CN112334478A - 用于快速甲型流感诊断测试的抗体对 - Google Patents

Abstract

用于甲型流感诊断测试的新抗体对。

Description

用于快速甲型流感诊断测试的抗体对

发明概述

本发明涉及单克隆抗体(mAb)种类的新选择，其提供了用于检测生物学样品中的人甲型流感的高度灵敏性免疫层析测定法(以下称为“免疫测定法”)。当在“三明治型”侧向流免疫测定法(LFIA)中作为检测和捕捉试剂配对使用时，所述mAb种类是特别有用的，例如在所谓的“快速流感诊断测试”(RIDT)(也称为“接近患者”或“护理点”测试(POCT)或“浸渍片”，参见WHO论文，“Use of Influenza Rapid Diagnostic Tests”(2010))中通常使用。

本发明的新mAb选择，在本文中也称为“抗体(或mAb)对”或“匹配的抗体对”选自对病毒核蛋白(NP)(也称为核壳蛋白或蛋白N)具有结合亲和力的种类，所述病毒核蛋白是一种跨甲型流感的高度保守的蛋白，其可用于区分甲型和乙型流感，并且已成为上市RIDT的常见靶标(WHO，2010，第11页)。

尽管当前可用的RIDT对季节性流感，即针对感染上呼吸道的呼吸道病毒和细菌具有特异性(中位数90–95％)，但是与RT-PCR或病毒培养相比灵敏性却高度可变(即10-96％)。低灵敏性产生假阴性结果的严重风险。

我们已经鉴定出某些匹配的抗体对，用作“三明治型”免疫测定法的试剂，令人惊讶地，它们提供了每毫升样品低至约10纳克病毒蛋白的活病毒检测限(LOD)，据我们至今所知大大改善可用RIDT的灵敏性。

仅使用特定匹配的抗体对分别作为检测抗体和捕捉抗体就实现此种非常低的LOD，并且基于单独的个别抗体的结合亲和力尚不能进行预测。

此外，出乎意料的是，如本发明所要求的，可以用结合NP的相邻或甚至相同抗原性表位的抗体对实现如此高的灵敏性。

事后看来，根据本发明的知识，尽管无意于被束缚，但可以假设，通常预期会抑制此类抗体对与单体形式的NP的同时结合的位阻可被在某些条件下形成暴露额外的抗体结合位点的多价复合物的NP寡聚体形成抵消。

本发明的匹配的抗体对表现出的高灵敏性特别有利于即使在低病毒滴度的生物流体中也易于检测病毒，所述生物流体例如可以由消费者相对无创地自我采样，例如通过擦拭粘膜液诸如鼻液或唾液。

因此，本发明一般涉及：用于检测样品(特别是包含活病毒的生物样品)中存在的甲型流感的匹配抗体对；和包含所述匹配的抗体对作为检测和捕捉试剂的免疫测定法，尤其是三明治型的免疫测定法，最优选三明治型的LFIA。

一方面，本发明包括匹配的抗体对，其用作LFIA中的相应检测和捕捉抗体，以检测样品中存在的甲型流感的核蛋白(NP)抗原，其中所述匹配的抗体对的抗体独立地能够结合包含全长甲型流感核蛋白的连续位置氨基酸1-60的区域中的NP表位，如SEQ.ID.No:1所示。

在另一方面，本发明还包含三元复合物作为新型物质组合物，其在三明治型LFIA的运行中产生，所述三元复合物包含：

(a)甲型流感核蛋白

(b)与可检测信号缀合或以其他方式关联的至少一种“检测抗体”；和

(c)至少一种任选地固定化在基底上的“捕捉抗体”，

其中(b)和(c)独立能够结合包含甲型流感核蛋白的氨基酸1-60的区域中(a)的表位，从而形成所述三元复合物。

本发明还包含含有免疫层析材料的基底，所述免疫层析材料上具有通过其捕捉抗体(c)固定化的上述三元复合物。

本发明进一步包括用于检测样品中甲型流感的核蛋白(NP)的侧向流免疫测定法，其包含：

(a)流动相，其包含与可检测信号缀合或以其他方式关联的检测抗体，所述检测抗体能够结合NP以形成二元复合物；和

(b)固定相，其包含含有免疫层析材料的基底，所述免疫层析材料上固定化有捕捉抗体，所述捕捉抗体能够结合所述二元复合物的所述NP以形成三元复合物，由此由所述三元复合物产生的可检测信号指示所述样品中NP的存在；

所述捕捉和检测抗体能够结合包含甲型流感核蛋白的氨基酸1-60的区域中的NP表位。

本发明进一步包括使用包含流动相和固定相的侧向流免疫测定法检测样品中的甲型流感的方法，所述方法包括

(a)将所述样品引入所述测定法的所述流动相，

(b)使所述样品中的甲型流感核蛋白(NP)与检测抗体接触以在所述流动相中形成包含所述检测抗体和NP的二元复合物，所述检测抗体与可检测信号缀合或以其他方式关联，并且

(c)使所述流动相与包含上面固定化有捕捉抗体的免疫层析材料的固定支持物接触，所述捕捉抗体能够结合所述二元复合物的所述NP以形成三元复合物，由此由所述三元复合物产生的可检测信号复杂指示样品中NP的存在，

其中所述捕捉抗体和所述检测抗体独立能够结合包含甲型流感核蛋白的氨基酸1-60限定的区域中的NP表位。

在本发明的各种实施方案中，本发明的抗体对的每个检测和捕捉抗体独立地能够结合甲型流感核蛋白的相同或不同表位。在一个实施方案中，所述捕捉和检测抗体能够结合NP表位，所述NP表位在每种情况下独立地选自本文的SEQ.ID.NO:2和3。在一个优选的实施方案中，抗体的至少一种能够结合包含所述SEQ ID NO:2的表位。在另一个实施方案中，捕捉抗体和检测抗体均能够结合包含SEQ ID NO:2的表位。在又一个实施方案中，捕捉和检测抗体中的至少一种(例如，检测抗体)能够结合包含SEQ ID NO:3的表位；例如，一方面，捕捉抗体和检测抗体均能够结合包含SEQ ID NO:3的表位。

另外，本发明考虑了用于诊断患有甲型流感的患者的方法(或由消费者进行自我诊断的方法)，该方法包括在根据本发明的侧向流免疫测定法中测试从患者或消费者获得的生物学样品，并确定甲型流感核蛋白的存在，所述核蛋白的存在指示甲型流感感染；以及监测患者中的甲型流感的治疗性处理的效力的方法，其通过在所述测定法中测试来自患者的生物样品并测定在治疗甲型流感的药物活性剂施用之前和之后甲型流感核蛋白的存在或缺乏。

此外，本发明包括用于在哺乳动物尤其是人受试者中快速测试甲型流感感染的医疗装置或试剂盒，其在壳体中包含本发明的LFIA，任选地还包含观察口和/或阅读器装置和/或使用试剂盒的说明书。

发明背景

流感是由正粘病毒科(Orthomyxoviridae)的“甲型”、“乙型”和“丙型”属引起的高度传染性流行性至大流行性急性病毒性呼吸道疾病。甲型流感和乙型流感病毒是最常与人疾病相关的两个属。

在人类中，甲型和乙型流感病毒导致季节性流行病，在温带地区出现冬季高峰，在热带地区终年传播。两种病毒均通过突变持续进化，所述突变导致某些糖蛋白的抗原性漂移。甲型流感也可以通过允许出现新型甲型流感的其他机制进化。如果新病毒以持续的方式在高度易感人群中传播，则这些可以潜在导致罕见的流感大流行。

单纯性季节性流感(uncomplicated seasonal influenza)与1-4天的潜伏期有关，随后是症状和体征的急性发作，包括发烧≥38℃，肌痛，头痛，咽喉痛和长时间咳嗽。流感的临床表现可以从无症状感染变化到致命性肺炎。儿童可以出现胃肠道症状，而老年人的流感可以表现为嗜睡而没有升高的温度。

在成年人中，病毒复制和可能的传染性(communicability)在疾病的前3-5天最大。对于年幼的儿童和免疫受损的人，它可以是更长的(例如，前者中为7-10天，并且后者中为数周至数月)。儿科人群的流感感染率往往最高，而老年人患流感疾病的严重并发症更为常见。

流感与其他呼吸道病原体共同传播；因此，区分流感与其他呼吸道疾病是重要的。早期的流感检测和诊断可以促进更及时地施用抗病毒药物，它们通常在出现症状的48小时内施用时具有临床益处。由于并非所有抗病毒药都对甲型和乙型流感两者有效，因此重要的是，诊断测试能够区分两者。

流感病毒是包膜的、负义的(与mRNA序列互补)单链RNA病毒，具有分段的基因组，其含有基因组病毒RNA(vRNA)的八个区段，编码多达13种蛋白质。

编码的蛋白质包括聚合酶碱性蛋白2(PB2)、聚合酶碱性蛋白1(PB1)、PB1-F2、聚合酶酸性蛋白(PA)、血凝素(HA)、核蛋白(NP)、神经氨酸酶(NA)、基质蛋白(M1)、离子通道蛋白(M2)、非结构蛋白1(NS1)和核输出蛋白/非结构蛋白2(NEP/NS2)。

在流感病毒中高度保守的核蛋白(NP)是一种涉及流感病毒复制的许多阶段的多功能蛋白。它是在病毒核糖核蛋白(vRNP)复合物中发现的主要病毒蛋白，其中RNA被核蛋白(NP)包裹，并与聚合酶复合物相关。NP可以形成同寡聚物，其与三聚体聚合酶一起包裹基因组RNA，为vRNP增加高级结构，参见Sherry,L.et al.,J Virol.2014Nov；88(21):12326–12338。

在感染的早期，一旦从进入的病毒颗粒中释放出来，vRNP在NP的核定位序列(NLS)参与下转运到宿主细胞的核中。在感染的后期，NP主要以新合成的vRNP的形式存在于细胞质中，被包装到后代病毒颗粒中。

尽管甲型和乙型流感病毒属于正粘病毒科的独立属，但它们的NP蛋白通常共享相对较高水平的序列保守。但是，甲型流感病毒的NP含有至少两个表现出核定位信号(NLS)活性的区域，该区域是乙型流感病毒NP缺乏的；并且乙型流感病毒的NP含有进化上保守的N端的50个氨基酸延伸，其是甲型流感病毒的NP缺乏的，该延伸似乎也参与核定位等功能。还已经提出，所有能够充当NLS的序列都位于乙型流感NP的前80个氨基酸内，参见Sherry,L.etal.,J Virol.2014，id。

已经充分研究了甲型流感的核蛋白，参见例如Chenavas et al.,FutureMicrobiology,Vol.8,No.12,2013年11月22日在先发表于https://doi.org/10.2217/fmb.13.128；并且各种甲型流感病毒株的核蛋白的序列已登录于例如UniProt登录号P03466。

在结构上，NP由头域和构成尾环/接头区域的体域组成。已知NP的RNA结合性质涉及均具有高度一级序列保守性的头域和体域之间的突出元件和柔性基本环。

已观察到甲型或乙型流感NP的单体形式和多聚体形式(例如，二聚体、三聚体和四聚体)两者，这取决于例如盐浓度和与NP结合的RNA分子的大小，参见Labaronne,A.et al.,Viruses 2016,8,247。

NP寡聚化由一个NP分子的非多态性且结构保守的尾环插入另一个NP的沟来介导的。

甲型流感根据病毒表面上的两种蛋白质分为两种亚型：血凝素(H)和神经氨酸酶(N)。有18种不同的血凝素亚型和11种不同的神经氨酸酶亚型。(分别为H1至H18和N1至N11。)甲型流感可以进一步分解为不同的病毒株。在人类中发现的当前甲型流感亚型是甲型流感(H1N1)和甲型流感(H3N2)病毒。

使用实验室方法，例如细胞培养中的病毒分离或通过逆转录酶-聚合酶链式反应(RT-PCR)检测病毒RNA，已经以高度特异性进行人类流感病毒感染的鉴定。RT-PCR测定法检测活病毒和非活流感病毒RNA两者，并且通常比细胞培养更灵敏。然而，RT-PCR方法在许多地理区域中不可得，或者在大流行期间其能力可能不足，而且不适合消费者使用。

2009年出现的甲型流感(H1N1)大流行明显表明需要“护理点”流感诊断测试，该测试可以由治疗受累患者群体的当地医务人员使用，以帮助进行病例管理和暴发控制并允许对疾病传播和病毒进化监测。在消费者中，对于检测和诊断流感病毒的快速、相对廉价但高度灵敏的家用试剂盒也存在未满足的需求。

内科医生诊所和临床广泛使用的RIDT通常是直接抗原检测测试，通常通过比色、荧光或化学发光信号指示一种或多种病毒抗原的存在。术语“快速”通常表示在约30分钟或更短，甚至15分钟或更短内，例如在约10分钟内，或甚至在约5分钟内产生结果的能力。因此，RIDT可以在临床相关的时间范围内提供结果，以补充使用治疗和化学预防流感的抗病毒药物。

在RIDT(与实验室微量滴定板测定法区分)中，抗体和分析物通常与多孔膜结合，所述多孔膜与阳性样品发生反应，而将多余的液体引导至膜的非反应性部分。

RIDT最常配置为一次性LFIA，也称为“测试条”。LFIA包含固定基底，通常是免疫层析测试条，包含生物样品的流动相通过毛细管作用通过所述固定基底流动到反应基质，其中在测试条上产生可检测的信号，例如颜色变化或颜色差异以指示靶标分析物的存在(或缺乏)。术语“毛细作用”或“毛细管作用”是指由于诸如表面张力和分子之间的吸引力的特性而将分子拉过测试条的过程。通常，测试条包含各种区域，在所述区域上放置通常为抗体的试剂。

如本文所用，术语“侧向流”是指沿水平方向通过材料的毛细管流动，但是应理解为适用于从液体施加点到另一侧向位置的液体流动，即使例如装置是垂直的或倾斜的。侧向流取决于液体/基底相互作用的性质(表面润湿或芯吸作用)，并且不需要施加外力，例如使用者施加真空或压力。

在抗体“三明治型”LFIA形式中，流动相通常包含样品、液体稀释剂和检测抗体-信号缀合物，而固定相通常包含固定化在测试线和对照线上的捕捉抗体，检测抗体和捕捉抗体两者对分析物具有特异性。

在一种示例性的测试形式中，将液体生物样品吸附到样品垫上，并且样品通过毛细作用前进到缀合物垫中，在此它使用可检测部分，例如有色标签标记的检测抗体颗粒再水化，从而允许混合这些颗粒与吸附的液体样品。标记的抗体与样品中包含的特定分析物相互作用，从而启动分子间相互作用，这取决于试剂的亲和力和亲合力。然后，标记的抗体与其特异性分析物的二元复合物沿着条向固定化在反应区(通常在与样品流横切，优选垂直的线中形成横跨条的“测试线”)中的捕捉抗体迁移，所述捕捉抗体识别并捕捉复合物，然后其被固定化并产生明显的信号，例如为有色线的形式。该技术可用于获得定量或半定量结果。多余的试剂移过一条或多条捕捉线到任选的对照线，该对照线包含阳性对照，其确保所有试剂是功能性的；最后，将多余的试剂俘获在芯吸垫中，该芯吸垫经设计以通过毛细管作用将生物样品吸过膜，从而维持沿层析条的侧向流。

在有时被称为“浸渍片”或“半条”的另一种示例性形式中，在将标记的抗体和生物样品的溶液或悬浮液在一定条件下组合以形成标记的抗体与分析物的二元复合物，然后应用于浸渍片。将层析条“浸入”或以其他方式接触液体，以便如上所述将标记的抗体和靶标分析物的复合物拉过条，朝向测试线处的捕捉抗体。

三明治型的侧向流测定法的实例描述于例如WO17127833；WO13132347；美国专利申请2017/233460；2011/0008910和2012/0178105，均以引用方式并入。

在本发明优选的直接测定形式中，测试线的颜色强度与样品中分析物的浓度成比例。因此，当分析物浓度降至LOD之下或没有分析物时，将看不到测试线。LFIA通常还具有对照线，指示通过条的正确液体流动，无论是否存在分析物，其都会出现。因此，在典型的直接测定形式中，膜上的两条可见线是阳性结果，而对照区中的一条线是阴性结果。

使用本发明的抗体对的LFIA还可以任选地包含固定化到基底的免疫层析材料的另外的试剂，该试剂能够区分上述的二元复合物和任何保持游离的检测抗体信号。在一个实施方案中，另外的试剂具有与分析物，例如分析物分子或其衍生物或片段(即类似物)共同的至少一个表位，使得它能够特异性结合游离(即未复合)的检测抗体。或者，固定化的分子不是分析物分子或其类似物，但仍然能够优先结合未复合的检测抗体。例如，试剂可以是二抗，例如兔抗小鼠IgG F(ab’)2，其已经针对Fc片段吸附，因此仅与IgG的Fab部分反应。因此，当不存在分析物时，第二抗体能够结合抗-NP IgG1或IgG2单克隆抗体的游离“Fab”结合域。但是，当分析物存在于测试样品中时，它首先与抗-NP IgG1或IgG2单克隆抗体的“Fab”结合域复合。分析物的存在使得“Fab”结合域不可用于随后与另外的试剂的结合。

通过以阵列形式提供对此类分析物具有特异性的固定化抗体的其他测试线，可以在相同条件下同时测试多种分析物。相反，可以将加载有相同抗体的多条测试线用于半定量测定。

由以不同强度出现的线表示的读数可以优选地通过肉眼或使用阅读器装置来评估。

通常通过RANN评分进行分析物的目测验证和定量，所述RANN评分是与记分卡相关的基于比色强度的标准视觉评分系统，所述记分卡通常由五行定义的强度组成，范围为非常微弱到非常强烈。例如，对于基本测定参数分析，可以使用50个单位的条阅读器值(RANN2)来测定测试线的阈值，并且可以使用少于100个单位的条阅读器值(RANN 2-3)来表示对照线的阈值。

检测抗体-信号缀合物的“信号”成分可以选自例如发光化合物(例如，荧光，磷光等)；磁性颗粒；放射性化合物；和视觉化合物(例如有色染料或金属物质，例如金)；等等。合适的视觉可检测物质由例如Jou等人的美国专利No.5,670,381和Tarcha等人的美国专利No.5,252,459描述，它们通过引用并入本文。发光、放射性和磁性标记的颗粒将需要使用电子阅读器来评估测试结果。

如本领域中公知的，信号成分可以单独使用或与天然(例如，乳胶)或合成的颗粒(有时称为“珠”或“微珠”)结合使用。尽管本发明中可以使用任何合成颗粒，但是颗粒通常由聚苯乙烯、丁二烯苯乙烯、苯乙烯丙烯酸-乙烯基三元共聚物、聚甲基丙烯酸甲酯)、聚甲基丙烯酸乙酯、苯乙烯-马来酸酐共聚物、聚乙酸乙烯酯、聚乙烯吡啶、聚二乙烯基苯、聚对苯二甲酸丁二酯、丙烯腈、氯乙烯-丙烯酸酯等，或其醛、羧基、氨基、羟基或酰肼衍生物。

颗粒的大小可以变化。颗粒的平均大小(例如，直径)可以在约0.1纳米至约100微米的范围内，在一些实施方案中，在约1纳米至约10微米的范围内，并且在一些实施方案中，在约2至约250纳米的范围内。

有色的胶体颗粒，例如金(红色)、碳(黑色)、二氧化硅(蓝色)或乳胶(蓝色)是优选的。最常用的是乳胶或纳米大小的金颗粒。实际上，直径为25-80nm的胶体金颗粒或金纳米簇是优选的。合适的合成颗粒的可商购实例包括由BBI Solutions OEM Ltd.提供的40nm金胶体。

在检测抗体-信号部分缀合物的制备中，可以使用多种公知技术中的任一种将抗体与信号缀合。例如，信号颗粒与抗体的共价附接可以使用羧基、氨基、醛、溴乙酰基、碘乙酰基、硫醇基、环氧基和其他反应性或连接性官能团以及残留的自由基和自由基阳离子(可以通过它们完成蛋白质偶联反应)完成。表面官能团也可以作为官能化的共聚单体掺入，因为信号粒子的表面可以含有极性基团的相对高的表面浓度。

另外，尽管信号颗粒通常在合成后被官能化，例如用聚(苯硫酚)，但是信号颗粒可以能够与蛋白质直接共价连接，而无需进一步修饰。

在一个合适的实施方案中，缀合的第一步是使用碳二亚胺活化探针表面上的羧基。在第二步中，使活化的羧酸基团与抗体的氨基反应以形成酰胺键。活化和/或抗体偶联可以发生在缓冲液，例如磷酸盐缓冲盐水(PBS)(例如，pH7.2)或2-(N-吗啉代)乙磺酸(MES)(例如，pH 5.3)中。然后，可以使所得信号颗粒与乙醇胺接触，例如以阻断任何剩余的活化位点。总的来说，该过程形成缀合的检测探针，其中抗体与信号共价附接。除共价键键合外，还可以使用其他附着技术，例如物理吸附。用于优选的胶乳和金颗粒两者的有利方法是化学物理吸附。

LFIA的免疫层析材料通常包含多孔膜，该多孔膜可由流动相能够迁移通过的多种材料中的任一种制成。用于形成多孔膜的材料可以包括但不限于天然的、合成的或经过合成修饰的天然存在的材料，例如多糖(例如纤维素材料，例如纸和纤维素衍生物，例如醋酸纤维素和硝化纤维素)；聚醚砜；聚乙烯；尼龙；聚偏二氟乙烯(PVDF)；聚酯；聚丙烯；二氧化硅；无机材料，例如灭活的氧化铝、硅藻土、MgSO₄或其他均匀分散在多孔聚合物基质中的无机细碎材料，以及聚合物，诸如氯乙烯、氯乙烯-丙烯共聚物和氯乙烯-乙酸乙烯酯共聚物；布，天然存在的(例如棉)和合成的(例如尼龙或人造丝)；多孔凝胶，例如硅胶、琼脂糖、葡聚糖和明胶；聚合物薄膜，例如聚丙烯酰胺。

反应区优选由硝化纤维素和/或聚醚砜材料形成。术语“硝化纤维素”是指纤维素的硝酸酯，其可以为单独的硝化纤维素，或硝酸与其他酸例如具有1至7个碳原子的脂肪族羧酸的混合酯。为了本发明的目的，硝化纤维素的孔径通常为约5至约15μm。

如本领域技术人员容易认识到的，多孔膜的大小和形状通常可以变化。例如，多孔膜条的长度可以为约10至约100毫米，在一些实施方案中为约20至约80毫米，并且在一些实施方案中为约40至约60毫米。膜条的宽度也可以在约0.5至约20毫米的范围内，在一些实施方案中在约1至约15毫米的范围内，并且在一些实施方案中，在约2至约10毫米的范围内。同样，膜条的厚度通常足够小以允许基于透射的检测。例如，膜条的厚度可以小于约500微米，在一些实施方案中小于约250微米，在一些实施方案中小于约150微米。

用于多孔膜的支持基底可以直接与多孔膜相邻定位，或者可以在多孔膜和支持物之间定位一个或多个中间层。无论如何，支持物通常可由能够携带多孔膜的任何材料形成。支持物可以由透光的材料形成，例如透明或光学扩散(例如半透明)的材料。此外，通常期望支持物是液体不可渗透的，以使流过膜的流体不漏过支持物。用于支持物的合适材料的实例包括但不限于玻璃；聚合材料，例如聚苯乙烯、聚丙烯、聚酯(例如

膜)、聚丁二烯、聚氯乙烯、聚酰胺、聚碳酸酯、环氧化物、甲基丙烯酸酯和聚三聚氰胺；等等。

支持物应具有足够的厚度以提供对多孔膜足够的结构支持，例如，约100至约5,000微米，在一些实施方案中为约150至约2,000微米，并且在一些实施方案中，为约250至约1,000微米。

可以将多孔膜浇铸到支持物上，并将所得的层压板冲切成期望的尺寸和形状；或者，可以用例如粘合剂将多孔膜层压到支持物上。

如图1所示，LFIA三明治测定免疫层析测试条的典型实施方案包括连通膜，其通常包含一种或多种(并且通常是全部)以下成分：

(1)样品垫(也称为施加区)：施加有测试样品的吸附剂垫，其通常浸入包含缓冲盐、表面活性剂等的洗脱介质中，以促进将样品转移至缀合物区；

(2)缀合物(或试剂)垫(也称为缀合物区)：包含一种或多种检测抗体，通常通过与信号携带实体，例如荧光或有色颗粒(例如，胶体金纳米颗粒或乳胶微球)化学缀合来标记。从洗脱液的运行方向看，缀合物区可以位于样品施加区之前、之内或之后。

(3)反应膜：通常是硝化纤维素或醋酸纤维素的表面，在该表面上结合或以其它方式固定有另一种也对靶标分析物具有特异性的捕捉抗体。(术语“干涸(dry-down)形式”通常是指通过在跨过膜的线中将捕捉抗体喷洒，然后干燥以充当捕捉区或测试线制备的测试条。)

(4)通常还将存在对照区，其含有对检测抗体缀合物或分析物具有特异性的抗体。测试线位于缀合物/施加区之后，并且对照线位于测试线之后。测试线和对照线一起构成通常被称为检测区的区域。

(5)吸附剂垫(也称为“废物区”)：充当芯吸或废物储存器的表面，其经设计以通过毛细作用将样品拉过反应膜，芯吸过多的试剂并防止液体回流。

上述成分(优选地如上所述安装在固体基底上以提供更好的稳定性和处理性)可以以简单的浸渍片形式或在试剂盒内呈现。

本发明的试剂盒通常包括壳体(例如塑料罩壳)，以将测试条的几个成分固定在适当的位置并维持它们的紧密关联。壳体还可以包含显示捕捉和/或对照区的样品口和/或反应窗。(通常用于抗体筛选的“半浸渍片”可在没有捕捉抗体或对照线的情况下包含以上元件(1)-(3)和任选地包含(5)。)

在操作中，将包含分析物的生物或其他样品(任选地用缓冲液稀释)施加到样品垫上，如(A)所示。

当样品迁移到缀合物垫(所述缀合物垫可以位于样品沉积点附近，上游或(如所示)下游)时，样品遇到检测抗体-信号缀合物；并且所得的分析物/检测抗体-信号复合物(如(B)所示)通过毛细管作用沿条迁移；(C)形成的复合物继续沿着条迁移，到分析物被线中固定化的捕捉抗体捕获的地方，以在测试线上形成捕捉抗体/分析物/检测抗体三元复合物。过量的检测抗体缀合物在浸渍条上进一步迁移，直到它到达对照区，在该区域中它与物种特异性抗免疫球蛋白抗体结合。

关于进一步的背景，参见例如K.M.Koczula and A.Gallotta,Essays Biochem.2016Jun 30；60(1):111–120，在线发布于2016年6月30日。

尽管上面已经描述了免疫测定法装置配置的某些实施方案，但是应理解，本发明的装置通常可以具有期望的任何配置，并且不需要包含上述所有组分。例如，各种其它装置配置记载于Lambotte等人的美国专利No.5,395,754；Jou等人的美国专利No.5,670,381；和Malick等人的美国专利No.6,194,220，出于所有目的通过引用将它们整体并入本文。

RIDT通常以三种不同的形式出现——浸渍片、卡带或卡。将包含一次性硝化纤维条的浸渍片直接放入含有呼吸道标本和测试试剂盒提取剂的孔或管中。或者，硝化纤维素条可以放在塑料壳体(卡带)内或者与厚纸(卡)结合。

RIDT通常可以接受一种或多种类型的呼吸道标本，例如唾液、鼻抽吸物或拭子，鼻咽抽吸物或拭子以及喉咙拭子。各种类型的鼻拭子或鼻咽拭子是本领域技术人员公知的。样品收集材料可以由吸水材料制成，例如高纯度棉纤维，其通过超声焊接固定到塑料装置。备选材料可以是聚酯、人造丝、聚酰胺或其他纤维聚合物材料。相容的拭子也可以用尼龙或海藻酸钙制成。

优选地，RIDT包含试剂盒，该试剂盒包含使用说明书。在检测流感的情况下，此类说明书优选包含以下推荐：应尽可能接近症状发作收集标本，并且通常不要在4-5天后收集，因为病毒脱落通常减少，并且在成年人中病毒通常5天后无法检测到(对于儿童来说有时更长)。

在测试之间得出结果的时间有所不同，但目前市售的大多数甲型/乙型流感RIDT可以在5至15分钟内提供结果。在某些情况下，制造商指定最大读取时间和/或提供可以添加以允许可靠的延迟读取的停止溶液。试剂盒可以任选地包含阅读仪器和/或观察口。

流感诊断测试的临床准确性由与“金”标准(通常为培养物)相比检测流感病毒感染的测试的灵敏性和特异性决定。灵敏性是指如通过测试检测为阳性的“真实流感病例”的百分比。特异性是如通过测试检测为阴性的“真正的非流感病例”的百分比。

附图简述

图1是如前所述的侧向流免疫测定法的示意图。

图2显示了人甲型流感病毒A/Puerto Rico/8/1934(PR8)(下文为“毒株A/PR/8/34”)的NP抗原的氨基酸序列，UniProt登录号P03466(SEQ ID NO:1)。

图3显示了人甲型流感的NP结合表位的肽序列(SEQ ID NO:2)(为1字母代码，3字母代码和全名)，其对应于SEQ.ID.No.1的33-40位氨基酸。

图4显示了NP结合表位(SEQ ID NO:3)的肽序列(为1字母代码，3字母代码和全名)。

图5和图6是在实施例1中获得的湿浸渍片剂量响应曲线，其绘制了平均Rann得分(n＝2)对H1N1 California(图5)或H3N2 Switzerland(图6)的纯化的NP抗原的浓度(ng/ml)，使用指定的捕捉和缀合物抗体对进行。

图7是在实施例2中获得的剂量响应曲线，其绘制了平均Rann得分(n＝3)对H1N1California的纯化的NP抗原的浓度(ng/ml)，使用实施例的抗体对(A)进行。

发明详述

如本文所用，术语“抗体”是指免疫球蛋白分子和免疫球蛋白(Ig)分子的免疫学活性部分，即，含有特异性结合抗原的抗原结合位点的分子。“特异性结合”是指抗体与期望抗原的一种或多种抗原决定簇反应而不与其他多肽反应。抗体可包括但不限于多克隆抗体、单克隆抗体、嵌合抗体、dAb(域抗体)、单链、F_ab，F_ab'和F_(ab)2片段、scFvs和Fab表达文库。

如本文所用，术语“表位”包括能够特异性结合抗体的任何蛋白质决定簇。表位决定簇通常由分子的化学活性表面基团组成，例如氨基酸或糖侧链，通常具有特定的三维结构特征以及特定的电荷特征。例如，可以产生针对多肽的N端或C端肽的抗体。

结合的强度或亲和力可以根据相互作用的解离常数(K_d)表示，其中较小的K_d代表较大的亲和力。可以使用本领域公知的方法来定量选择的抗体的免疫学结合特性。如通过诸如放射性配体结合测定法的测定法或本领域技术人员已知的测定法所测量，当平衡结合常数Kd<1pM，优选<100nM，更优选<10nM，且最优选<100pM至约1pM时，认为本发明的抗体特异性结合流感表位。参见美国专利9,951,122，其通过引用并入。

术语“生物样品”意指包含从受试者分离的组织、细胞和/或生物流体，以及存在于受试者内的组织、细胞和/或流体的组合物。生物样品的实例可以包括唾液、痰、鼻抽吸物或拭子、鼻抽吸物或拭子、咽喉拭子和脸颊刮擦或拭子。术语“生物样品”的使用中还包括包含血液或血液级份或成分，包括血清、血浆或淋巴液的组合物。

本发明的新抗体组合包含至少两种抗体，其中至少一种能够在与信号部分缀合或以其他方式关联时充当检测抗体，并且至少一种能够在结合于或以其它方式固定化到免疫层析条时充当捕捉抗体。

本文所述的鼠单克隆抗体是基本上同质的；对NP蛋白具有特异性和亲和力，并且与其他病毒蛋白基本无交叉反应性。

如本文所用的术语“核蛋白”或“NP”应理解为是指单体形式和寡聚形式(例如，二聚体、三聚体、四聚体等)，尤其是同寡聚体形式的病毒蛋白质。

某些鼠抗甲型流感NP单克隆抗体可购自许多供应商，包括Antibodies-Online和Meridian Life Science，并用于制备本发明的新抗体对。

所述分离的和纯化的单克隆抗体可以通过通常已知的技术来制备，例如通过第一次由Kohler et al.,Nature,256:495(1975)描述的杂交瘤方法。

本发明还涵盖包括所述单克隆抗体的NP-表位结合片段，以及所述单克隆抗体的人源化形式及其NP结合片段。

将适用于本发明的鼠单克隆抗体的核蛋白结合表位定位到靠近甲型流感核蛋白的N端的区域，因此例如位于包含甲型流感病毒全长核蛋白的氨基酸位置1-60，优选氨基酸位置10-50，例如10-20或30-45(例如由这些位置间的一个或多个残基组成)的区域。

使用对应于SEQ.ID.NO:1的NP抗原(毒株A/PR/8/34)的长度的82个重叠肽通过已知方法对表1上列出的市售NP单克隆抗体的表位定位揭示了对表1中所示NP表位序列的亲和力和特异性(即通过间接ELISA测量的≥0.4OD_492nm)：

在本发明的一个优选的实施方案中，每种检测和捕捉抗体对具有SEQ.ID.NO:2的表位具有亲和力，并特异性结合具有SEQ.ID.NO:2的表位。

在另一个实施方案中，检测抗体对具有SEQ.ID.NO:3的表位具有亲和力并特异性结合具有SEQ.ID.NO:3的表位，并且捕捉抗体对具有SEQ.ID.NO:2的表位具有亲和力，并特异性结合具有SEQ.ID.NO:2的表位。在又一个实施方案中，检测抗体对具有SEQ.ID.NO:2的表位具有亲和力，并特异性结合具有SEQ.ID.NO:2的表位，并且捕捉抗体对具有SEQ.ID.NO:3的表位具有亲和力，并特异性结合具有SEQ.ID.NO:3的表位。

本发明的优选的抗体对包括：

(a)作为检测抗体，Antibodies-Online,产品号ABIN2489610,克隆B248M(下文为“Ab online 610缀合物”)；和

(b)作为捕捉抗体，Meridian Life Science,Product No.C01731M,克隆B1632M(下文为“Meridian CO1731M cap”或“Meridian捕捉”)。

如上所述，本发明的抗体对特别可用作三明治型LIFA中的检测和捕捉试剂。

显然，如本文所用的术语“三明治”(或“三明治型”)意指免疫测定法，其中配对的检测和捕捉抗体能够结合任选寡聚化的NP分析物的不同或相同的表位。

下列实施例仅通过各种具体实施方案以示例方式提供，并且决不认为是对本发明的限制。

材料和方法

测试以下抗体对：

检测抗体-金缀合物。通过已知技术制备由BBI Solutions OEM Ltd.提供的检测抗体与40nm胶体金颗粒(HD.GC40.OD10)的缀合物。将缀合物用PBS1％Tween 20稀释，以形成光密度(OD)为1的悬浮液。

NP标准品通过在PBS 1％Tween 20中连续稀释甲型流感株H1N1(California/07/2009)(“H1N1”)和H3N2(Switzerland/9715293/2013)(“H3N2”)的重组抗原(来源：Stratech)而制备成1-50纳克每毫升的浓度。

实施例1：检测抗体缀合物对H1N1和H3N2的NP抗原的半(即“湿”)浸渍片剂量响应。

使用Isoflow试剂分配模块，以0.1微升/秒的速率将捕捉抗体条带化到2.5x 30cm的硝化纤维素膜卡上。将该卡在湿度受控的干燥室中于环境温度下干燥过夜，然后用21毫米宽的纤维素纤维芯(222Ahlstrom膜)进行层压。使用运动切割机(Kinematic Matrix2360)将卡切成5毫米宽的条，产生5毫米宽的半侧向流浸渍片(“半浸渍片”)。

将各20μl的NP储备液和检测抗体-金缀合物悬浮液加入96孔板中。将半浸渍片样品置于孔中，静置直至所有液体被吸收。

在图5和6上显示了样品测试线颜色强度相对于Rann量表0(测试线上无可见颜色)至2(测试线上可见颜色)至11(测试线上非常强烈的颜色)的视觉评分结果。

上表的抗体对(A)显示两种甲型流感株的NP蛋白的1ng/ml分析物的LOD。

实施例2：以“干涸”形式评估抗体对(A)。

用1.0mg/ml的捕捉抗体将硝化纤维素膜卡成条，并在环境温度下在湿度受控的环境中干燥过夜。用检测抗体缀合物喷雾膜卡上的缀合物垫。

使用标准技术，使用60μl的每种H1N1 NP标准品和检测抗体缀合物悬浮液运行装置20分钟。

图7中显示了相对于如前所述的Rann量表对测试线进行视觉评分的结果。

已显示抗体对(A)检测H1N1株的NP抗原至1ng/ml。

序列表

<110> Dennis Joseph CHURCH

Anthony NICHOLS

<120> 用于快速甲型流感诊断测试的抗体对

<130> CU66592

<150> 62/683168

<151> 2018-06-11

<160> 3

<170> FastSEQ for Windows Version 4.0

<210> 1

<211> 498

<212> PRT

<213> 流感

<400> 1

Met Ala Ser Gln Gly Thr Lys Arg Ser Tyr Glu Gln Met Glu Thr Asp

1 5 10 15

Gly Glu Arg Gln Asn Ala Thr Glu Ile Arg Ala Ser Val Gly Lys Met

20 25 30

Ile Gly Gly Ile Gly Arg Phe Tyr Ile Gln Met Cys Thr Glu Leu Lys

35 40 45

Leu Ser Asp Tyr Glu Gly Arg Leu Ile Gln Asn Ser Leu Thr Ile Glu

50 55 60

Arg Met Val Leu Ser Ala Phe Asp Glu Arg Arg Asn Lys Tyr Leu Glu

65 70 75 80

Glu His Pro Ser Ala Gly Lys Asp Pro Lys Lys Thr Gly Gly Pro Ile

85 90 95

Tyr Arg Arg Val Asn Gly Lys Trp Met Arg Glu Leu Ile Leu Tyr Asp

100 105 110

Lys Glu Glu Ile Arg Arg Ile Trp Arg Gln Ala Asn Asn Gly Asp Asp

115 120 125

Ala Thr Ala Gly Leu Thr His Met Met Ile Trp His Ser Asn Leu Asn

130 135 140

Asp Ala Thr Tyr Gln Arg Thr Arg Ala Leu Val Arg Thr Gly Met Asp

145 150 155 160

Pro Arg Met Cys Ser Leu Met Gln Gly Ser Thr Leu Pro Arg Arg Ser

165 170 175

Gly Ala Ala Gly Ala Ala Val Lys Gly Val Gly Thr Met Val Met Glu

180 185 190

Leu Val Arg Met Ile Lys Arg Gly Ile Asn Asp Arg Asn Phe Trp Arg

195 200 205

Gly Glu Asn Gly Arg Lys Thr Arg Ile Ala Tyr Glu Arg Met Cys Asn

210 215 220

Ile Leu Lys Gly Lys Phe Gln Thr Ala Ala Gln Lys Ala Met Met Asp

225 230 235 240

Gln Val Arg Glu Ser Arg Asn Pro Gly Asn Ala Glu Phe Glu Asp Leu

245 250 255

Thr Phe Leu Ala Arg Ser Ala Leu Ile Leu Arg Gly Ser Val Ala His

260 265 270

Lys Ser Cys Leu Pro Ala Cys Val Tyr Gly Pro Ala Val Ala Ser Gly

275 280 285

Tyr Asp Phe Glu Arg Glu Gly Tyr Ser Leu Val Gly Ile Asp Pro Phe

290 295 300

Arg Leu Leu Gln Asn Ser Gln Val Tyr Ser Leu Ile Arg Pro Asn Glu

305 310 315 320

Asn Pro Ala His Lys Ser Gln Leu Val Trp Met Ala Cys His Ser Ala

325 330 335

Ala Phe Glu Asp Leu Arg Val Leu Ser Phe Ile Lys Gly Thr Lys Val

340 345 350

Leu Pro Arg Gly Lys Leu Ser Thr Arg Gly Val Gln Ile Ala Ser Asn

355 360 365

Glu Asn Met Glu Thr Met Glu Ser Ser Thr Leu Glu Leu Arg Ser Arg

370 375 380

Tyr Trp Ala Ile Arg Thr Arg Ser Gly Gly Asn Thr Asn Gln Gln Arg

385 390 395 400

Ala Ser Ala Gly Gln Ile Ser Ile Gln Pro Thr Phe Ser Val Gln Arg

405 410 415

Asn Leu Pro Phe Asp Arg Thr Thr Ile Met Ala Ala Phe Asn Gly Asn

420 425 430

Thr Glu Gly Arg Thr Ser Asp Met Arg Thr Glu Ile Ile Arg Met Met

435 440 445

Glu Ser Ala Arg Pro Glu Asp Val Ser Phe Gln Gly Arg Gly Val Phe

450 455 460

Glu Leu Ser Asp Glu Lys Ala Ala Ser Pro Ile Val Pro Ser Phe Asp

465 470 475 480

Met Ser Asn Glu Gly Ser Tyr Phe Phe Gly Asp Asn Ala Glu Glu Tyr

485 490 495

Asp Asn

<210> 2

<211> 8

<212> PRT

<213> 流感

<400> 2

Ile Gly Gly Ile Gly Arg Phe Tyr

1 5

<210> 3

<211> 7

<212> PRT

<213> 流感

<400> 3

Met Glu Thr Asp Gly Glu Arg

1 5

Claims (27)

1.匹配的抗体对，其在侧向流免疫测定法中用作检测和捕捉抗体以检测样品中存在的甲型流感的核蛋白(NP)抗原，其中所述匹配的抗体对的抗体独立地能够结合包含甲型流感核蛋白的氨基酸1-60的区域中的NP表位。

2.根据权利要求1的匹配的抗体对，其中所述抗体能够结合在每种情况下独立地选自下组的NP表位：本文的SEQ.ID.No.2和3。

3.根据权利要求1的匹配的抗体对，其中所述抗体的至少一种结合包含SEQ.ID.NO:2的NP表位。

4.根据权利要求1的匹配的抗体对，其中所述检测和捕捉抗体能够结合包含SEQ.ID.No.2的NP表位。

5.根据权利要求1的匹配的抗体对，其中所述检测抗体是Antibodies OnlineABIN2489610，克隆B248M，并且所述捕捉抗体是Meridian CO1731M，克隆B1632M。

6.三元复合物，其包含：

(a)甲型流感核蛋白(NP)；

(b)与可检测信号缀合或以其他方式关联的检测抗体；和

(c)捕捉抗体，其任选地固定化在基底上，

其中(b)和(c)能够结合在每种情况下独立选自下组的(a)的表位：

在包含甲型流感核蛋白的氨基酸1-60的区域中的NP表位。

7.根据权利要求6的三元复合物，其中(b)和(c)能够结合在每种情况下独立地选自下组的(a)的表位：本文的SEQ.ID.No.2和3。

8.根据权利要求6的三元复合物，其中所述抗体的至少一种能够结合包含SEQ.ID.No.2的NP表位。

9.根据权利要求6的三元复合物，其中所述检测和捕捉抗体能够结合包含SEQ.ID.No.2的NP表位。

10.根据权利要求6的三元复合物，其中(b)和(c)分别是Antibodies OnlineABIN2489610，克隆B248M，和Meridian CO1731M，克隆B1632M。

11.基底，其包含免疫层析材料，所述免疫层析材料上固定化有根据权利要求6、7、8、9或10中任一项的三元复合物。

12.用于检测样品中的甲型流感核蛋白(NP)的侧向流免疫测定法，其包含：

(a)流动相，其包含与可检测信号缀合或以其他方式关联的检测抗体，所述检测抗体能够结合NP以形成二元复合物；和

(b)固定相，其包含含有免疫层析材料的基底，所述免疫层析材料上固定化有捕捉抗体，所述捕捉抗体能够结合所述二元复合物的所述NP以形成三元复合物，由此由所述三元复合物产生的可检测信号指示所述样品中NP的存在；

所述捕捉和检测抗体能够结合包含甲型流感核蛋白的氨基酸1-60的区域中的NP表位。

13.根据权利要求12的侧向流免疫测定法，其中所述检测和捕捉抗体结合在每种情况下独立地选自下组的NP表位：本文的SEQ.ID.NO:2和3。

14.根据权利要求12的侧向流免疫测定法，其中所述抗体的至少一种结合包含SEQ.ID.No.2的NP表位。

15.根据权利要求12的侧向流免疫测定法，其中所述检测抗体和捕捉抗体能够结合包含SEQ.ID.No.2的NP表位。

16.根据权利要求12的侧向流免疫测定法，其中所述检测抗体是Antibodies OnlineABIN2489610，克隆B248M，并且捕捉抗体是Meridian CO1731M，克隆B1632M。

17.使用包含流动相和固定相的侧向流免疫测定法检测样品中的甲型流感的方法，所述方法包括

(a)将所述样品引入所述测定法的所述流动相，

(b)使所述样品中的甲型流感核蛋白(NP)与检测抗体接触以在所述流动相中形成包含所述检测抗体和NP的二元复合物，所述检测抗体与可检测信号缀合或以其他方式关联，并且

(c)使所述流动相与包含上面固定化有捕捉抗体的免疫层析材料的固定基底接触，所述捕捉抗体能够结合所述二元复合物的所述NP以形成三元复合物，由此由所述三元复合物产生的可检测信号指示样品中NP的存在，

其中所述捕捉抗体和所述检测抗体能够结合包含甲型流感核蛋白的氨基酸1-60的区域中的NP表位。

18.根据权利要求17的用于检测甲型流感的方法，其中抗体的至少一种结合包含SEQ.ID.NO:2的NP表位。

19.根据权利要求17的用于检测甲型流感的方法，其中所述检测和捕捉抗体能够结合包含SEQ.ID.NO:2的NP表位。

20.根据权利要求17的检测甲型流感的方法，其中所述检测抗体和捕捉抗体分别是Antibodies Online ABIN2489610，克隆B248M和Meridian CO1731M，克隆B1632M。

21.用于诊断患有甲型流感的患者的方法，该方法包括在根据权利要求12、13、14、15或16的侧向流免疫测定法中测试来自所述患者的生物样品，并测定甲型流感核蛋白的存在，其中可检测信号的存在指示所述患者中的甲型流感感染。

22.根据权利要求21的用于诊断患者的方法，其中所述患者是人。

23.根据权利要求21的用于诊断患者的方法，其中所述生物样品包括人唾液。

24.根据权利要求21的诊断患者的方法，其中所述生物样品包括人鼻粘膜液。

25.监测患者中的甲型流感的治疗性处理的功效的方法，其通过在根据权利要求12、13、14、15或16的侧向流免疫测定法中测试来自所述患者的生物样品，并且测定在治疗甲型流感的药物活性剂施用之前和之后甲型流感核蛋白的存在或缺乏。

26.医疗装置，其包含根据权利要求12、13、14、15或16的侧向流免疫测定法。

27.试剂盒，其包含壳体中的根据权利要求12、13、14、15或16的侧向流免疫测定法，并且任选地阅读器装置和/或使用所述试剂盒的说明书。

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