠抗人IgM单抗玻璃纤维(或无纺布)，硝酸纤维素膜上包被了单纯疱疹病毒I型抗原、单纯疱疹病毒II型抗原作为检测线，羊抗鼠IgM作为质控线。
2.一种如权利要求1所述的单纯疱疹病毒I、II型IgM抗体联检试剂盒，其特征在于，所述的底板为PVC板，样品垫为玻璃纤维或无纺布，吸样垫为吸水滤纸。
3.一种如权利要求1所述的单纯疱疹病毒I、II型IgM抗体联检试剂盒，其特征在于，所述的胶体金是由氯金酸(HAuCl4)在还原剂枸橼酸三钠作用下，聚合成为大小为20-40nm的胶体金颗粒。
4.一种如权利要求1所述的单纯疱疹病毒I、II型IgM抗体联检试剂盒，其特征在于，所述的胶体金标记鼠抗人IgM单抗的pH值为8.0，胶体金与鼠抗人IgM单抗的配比为15μg/ml胶体金。
5.一种如权利要求1所述的单纯疱疹病毒I、II型IgM抗体联检试剂盒，其特征在于，所述的硝酸纤维素膜上包被的单纯疱疹病毒I型抗原的浓度为2.5mg/ml，单纯疱疹病毒II型抗原的浓度为3.0mg/ml，羊抗鼠IgM的浓度为3.0mg/ml。
6.一种如权利要求1和6所述的单纯疱疹病毒I、II型IgM抗体联检试剂盒，其特征在于，所述的硝酸纤维素膜上三条包被线的划线方法为：用划膜仪在硝酸纤维素膜上以1μL/cm的参数进行划线，包被单纯疱疹病毒I型抗原溶液与单纯疱疹病毒II型抗原溶液作为检测线，包被羊抗鼠IgM作为质控线，划线后将硝酸纤维素膜烘箱中，温度38℃，干燥24小时。
7.一种如权利要求1所述的单纯疱疹病毒I、II型IgM抗体联检试剂盒，其特征在于，试剂盒的组装方法为：将样品垫、胶体金垫、硝酸纤维素膜、吸样垫依次粘贴在底板上，切成小条，制成试剂条，也可以将试剂条装在塑料卡中形成检测卡。
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