CN102818898A - 一步鉴别口蹄疫病毒感染和疫苗免疫动物的试纸条及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种快速鉴别口蹄疫病毒感染和疫苗免疫动物的试纸条及其制备方法，含有支撑层和吸附层，吸附层附着在支撑层上，吸附层从测试端依次为样品吸附纤维层、金标抗体纤维层、纤维素膜层和手柄端的吸水材料层，在纤维素膜层上设有检测印迹和对照印迹，金标抗体纤维层上吸附有胶体金标记的葡萄球菌蛋白A，检测印迹用大肠杆菌表达系统表达并纯化的猪口蹄疫病毒结构蛋白VP1抗原和非结构蛋白3ABC抗原中的一种或两种印制，对照印迹用羊或兔抗SPA的IgG抗体溶液印制。本发明的试纸条特异性强，灵敏度高，简便，直观，准确，适用范围广，成本低，专业和非专业人士均可随时随地实时检测，易于推广应用。

Description

一步鉴别口蹄疫病毒感染和疫苗免疫动物的试纸条及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种检测口蹄疫病毒的器具，特别是涉及一种快速鉴别口蹄疫病毒感染和疫苗免疫动物的试纸条及其制备方法。

背景技术

口蹄疫（Foot-and-mouth-disease，FMD）是由口蹄疫病毒（FMDV）引起偶蹄动物的一种烈性传染性疫病。FMDV 具有多型性、易变性、宿主广泛性、传染力极强等特点，一旦发病即呈流行性、大爆发性。FMD 的爆发和流行常给发病地区造成巨大损失，除动物死亡造成的直接经济损失外，还有动物患病期间肉和奶的生产停滞、病愈后肉和奶的产量长期下降以及种用价值丧失等较大损失。更为严重的是，FMD 是一种烈性传染病，具有极强的传染性，对于发病动物以及接触病原的同群动物，必需进行严格隔离、封锁、禁止动物移动和畜产品上市等。因此，FMD导致发病地区甚至发病国家的畜产品进出口贸易停止，除造成巨大的经济损失外，还产生一定的政治影响。

疫苗接种是发展中国家控制FMD 的主要策略，由于FMD 固有的特点，目前国内外的疫苗只能保护免疫动物不发生FMD，但是这种方法不能防止免疫动物再次发生FMDV 的感染。在疫区的免疫动物群中，有一定数量的动物是病毒携带者，这些动物有可能持续向外排毒，在牛、羊体内形成持续性感染的病毒可长期存在。这些隐性感染或带毒的动物不但可能引发新的疫情，还为病毒变异和产生新毒株提供了环境。因此，FMDV疫苗免疫动物抗体水平以及如何区分免疫动物和病毒感染动物是控制FMDV 的关键问题。

目前使用的FMDV 疫苗主要是灭活疫苗和合成肽疫苗。灭活疫苗免疫动物后，动物体内不会有病毒增殖，疫苗生产中在病毒纯化过程中已经去除了绝大部分的非结构蛋白（NSP），没有了非结构蛋白的表达，因而在免疫动物体内就不会有非结构蛋白抗体的产生，多肽疫苗本身就是FMDV 结构蛋白VP1上的一个主要抗原表位，更没有非结构蛋白的存在。而FMDV 感染的动物体内，在病毒装配过程中有大量非结构蛋白的表达，刺激机体产生相应的非机构蛋白抗体。结构蛋白抗体检测可以监控动物的免疫状态和抗体产生水平，非结构蛋白抗体检测技术为区分感染动物和免疫动物提供依据，结构蛋白和非结构蛋白检测技术的结合可以达到一步检测FMDV免疫抗体水平以及区分FMDV感染动物和疫苗免疫动物的目的。

目前实验室检测FMDV抗体的方法有：（1）病毒分离：从患病动物的病料中分离出病毒，再对分离到的病毒进行培养鉴定做出诊断，确定是否FMDV 感染。这种技术准确可靠，但敏感性差，而且有些样品中存在补体活性，影响检测效果，并且需要专门的实验室。（2）病毒中和试验：利用病毒与特异性血清中和抗体的相互作用，从而使病毒失去对易感动物和敏感细胞的感染能力，这一方法必须使用活病毒，普通实验室不能操作。（3）酶联免疫吸附试验（ELISA）：主要有区分感染与免疫的非结构蛋白ELISA（I-ELISA）和检测疫苗免疫动物的血清抗体水平的液相阻断ELISA。ELISA方法测定时具有特异、敏感等优势，但操作复杂、费时、费力，需要特定的仪器设备和专业技术人员，很难在基层普及推广。同时，液相阻断ELISA方法需要灭活病毒的参与，因此，还存在病毒灭活不全或病毒逃逸等风险。此外，近年来随着猪O型FMD合成肽疫苗的推广应用，已经逐步占据了主要市场，传统的液相阻断ELISA很难对多肽疫苗抗体做出准确的检测结果。因此，研究一种简便快速、一步可以检测疫苗免疫和病毒感染的实时在线检测技术，非常重要而迫切。

发明内容

本发明要解决的技术问题：克服现有技术中检测口蹄疫病毒抗体和疫苗抗体存在的缺陷，提供一种特异性强、敏感性高、简便、快速鉴别口蹄疫病毒抗体和疫苗抗体的免疫金标试纸条，该试纸条具有特异性强、敏感性高、使用简便、成本低的优点；

本发明还提供了鉴别口蹄疫病毒抗体和疫苗抗体的免疫金标试纸条的制备方法。

本发明采用的技术方案：

一步鉴别口蹄疫病毒感染和疫苗免疫动物的试纸条，含有支撑层和吸附层，吸附层附着在支撑层上，吸附层从测试端依次为样品吸附纤维层、金标抗体纤维层、纤维素膜层和手柄端的吸水材料层，在纤维素膜层上设有检测印迹和对照印迹，所述金标抗体纤维层上吸附有胶体金标记的葡萄球菌蛋白A即SPA，所述检测印迹用大肠杆菌表达系统表达并纯化的猪口蹄疫病毒结构蛋白VP1抗原和非结构蛋白3ABC抗原中的一种或两种印制，对照印迹用羊或兔抗SPA的IgG抗体印制。

所述支撑层用不吸水的硬质塑胶条或硬纸条制成；样品吸附纤维层用玻璃棉、尼龙纤维或聚酯纤维制成；金标抗体纤维层用玻璃棉制成。

所述纤维素膜层用硝酸纤维素膜、纤维素膜、羧甲基纤维素膜或聚偏二氟乙烯PVDF纤维素膜制成；所述吸水材料层用吸水纸制成。

所述纤维素膜层上含有一条/个检测印迹时，检测印迹、对照印迹的排列形式为“｜｜”、“十十”、“┬ ┬”、“┴ ┴”、“├├”、“┤┤”和“● ●”中的任一种；纤维素膜层上含有两条/个检测印迹时，检测印迹、对照印迹的排列形式为“｜｜｜”、“十十十”、“┬ ┬ ┬”、“┴ ┴ ┴”、“├├├”、“┤┤┤”和“● ● ●”中的任一种。

在所述样品吸附纤维层、金标抗体纤维层及吸水材料层上覆盖有保护膜，在样品吸附纤维层与金标抗体纤维层交界处对应的保护膜上印制有样品标记线。

所述试纸条的制备方法，其特征是：该方法包括以下步骤：

（1）大肠杆菌表达并纯化的猪口蹄疫病毒结构蛋白VP1抗原和非结构蛋白3ABC抗原的制备；

（2）胶体金标记的葡萄球菌蛋白A的制备：以柠檬酸钠还原法制备胶体金，进而获得胶体金标记的SPA；

（3）羊抗或兔抗SPA的IgG抗体的制备：

用所得的大肠杆菌表达并纯化的猪口蹄疫病毒结构蛋白VP1抗原和非结构蛋白3ABC抗原中的一种或两种分别在纤维素膜层上制成检测印迹，用羊抗或兔抗小鼠IgG抗体在纤维素膜层上制成对照印迹；将胶体金标记的葡萄球菌蛋白A用于制备金标抗体纤维层，然后将支撑层、吸附层和保护层依次组装成试纸条。

所述试纸条的制备方法中，大肠杆菌表达并纯化的猪口蹄疫病毒结构蛋白VP1抗原的制备方法如下：

根据O 型FMDV VP1模板基因序列设计一对特异性引物：上游引物5’ATAGGATCCA

TGACCACTGCTACCGGGGAGTC3’ 引入酶切位点BamHI，下游引物5’ATAAAGCTTCAAGAGCTGCTTTGCGGGTG3’引入酶切位点HindIII；以重组质粒pMD18T-VP1 为模板，进行PCR 扩增，获得VP1 基因；PCR 产物经BamHI 和HindIII 双酶切消化克隆到PET-28a 载体中，转化大肠杆菌，将重组菌在LB培养基中培养至OD600 达到0.6 时，加入终浓度为0.5mmol/L 的异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷诱导剂，在37℃诱导表达6小时，将表达菌液离心，收获细菌沉淀；

将得到的菌体重悬于20毫升缓冲液中，超声破碎后离心收集沉淀，用洗液洗涤包涵体5次，将沉淀悬于20毫升悬浮液中洗涤1次，最后离心沉淀得到纯化后的包涵体；将纯化后的包涵体溶于pH为 8.0的变性剂中，于4℃搅拌10小时，离心去除不溶物，得到变性蛋白；取90毫升变性蛋白装入透析袋，并将透析袋放入1.8升复性缓冲液中，4℃条件下搅拌透析，每5小时换液一次，换液4次后用1.8升 PBS透析4次，前两次透析12小时/次，后两次透析6小时/次；收集透析袋内的液体，经10000转/分钟、4℃ 离心10分钟，弃去沉淀，将上清用0.45微米滤膜过滤；用20KD 的浓缩管浓缩，3000转/分钟、4℃离心30分钟，收集浓缩蛋白，于-20℃冷冻保存。

所述试纸条的制备方法中，大肠杆菌表达并纯化的猪口蹄疫病毒非结构蛋白3ABC抗原的制备方法如下：

将重组质粒pGEM-T-3ABC 用SalI 和BglII 酶切消化，回收目的片段3ABC；用XholI和BglII对表达载体pTriEx-4Neo进行消化，用T4 DNA Ligase 连接后，转化大肠杆菌菌株，得到重组菌，将重组菌接种到LB培养液中，37℃、250 r/ min 摇至OD600达0.5；加入异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷诱导剂，使其浓度为0.5mmol/L，37℃诱导表达6小时，将表达菌液离心，收获细菌沉淀；

将得到的菌体重悬于20毫升缓冲液中，超声破碎后离心收集沉淀，用洗液洗涤包涵体5次，将沉淀悬于20毫升悬浮液中洗涤1次，最后离心沉淀得到纯化后的包涵体；将纯化后的包涵体溶于pH为 8.0的变性剂中，于4℃搅拌10小时，离心去除不溶物，得到变性蛋白；取90毫升变性蛋白装入透析袋，并将透析袋放入1.8升复性缓冲液中，4℃条件下搅拌透析，每5小时换液一次，换液4次后，用1.8升 PBS透析4次，前两次透析12小时/次，后两次透析6小时/次；收集透析袋内的液体，经10000转/分钟、4℃ 离心10分钟，弃去沉淀，将上清用0.45微米滤膜过滤；用20KD 的浓缩管浓缩，3000转/分钟、4℃离心30分钟，收集浓缩蛋白，于-20℃冷冻保存。

所述缓冲液的组成为：10 mmol/L 的Tris-HCl、150 mmol/L NaCl、10 mmol/L EDTA、10 %体积的甘油、2 mmol/L DTT；所述洗液的组成为：1 % 体积的Triton-100、50 mmol/L Tris-HCl、100 mmol/L NaCl、10 mmol/L EDTA、2 mmol/L DTT；所述悬浮液的组成为：50 mmol/L Tris-HCl、100 mmol/L NaCl、10 mmol/L EDTA、2 mmol/L DTT。

所述变性剂的组成为：尿素8mol/L、NaCl 0.5mol/L、Tris-HCl 20mmol/L、EDTA 20mmol/L、SDS 2%；所述复性缓冲液的组成为：Tris-HCl 50mmol/L pH 8.0、NaCl 10mmol/L、EDTA 10 mmol/L、DTT 2mmol/L、氧化型谷胱甘肽1 mmol/L、还原型谷胱甘肽1 mmol/L、PMSF 0.5 mmol/L。

本发明的积极有益效果：

       1、联合检测，高效实用：本发明的试纸条首次利用原核表达的口蹄疫病毒结构蛋白和非结构蛋白作为检测线，达到了一步检测口蹄疫病毒感染抗体和疫苗免疫抗体的目的。其中结构蛋白抗体检测能够监控动物的免疫状态和抗体水平，非结构蛋白抗体检测技术为区分感染动物和免疫动物提供依据，结构蛋白和非结构蛋白检测技术的结合达到了一步检测FMDV免疫抗体水平以及区分FMDV感染动物和疫苗免疫动物的目的。因此本发明的试纸条检测效率高，具有重要的实际应用价值。

2、检测特异性强、敏感性高：本发明试纸条以胶体金标记的SPA为基础制备而成，金标SPA中的金颗粒与抗原或SPA分子之间无共价键形成，二者通过异性电荷间的范德华力相结合，胶体金对大肠杆菌表达系统表达并纯化的猪口蹄疫病毒结构蛋白VP1抗原和非结构蛋白3ABC抗原的特异性影响很小，也不影响SPA与抗体的结合及抗体与抗原的结合，且具有较高的标记率。因此，本发明的试纸条具有较高的特异性和敏感性，可检测到2纳克的相应抗体蛋白。

3、操作简便、快速：本发明的试纸条检测过程中无需附加其它仪器和试剂，只要将其测试端插入待检血清中30秒左右，等5分钟左右即可判定检测结果。

4、结果显示直观、准确：试纸条以显示棕红色的检测印迹和对照印迹作为检测的阳性和阴性标记，即在纤维素膜层上只显示一条棕红色对照印迹C，表示在被检血清中既无FMDV感染抗体也无FMDV疫苗免疫抗体，即被检动物无FMDV感染也无FMDV免疫或免疫不合格；若在纤维素膜层上显示一条棕红色对照印迹C和两条棕红色检测印迹P、J，则表示被检动物有FMDV感染；若在纤维素膜层上显示一条棕红色对照印迹C和一条棕红色检测印迹P，则表示在被检血清中含有FMDV疫苗免疫抗体；结果判定直观、准确、简单明了，不易出现假阴性和假阳性的误判。

5、生产系统可靠：本发明中的检测印迹采用大肠杆菌表达系统作为生产系统，该表达系统的研究较为深入，已经过反复验证，作为生产系统时培养条件简单、基因操作容易，从构建到产物纯化周期较短，成本低，产量高，适合于工业化应用。

6、投资少，成本低：使用本发明试纸条不需要另配其它仪器、设备和试剂，节省大量仪器、设备和附加试剂费用；一条试纸条一次可以检测一种或两种抗体，专业和非专业人士均可随时随地进行实时在线检测，无需支付专家诊断费及相关费用，可节省检测成本，降低检测费用。

7、应用范围广，便于推广：本发明的试纸条操作简单成“一步式”、“傻瓜式”，而且方便携带和保存，能满足不同层次人员的需要，包括专业化验、海关检疫、卫生防疫、质量监测、畜产品加工、集约化养殖到个体养殖等，具有广阔的市场前景和较好的经济、社会效益。

附图说明

图 1  本发明试纸条的结构示意图；

图 2  本发明试纸条的俯视结构示意图。

具体实施方式

以下实施例是为了进一步说明本发明，并不表示对本发明的限制。文中如没有特别说明，其中的百分含量均为质量百分含量。

要制备一步鉴别口蹄疫病毒感染和疫苗免疫动物的试纸条，先制备大肠杆菌表达系统表达并纯化的猪口蹄疫病毒结构蛋白VP1抗原和非结构蛋白3ABC抗原，以及抗SPA的IgG抗体，然后制备金标抗体纤维层、检测印迹和对照印迹。

1、羊抗或兔抗SPA的IgG抗体的制备：

以每公斤体重50微克SPA的用量，经皮下和肌肉注射阴性健康羊（或家兔）3～4次，末次免疫20天后静脉采血，以ELISA测定其血清抗体效价在1：2000以上，心脏采血或颈动脉放血，收集其高免血清。取1份血清加2份PBS液混匀，加等体积的饱和硫酸铵液混匀，置4℃冰箱内2小时，在4℃、10000转/分钟离心15分钟，弃上清液；以适量PBS液溶解沉淀，加饱和硫酸铵溶液至其最终浓度为33%，置4℃冰箱内2小时，在4℃、10000转/分钟条件下离心15分钟，弃上清液，以少量PBS液溶解沉淀，置4℃冰箱内用PBS液过夜透析，换液2～3次，在4℃、10000转/分钟离心15分钟，收集上清液，以紫外分光光度计测定其蛋白浓度。以饱和硫酸铵法提取的羊（或兔）抗SPA 的IgG抗体，用于制备对照印迹。

2、大肠杆菌表达并纯化的猪口蹄疫病毒结构蛋白VP1抗原和非结构蛋白3ABC抗原的制备：

（1）猪口蹄疫病毒结构蛋白VP1在大肠杆菌中的表达及纯化

根据O 型FMDV VP1模板基因序列设计一对特异性引物：上游引物为5’ATAGGATCCATGACCACTGCTACCGGGGAGTC3’引入酶切位点BamHI，下游引物为 5’ATAAAGCTTCAAGAGCTGCTTTGCGGGTG3’引入酶切位点HindIII。以含VP1 基因的重组质粒pMD18T-VP1为模板，经PCR 扩增获得VP1 基因。其中PCR反应体系为：模板pMD18T -VP1 0.5 微升，上游引物 0.8 微升，下游引物 0.8微升，Ex Taqase 预混酶25微升，双蒸水22.9微升。扩增程序：94 ℃预变性4分钟，循环一次；94℃变性45秒，60℃退火45秒，72℃延伸1分钟，共循环35次；72℃延伸10分钟。PCR 扩增所得的VP1 基因经BamHI 和HindIII 双酶切消化克隆到PET-28a 载体中，转化大肠杆菌菌株，将重组菌在含有氨苄青霉素的LB培养基（胰蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、氯化钠10g/L、氨苄青霉素mg/L）中培养至OD600 达到0.6 时，加入异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷诱导剂，使其终浓度为0.5mmol/L，37℃诱导表达6小时，将表达菌液离心，收获细菌沉淀。

将菌体重悬于20毫升缓冲液中（缓冲液成分：10 mmol/L Tris-HCl pH 8.0、150 mmol/L NaCl、10 mmol/L EDTA、10 % 甘油、2 mmol/L DTT、0.5 mmol/L PMSF）超声破碎后，离心收集沉淀，用洗液（洗液成分：1 %体积的Triton-100、50 mmol/L Tris-HCl pH 8.0、100 mmol/L NaCl、10 mmol/L EDTA、2 mmol/L DTT）洗涤包涵体5次；然后将沉淀于20毫升悬浮液中洗涤1次（悬浮液成分：50 mmol/L Tris-HCl pH 8.0、100 mmol/L NaCl、10 mmol/L EDTA、2 mmol/L DTT），最后离心沉淀即为纯化后的包涵体。

将纯化后的包涵体溶于pH为 8.0的变性剂中（变性剂成分：尿素8mol/L、NaCl 0.5mol/L、Tris-HCl 20mmol/L、 EDTA 20mmol/L、2% 的SDS），于4℃ 搅拌约10小时，溶解变性，离心去除不溶物，得到变性蛋白；将90毫升变性蛋白装入透析袋中，放入1.8升复性缓冲液（缓冲液成分：50mmol/L Tris-HCl pH 8.0、10mmol/L NaCl、10 mmol/L EDTA、2mmol/L DTT、1 mmol/L 氧化性谷胱甘肽、1 mmol/L 还原性谷胱甘肽、0.5 mmol/L PMSF）中，4℃下磁力搅拌透析，每5小时换液一次，换液4次后用1.8升 PBS透析4次，前两次12小时/次，后两次6小时/次。收集透析袋内液体，10000转/分钟、4℃ 离心10分钟，弃去沉淀，将上清液用0.45微米滤膜过滤；然后用20KD 浓缩管浓缩，3000转/分钟、4℃ 离心30分钟，收集浓缩蛋白，-20℃ 冻存，用于制备检测印迹。

（2）猪口蹄疫病毒非结构蛋白3ABC在大肠杆菌中的表达及纯化

将含3ABC基因的重组质粒pGEM-T-3ABC用SalI 和BglII 酶切消化，回收目的基因片段3ABC。用XholI和BglII对表达载体pTriEx-4Neo进行消化，使其产生两个与目的片段相同的粘性末端；用T4 DNA Ligase 连接两粘性末端，转化大肠杆菌菌株，将30微升重组菌接种到30毫升含有羧苄青霉素的LB培养基（胰蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、氯化钠10g/L、羧苄青霉素50mg/L) 中，37℃、250转/分钟摇至OD600达0.5；加入异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷诱导剂，使其终浓度为0.5mmol/L，于37℃诱导表达6小时，将表达菌液离心，收获细菌沉淀。

将菌体重悬于20毫升缓冲液中（缓冲液成分：10 mmol/L Tris-HCl pH 8.0、150 mmol/L NaCl、10 mmol/L EDTA、10 % 甘油、2 mmol/L DTT、0.5 mmol/L PMSF）超声破碎后，离心收集沉淀，用洗液洗涤包涵体5次（洗液成分：1 %体积的Triton-100、50 mmol/L Tris-HCl pH 8.0、100 mmol/L NaCl、10 mmol/L EDTA、2 mmol/L DTT）；然后将沉淀于20毫升悬浮液中洗涤1次（悬浮液成分：50 mmol/L Tris-HCl pH 8.0、100 mmol/L NaCl、10 mmol/L EDTA、2 mmol/L DTT），最后离心沉淀即为纯化后的包涵体。

将洗涤纯化后的包涵体溶于pH为 8.0的变性剂中（变性剂成分：尿素8mol/L、NaCl 0.5mol/L、Tris-HCl 20mmol/L、 EDTA 20mmol/L、2% SDS），于4℃ 搅拌约10小时，溶解变性，离心去除不溶物，得到变性蛋白；将90毫升变性蛋白装入透析袋中，放入1.8升复性缓冲液（缓冲液成分：50mmol/L Tris-HCl pH 8.0、10mmol/L NaCl、10 mmol/L EDTA、2mmol/L DTT、1 mmol/L 氧化性谷胱甘肽、1 mmol/L 还原性谷胱甘肽、0.5 mmol/L PMSF）中，4℃下磁力搅拌透析，每5小时换液一次，换液4次后用1.8升 PBS透析4次，前两次12小时/次，后两次6小时/次。收集透析袋内液体，10000转/分钟、4℃ 离心10分钟，弃去沉淀，将上清用0.45微米滤膜过滤；用20KD 浓缩管浓缩，3000转/分钟、4℃ 离心30分钟，收集浓缩蛋白，-20℃ 冻存，用于制备检测印迹。

3、金标SPA玻璃棉的制备：

以柠檬酸钠还原法制备金溶胶：在50～100毫升沸腾的0.01～0.05%氯金酸水溶液中加入2～4毫升0.5～2%的柠檬酸三钠溶液，获得直径15纳米左右的胶体金；以0.1mol/L的K₂CO₃调胶体金pH至8.5～9.5，以1:1000～1300的标记比将待标记的SPA加入pH8.5～9.5的金溶胶中，标记10分钟后加入20%的PEG10000至其最终浓度为0.05%，4℃、1500～3000转/分钟离心20分钟，除去未结合的胶体金颗粒，4℃、15000转/分钟离心1小时，弃上清液，获得胶体金标记的SPA；将1:100～500稀释的胶体金标记SPA吸附于精制玻璃棉中，4℃低温真空干燥，制备出金标SPA玻璃棉。

4、本发明试纸条的检测原理：

将试纸条测试端插入待测血清，待检血清通过虹吸带动待检抗体及金标SPA玻璃棉中的金标SPA一起向纤维素膜层扩散，最终渗入手柄端的吸水材料层，扩散过程中待检抗体与金标SPA相结合，该结合物进而与纤维素膜上的表达原检测印迹结合，从而显示出棕红色的检测印迹P和/或J；而羊（兔）抗SPA的IgG抗体可与金标SPA结合，形成棕红色对照印迹C。如果待检血清中没有FMDV病毒抗体和疫苗抗体，试纸条只显示一条棕红色对照印迹C；如果血清中含有抗FMDV病毒抗体和/或疫苗抗体，则分别与其金标SPA结合，再与纤维素膜上的相应抗原检测印迹P和/或J结合，显示棕红色检测印迹，为阳性标记；如果纤维素膜上没有任何棕红色印迹显示，则表明试纸条已失效或操作失误。

5、本发明试纸条的检测方法：

（1）检测样品的制备：无菌取被检动物的血液，并分离血清，以生理盐水作1: 200倍的稀释血清，得到待测样品。

（2）检测步骤：将试纸条测试端插入待检测血清中，插入深度不超过标记线，约30秒后取出试纸条，水平放置1～5分钟，观察检测结果。

（3）结果判断：如果在试纸条纤维素膜层上只显示一条棕红色对照印迹C，表示检测结果呈阴性，说明在被检血清中未检测出FMDV病毒抗体和FMDV疫苗抗体，即被检动物无FMDV病毒感染和FMDV疫苗免疫；如果试纸条上的纤维素膜层上出现棕红色的对照印迹C和检测印迹P，表示检测结果呈阳性，即在待检血清中检测出FMDV疫苗抗体，即被检动物已进行FMDV疫苗免疫；如果检测印迹P、J同时出现，表示在待检血清中检测出FMDV病毒感染抗体，即被检动物已感染或携带FMDV病毒；如果纤维素膜带上没有任何棕红色印迹显示，则表明试纸条已失效或操作有误。

以下实施例用于进一步说明本发明试纸条的结构。

实施例一：一步鉴别口蹄疫病毒感染和疫苗免疫动物的试纸条，参见图1、图2，图中支撑层1用硬质塑胶薄片条制成，样品吸附纤维层2用玻璃棉制成，金标抗体纤维层3用吸附有胶体金标记SPA的玻璃棉制成，纤维素膜层4采用硝酸纤维素膜制成，吸水材料层5用吸水滤纸制成；将样品吸附纤维层2、金标抗体纤维层3、纤维素膜层4、吸水材料层5从左端（测试端）至右依次粘贴在支撑层1的硬质塑胶薄片条上，彼此之间交界处的纤维互相交叉渗透；纤维素膜层4上有用大肠杆菌表达系统表达并纯化的猪口蹄疫病毒结构蛋白VP1和非结构蛋白3ABC两种抗原液印制的检测印迹分别为6-P和6-J，7为用羊（或兔）抗SPA的IgG溶液印制的对照印迹，检测印迹、对照印迹形成的组合印迹带为“｜｜｜”。

8-1为覆盖在样品吸附纤维层2和金标抗体纤维层3上面的白色保护膜，在两层交界处对应保护膜8-1位置上偏向于样品吸附纤维层2一侧0.5cm处印有标记线9，标记线9的右端印有箭头及max字样，吸水材料层5（手柄端）上覆盖有其它颜色（如黄色）的保护膜8-2。

实施例二：试纸条结构与实施例一基本相同，不同之处在于：

金标抗体纤维层3用吸附有胶体金标记SPA的玻璃棉制成，用大肠杆菌表达系统表达并纯化的猪口蹄疫病毒结构蛋白VP1抗原液印制的检测印迹6-P，用羊（兔）抗SPA的IgG溶液印制的对照印迹C，两种印迹排列形成的组合印迹带7为“｜｜”。

实施例三：试纸条结构与实施例二基本相同，不同之处在于：

金标抗体纤维层3用吸附有胶体金标记SPA的玻璃棉制成，用大肠杆菌表达系统表达并纯化的猪口蹄疫病毒非结构蛋白3ABC抗原液印制的检测印迹6-J，7为用羊（兔）抗SPA的IgG溶液印制的对照印迹，检测印迹和对照印迹组合排列为“● ●”。

实施例四：试纸条结构与实施例一基本相同，不同之处在于：

支撑层1采用不吸水的硬纸条制成，样品吸附纤维层2采用尼龙纤维制成，纤维素膜层4采用纤维素膜制成，检测印迹和对照印迹平行排列组合为“＼＼＼”。

实施例五：试纸条结构与实施例一基本相同，不同之处在于：

支撑层1采用不吸水的硬纸条制成，样品吸附纤维层2采用聚酯纤维制成，纤维素膜层4采用羧甲基纤维素膜制成，检测印迹和对照印迹平行排列组合为“ ●●●”。 

实施例六：试纸条结构与实施例一基本相同，不同之处在于：

支撑层1采用不吸水的硬纸条制成，样品吸附纤维层2采用尼龙纤维膜制成，纤维素膜层4采用聚偏二氟乙烯（PVDF）纤维素膜制成。 

实施例七：试纸条结构与实施例一基本相同，不同之处在于：

支撑层1采用不吸水的硬纸条制成，样品吸附纤维层2采用尼龙纤维制成，纤维素膜层4采用纤维素膜制成，检测印迹和对照印迹平行排列组合为“/ / /”。 

实施例八：试纸条结构与实施例一基本相同，不同之处在于：

支撑层1采用不吸水的硬纸条制成，样品吸附纤维层2采用聚酯纤维素制成，纤维素膜层4采用羧甲基纤维素膜制成，检测印迹和对照印迹平行排列组合为“十十十”。 

实施例九：试纸条结构与实施例一基本相同，不同之处在于：

支撑层1采用不吸水的硬纸条制成，样品吸附纤维层2采用聚酯纤维素制成，纤维素膜层4采用聚偏二氟乙烯纤维素膜制成，检测印迹和对照印迹平行排列组合为“┬ ┬ ┬”。 

实施例十：试纸条结构与实施例一基本相同，不同之处在于：

支撑层1采用不吸水的硬纸条制成，样品吸附纤维层2采用聚酯纤维素膜制成，纤维素膜层4采用纤维素膜制成，检测印迹和对照印迹平行排列组合为“├├├”或“┤┤┤”。

实施例十一：本发明试纸条的敏感性和特异性试验

敏感性：取O型 FMDV多肽疫苗和灭活疫苗免疫后第30天的猪血清各1份，分别做1:200、1:400、1:800、1:1600、1:3200、1:6400、1:12800、1:25600、1:51200、1:102400 倍稀释，共10 个稀释度，取每个稀释度的血清150μl，用实施例一的试纸条测定，5分钟后测定结果，用 TSR3000 读条仪读值，评价试纸条的敏感性。结果表明，试纸条对O 型FMDV 多肽疫苗和多肽苗免疫后第30天猪血清的灵敏度均可达到1:12800。

特异性：该试纸条与猪瘟、猪乙型脑、猪蓝耳病、猪伪狂犬病、猪圆环等抗体阳性血清均无交叉反应，特异性为100%。

Claims (10)

1.一步鉴别口蹄疫病毒感染和疫苗免疫动物的试纸条，含有支撑层和吸附层，吸附层附着在支撑层上，吸附层从测试端依次为样品吸附纤维层、金标抗体纤维层、纤维素膜层和手柄端的吸水材料层，在纤维素膜层上设有检测印迹和对照印迹，其特征是：所述金标抗体纤维层上吸附有胶体金标记的葡萄球菌蛋白A即SPA，所述检测印迹用大肠杆菌表达系统表达并纯化的猪口蹄疫病毒结构蛋白VP1抗原和非结构蛋白3ABC抗原中的一种或两种印制，对照印迹用羊或兔抗SPA的IgG抗体印制。

2.根据权利要求1所述的试纸条，其特征是：所述支撑层用不吸水的硬质塑胶条或硬纸条制成；样品吸附纤维层用玻璃棉、尼龙纤维或聚酯纤维制成；金标抗体纤维层用玻璃棉制成。

3.根据权利要求1所述的试纸条，其特征是：所述纤维素膜层用硝酸纤维素膜、纤维素膜、羧甲基纤维素膜或聚偏二氟乙烯PVDF纤维素膜制成；所述吸水材料层用吸水纸制成。

4.根据权利要求1所述的试纸条，其特征是：所述纤维素膜层上含有一条/个检测印迹时，检测印迹、对照印迹的排列形式为“｜｜”、“十十”、“┬ ┬”、“┴ ┴”、“├├”、“┤┤”和“● ●”中的任一种；纤维素膜层上含有两条/个检测印迹时，检测印迹、对照印迹的排列形式为“｜｜｜”、“十十十”、“┬ ┬ ┬”、“┴ ┴ ┴”、“├├├”、“┤┤┤”和“● ● ●”中的任一种。

5.根据权利要求1～4任一项所述的试纸条，其特征是：在所述样品吸附纤维层、金标抗体纤维层及吸水材料层上覆盖有保护膜，在样品吸附纤维层与金标抗体纤维层交界处对应的保护膜上印制有样品标记线。

6.权利要求1所述试纸条的制备方法，其特征是：该方法包括以下步骤：

（1）大肠杆菌表达并纯化的猪口蹄疫病毒结构蛋白VP1抗原和非结构蛋白3ABC抗原的制备；

（2）胶体金标记的葡萄球菌蛋白A的制备：以柠檬酸钠还原法制备胶体金，进而获得胶体金标记的SPA；

（3）羊抗或兔抗SPA的IgG抗体的制备：

用所得的大肠杆菌表达并纯化的猪口蹄疫病毒结构蛋白VP1抗原和非结构蛋白3ABC抗原中的一种或两种分别在纤维素膜层上制成检测印迹，用羊抗或兔抗小鼠IgG抗体在纤维素膜层上制成对照印迹；将胶体金标记的葡萄球菌蛋白A用于制备金标抗体纤维层，然后将支撑层、吸附层和保护层依次组装成试纸条。

7.根据权利要求6所述试纸条的制备方法，其特征是：其中大肠杆菌表达并纯化的猪口蹄疫病毒结构蛋白VP1抗原的制备方法如下：

根据O 型FMDV VP1模板基因序列设计一对特异性引物：上游引物5’ATAGGATCCA

TGACCACTGCTACCGGGGAGTC3’ 引入酶切位点BamHI，下游引物5’ATAAAGCTTCAAGAGCTGCTTTGCGGGTG3’引入酶切位点HindIII；以重组质粒pMD18T-VP1 为模板，进行PCR 扩增，获得VP1 基因；PCR 产物经BamHI 和HindIII 双酶切消化克隆到PET-28a 载体中，转化大肠杆菌，将重组菌在LB培养基中培养至OD600 达到0.6 时，加入异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷诱导剂，使其浓度为0.5mmol/L，在37℃诱导表达6小时，将表达菌液离心，收获细菌沉淀；

将得到的菌体重悬于20毫升缓冲液中，超声破碎后离心收集沉淀，用洗液洗涤包涵体5次，将沉淀悬于20毫升悬浮液中洗涤1次，最后离心沉淀得到纯化后的包涵体；将纯化后的包涵体溶于pH为 8.0的变性剂中，于4℃搅拌10小时，离心去除不溶物，得到变性蛋白；取90毫升变性蛋白装入透析袋，并将透析袋放入1.8升复性缓冲液中，4℃条件下搅拌透析，每5小时换液一次，换液4次后用1.8升 PBS透析4次，前两次透析12小时/次，后两次透析6小时/次；收集透析袋内的液体，经10000转/分钟、4℃ 离心10分钟，弃去沉淀，将上清用0.45微米滤膜过滤；用20KD 的浓缩管浓缩，3000转/分钟、4℃离心30分钟，收集浓缩蛋白，于-20℃冷冻保存。

8.根据权利要求6所述试纸条的制备方法，其特征是：大肠杆菌表达并纯化的猪口蹄疫病毒非结构蛋白3ABC抗原的制备方法如下：

将重组质粒pGEM-T-3ABC 用SalI 和BglII 酶切消化，回收目的片段3ABC；用XholI和BglII对表达载体pTriEx-4Neo进行消化，用T4 DNA Ligase 连接后，转化大肠杆菌菌株，得到重组菌，将重组菌接种到LB培养液中，37℃、250 r/ min 摇至OD600达0.5；加入异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷诱导剂，使其浓度为0.5mmol/L，37℃诱导表达6小时，将表达菌液离心，收获细菌沉淀；

将得到的菌体重悬于20毫升缓冲液中，超声破碎后离心收集沉淀，用洗液洗涤包涵体5次，将沉淀悬于20毫升悬浮液中洗涤1次，最后离心沉淀得到纯化后的包涵体；将纯化后的包涵体溶于pH为 8.0的变性剂中，于4℃搅拌10小时，离心去除不溶物，得到变性蛋白；取90毫升变性蛋白装入透析袋，并将透析袋放入1.8升复性缓冲液中，4℃条件下搅拌透析，每5小时换液一次，换液4次后，用1.8升 PBS透析4次，前两次透析12小时/次，后两次透析6小时/次；收集透析袋内的液体，经10000转/分钟、4℃ 离心10分钟，弃去沉淀，将上清用0.45微米滤膜过滤；用20KD 的浓缩管浓缩，3000转/分钟、4℃离心30分钟，收集浓缩蛋白，于-20℃冷冻保存。

9.根据权利要求7或8所述试纸条的制备方法，其特征是：所述缓冲液的组成为：10 mmol/L 的Tris-HCl、150 mmol/L NaCl、10 mmol/L EDTA、10 %体积的甘油、2 mmol/L DTT；所述洗液的组成为：1 % 体积的Triton-100、50 mmol/L Tris-HCl、100 mmol/L NaCl、10 mmol/L EDTA、2 mmol/L DTT；所述悬浮液的组成为：50 mmol/L Tris-HCl、100 mmol/L NaCl、10 mmol/L EDTA、2 mmol/L DTT。

10.根据权利要求7或8所述试纸条的制备方法，其特征是：所述变性剂的组成为：尿素8mol/L、NaCl 0.5mol/L、Tris-HCl 20mmol/L、EDTA 20mmol/L、SDS 2%；所述复性缓冲液的组成为：Tris-HCl 50mmol/L pH 8.0、NaCl 10mmol/L、EDTA 10 mmol/L、DTT 2mmol/L、氧化型谷胱甘肽1 mmol/L、还原型谷胱甘肽1 mmol/L、PMSF 0.5 mmol/L。

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