CN102095860A

CN102095860A - 梅毒特异性IgG抗体免疫印迹试剂盒及其制备方法

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Publication number: CN102095860A
Application number: CN2011100274258A
Authority: CN
Inventors: 刘莉莉; 张忠英; 杨天赐; 林丽蓉
Original assignee: Zhongshan Hospital Xiamen University
Current assignee: Zhongshan Hospital Xiamen University
Priority date: 2011-01-25
Filing date: 2011-01-25
Publication date: 2011-06-15
Anticipated expiration: 2031-01-25
Also published as: CN102095860B

Abstract

梅毒特异性IgG抗体免疫印迹试剂盒及其制备方法，涉及一种试剂盒。试剂盒设载体板、硝酸纤维膜、梅毒特异性IgG抗体检测线、对照线，检测线和对照线依次设在硝酸纤维膜上；在梅毒特异性IgG抗体检测线处包被梅毒特异性重组抗原，在对照线处包被人IgG抗体；辣根过氧化物酶标记抗人γ链抗体。先制备梅毒特异性重组抗原，再硝酸纤维素膜的点样，然后制备抗人IgG特异性片段γ链单克隆抗体，标记抗人IgG特异性片段γ链单克隆抗体的辣根过氧化物酶后制备免疫印迹试剂盒。可用于全血、血清、血浆及脑脊液等标本中梅毒特异性IgG抗体的检测。所需标本量极小，不需特殊仪器，且检测简便快速，特异性强，灵敏度高，准确可靠，成本低。

Description

梅毒特异性IgG抗体免疫印迹试剂盒及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种试剂盒，尤其是涉及一种梅毒特异性IgG抗体检测免疫印迹试剂盒及其制备方法。

背景技术

梅毒(Syphilis)是一种由梅毒螺旋体(Treponema pallidum，TP)引起的性传播性疾病，其病原体是梅毒螺旋体，属螺旋体科。梅毒螺旋体主要通过性接触、输血、创口或者胎盘等途径传播。梅毒螺旋体从感染区附近的淋巴结进入血液，播散全身，使机体几乎所有的组织及器官受累，临床表现为全身性，可分为不同临床阶段，包括一期、二期、三期和潜伏期。世界卫生组织(WHO)曾乐观地预言：“由于有高敏度检测方法和高效的治疗方案，梅毒是一种能够通过公共卫生措施得到成功控制的性传播性疾病”。遗憾的是，至今梅毒依然是世界范围的公共卫生问题，缺乏有效的行政控制措施，每年全球大约有1200万的患者，其中60万孕妇患者([1]林丽蓉，杨波，潘锡涛，等.潜在的血源传播患者梅毒血清学检测方法的选择.中华医院感染学杂志.2010，20(10)：1491-1494)。事实上，梅毒的感染现状可能要比想象中的更让人悲观。

调查发现，梅毒感染者已经较广泛地存在于普通人群中。

梅毒螺旋体尚不能进行体外培养，梅毒诊断与流行病学调查主要依赖于血清学试验，包括特异性抗体和反应素检测两大类型。梅毒特异性抗体IgM(TP-IgM)和IgG(TP-IgG)抗体分别于2周和4周后产生，即使患者经过足够治疗，其仍能长期存在，甚至终身不消失([2]林丽蓉，但冰，付左根，等.潜在血源传播患者梅毒血清学TRUST/TPPA与IgM抗体联合检测.中国皮肤性病学杂志.2010，152(05)：446-448)；而另一种抗体物质反应素产生较晚，一般在受感染后5～7周产生，而且晚期梅毒、梅毒治疗后期以及潜伏梅毒可能阴性，因此梅毒特异性抗体的阳性率、敏感性显著高于反应素。TP-IgM是梅毒感染后，机体最先出现的特异性抗体。只要有活的梅毒螺旋体存在，其TP-IgM将会维持在一定的水平。Martina H等([3]MartinaH，Daan W N，Mart M，et al.Comparison of a Treponema pallidum IgM immunoblot with a 19Sfluorescent treponemal antibody absorption test for the diagnosis of congenital syphilis[J].Diagnostic Microbiology and Infectious Disease，2007，59：61-66.)认为TP-IgM是梅毒早期感染并活动的一项血清学标志，李步荣等([4]李步荣，贺军涛，张毅，等.梅毒螺旋体IgM抗体检测的临床意义[J].第四军医大学学报，2007，28(16)：1495-1497)认为TP-IgM与TP-DNA一样，代表着梅毒传染性指标。在排除近期抗梅毒治疗的前提下，TP-IgM若不转阴，提示体内可能残存梅毒螺旋体或治疗不彻底。TP-IgM阴转者随访时再转阳性，表明再次感染梅毒([5]Rawstron SA，Mehta S，Bromberg K，et al.Evaluation of a Treponema pallidum2specificIgM enzyme immunoassay and Treponema pallidum western blot antibody detection in thediagnosis ofmaternal and congenital syphilis[J].Sex Transm Dis，2004，31(2)：123-126)。尽管TP-IgM阴性不能完全排除传染性，但TP-IgM阳性必定提示该患者具有传染性。TP-IgG的出现要迟于IgM，能长期存在，甚至终身不消失，因此，TP-IgG是梅毒诊断和流行病学调查的一项重要指标([6]Li-Rong Lin，Zuo-Gen Fu，Bing Dan，et al.Development of a colloidalgold-immunochromatography assay to detect Immunoglobulin G Antibodies to Treponemapallidum with TPN17 and TPN47.Diagnostic Microbiology and Infectious Disease，2010，68：193-200.)。

早期的血清学方法使用完整梅毒螺旋体作为抗原，研究和诊断用的TP是以TP感染兔睾丸获得，这种方法存在花费大、获得的TP量少且不纯(混有宿主蛋白)、与其他病原体存在交叉反应等缺点，因此假阳性也时有发生。随着分子生物学技术的普及及梅毒螺旋体抗原的相继克隆，将重组抗原应用于梅毒实验已经越来越多。目前研究比较多的TP抗原有TPN17、TPN47、TPN15、TPN44.5、TPN36、TP0453、TP0684及TPr家族。采用重组DNA技术制备的重组抗原可以克服完整TP抗原的缺点，能快速、经济地制备无限量特异重组TP抗原。

梅毒特异性IgG抗体检测方法包括梅毒螺旋体特异性抗体明胶凝集试验(TPPA)、酶联免疫吸附试验(ELISA)、荧光密螺旋体抗体吸收试验(FTA-ABS)及免疫印迹技术(Western-Blot)等，其特异性均较高。一般地，TPPA，ELISA作为临床初筛，当血清学阳性，或临床诊断有困难时，需要采用FTA-ABS及Western-blot作为确认试验。其中，FTA-ABS需要荧光显微镜，而且其结果判断需要训练有素和较丰富经验的专业人员才能完成，因此，其应用推广受到一定的限制。采用Western-blot方法制成的试剂盒，一般常规实验室均可完成，不需要特殊设备，判读也简单明了。现市售的Western-blot试剂均为进口试剂，价格昂贵。

发明内容

本发明的目的是提供一种梅毒特异性IgG抗体免疫印迹试剂盒及其制备方法。

本发明所述梅毒特异性IgG抗体免疫印迹试剂盒设有载体板、硝酸纤维膜、梅毒特异性IgG抗体检测线、对照线，梅毒特异性IgG抗体检测线和对照线依次设在硝酸纤维膜上；在梅毒特异性IgG抗体检测线处包被梅毒特异性重组抗原，在对照线处包被人IgG抗体；辣根过氧化物酶标记抗人γ链抗体。

所述梅毒特异性重组抗原为TPN15、TPN17、TPN37、TPN44.5、TPN47梅毒特异性重组抗原。

所述载体板可采用PVC板。

所述梅毒特异性IgG抗体免疫印迹试剂盒的制备方法，包括以下步骤：

1)制备梅毒特异性重组抗原

采用基因克隆技术，PCR扩增编码梅毒螺旋体抗原的DNA，并插入大肠杆菌中使其表达，得梅毒特异性重组抗原；

2)硝酸纤维素膜的点样

在硝酸纤维素膜IgG检测线上包被梅毒特异性重组抗原，在对照线处包被人IgG抗体，晾干；

3)制备抗人IgG特异性片段γ链单克隆抗体

以人IgG特异性片段γ链为抗原免疫Balb/c小鼠，通过杂交瘤技术，筛选获得稳定分泌抗人IgG单克隆抗体的杂交瘤细胞株；

4)抗人IgG特异性片段γ链单克隆抗体的辣根过氧化物酶(HRP)标记

采用过碘酸钠法进行辣根过氧化物酶(HRP)标记；

5)制备免疫印迹试剂盒

将硝酸纤维膜粘贴在载体板上表面，梅毒特异性IgG抗体检测线和对照线依次设在硝酸纤维膜上，在梅毒特异性IgG抗体检测线处包被梅毒特异性重组抗原，在对照线处包被包被人IgG抗体，用切条机切成条状，与酶标记的抗人γ链单克隆抗体及其底物共同组装成梅毒特异性IgG抗体免疫印迹试剂盒。

在步骤1)、2)、5)中，所述梅毒特异性重组抗原可为TPN15、TPN17、TPN37、TPN44.5、TPN47梅毒特异性重组抗原等。

在步骤2)中，所述梅毒特异性重组抗原和人IgG抗体的浓度可为1～4mg/mL；点样量可为1μL/cm。

在步骤3)中，采用ELISA的方法鉴定McAb效价在1∶10⁷以上。

在步骤4)中，所述辣根过氧化物酶的底物可由0.03％(W/V)的过氧化氢和0.07％(W/V)的二氨基联苯胺组成。

本发明提供了一种采用免疫印迹技术建立梅毒特异性IgG抗体检测试剂条，可用于全血、血清、血浆及脑脊液等标本中梅毒特异性IgG抗体的检测。该检测方法所需的标本量极小，不需要特殊仪器，肉眼直接判读结果，且检测简便快速，特异性强，灵敏度高，准确可靠，成本低，应用广泛。

附图说明

图1为本发明所述梅毒特异性IgG抗体免疫印迹试剂盒中膜条实施例的结构组成示意图。

图2为实验结果模式示意图。在图2中，I为使用前的示意图，H为无效试验(产品质量问题)，G为阴性结果，A～F为TP-IgG阳性结果；2为梅毒特异性TPN-15-IgG抗体检测线，3为梅毒特异性TPN-17-IgG抗体检测线，4为梅毒特异性TPN-37-IgG抗体检测线，5为梅毒特异性TPN-44.5-IgG抗体检测线，6为梅毒特异性TPN-47-IgG抗体检测线，7为对照线。

具体实施方式

以下实施例将结合附图对本发明作进一步的说明。

参见图1，本发明所述梅毒特异性IgG抗体免疫印迹试剂盒实施例设有载体板1、梅毒特异性IgG抗体检测线2～6，对照线7和硝酸纤维膜(NC膜)8。

硝酸纤维膜8粘贴在载体板1上表面，梅毒特异性IgG抗体检测线2～6和对照线7依次设在硝酸纤维膜8上；在梅毒特异性IgG抗体检测线处分别包被梅毒特异性重组抗原TPN15、TPN17、TPN37、TPN44.5和TPN47，在对照线7处包被人IgG抗体。

所述载体板采用PVC板。

1)制备TPN15、TPN17、TPN37、TPN44.5和TPN47梅毒特异性重组抗原

采用基因克隆技术，PCR扩增编码梅毒螺旋体抗原的DNA，并插入大肠杆菌中使其表达，得TPN15、TPN17、TPN37、TPN44.5和TPN47梅毒特异性重组抗原。

2)硝酸纤维素膜的点样

在硝酸纤维素膜IgG检测线上包被TPN15、TPN17、TPN37、TPN44.5、TPN47梅毒特异性重组抗原，在对照线处包被人IgG抗体，晾干。

3)制备抗人IgG特异性片段γ链单克隆抗体

以人IgG特异性片段γ链为抗原免疫Balb/c小鼠，通过杂交瘤技术，筛选获得稳定分泌抗人IgG单克隆抗体的杂交瘤细胞株。采用ELISA的方法鉴定McAb效价在1∶10⁷以上。

采用过碘酸钠法进行辣根过氧化物酶(HRP)标记。

5)制备免疫印迹试剂盒

将硝酸纤维膜粘贴在载体板上表面，梅毒特异性IgG抗体检测线和对照线依次设在硝酸纤维膜上；在梅毒特异性IgG抗体检测线处包被梅毒特异性重组抗原TPN15、TPN17、TPN37、TPN44.5、TPN47，在对照线处包被人IgG抗体，用切条机切成条状，和酶标记的抗人γ链单克隆抗体及其底物共同组装成梅毒特异性IgG抗体免疫印迹试剂盒。

以下给出采用梅毒特异性IgG抗体免疫印迹试剂盒检测患者的临床标本：

1)标本采用0.01mol/L PBS缓冲液进行1∶50稀释。

2)封闭：采用5％脱脂奶粉(0.01mol/LPBST缓冲液配制)作为封闭液，于室温(18～25℃)在摇摆摇床上温育30min。

3)血清温育：取出所需的膜条，将其放入温育槽内，并编号。在温育槽中分别加入1.5ml已稀释样本。于室温(18～25℃)在摇摆摇床上温育30min。

4)清洗：吸去槽内液体，在摇摆摇床上用1.5ml 0.01mol/L PBS缓冲液清洗膜条3次，每次5min。

5)加酶结合物：在温育槽中加入1.5ml已稀释的酶结合物(采用辣根过氧化物酶标记的抗人IgG特异性片段γ链单克隆抗体为检测抗体)，于室温(18～25℃)在摇摆摇床上温育30min。

6)清洗：吸去槽内液体，在摇摆摇床上用1.5ml 0.01mol/L PBS缓冲液清洗膜条3次，每次5min。

7)底物温育：在温育槽中分别加入1.5ml底物液(DAB)，于室温(18～25℃)在摇摆摇床上温育10min。

8)终止：吸去槽内液体，用蒸馏水清洗膜条3次，每次1min。

结果判断：将检测膜条放置在结果判定模板中，风干后判断结果。任何蛋白靶标出现的特异性条带，均可判断为阳性，确诊为梅毒(见图2)。

以下给出梅毒特异性IgG抗体免疫印迹试剂盒的性能检定：

1)外观检查：试剂盒无破损，包被反应膜平整、干净无污染斑点、无裂缝，胶带无开胶，无切斜现象。

2)阳性标本符合率：用TP-IgG阳性的不同滴度的阳性参比血清各50份采用梅毒特异性IgG抗体免疫印迹试剂盒检定，计算阳性符合率。阳性参比血清的确定采用FTA-ABS(德国欧蒙公司)法确定的临床标本。

3)阴性标本符合率：用50份阴性参比血清检定，计算阳性符合率。阴性参比血清的确定采用TPPA(日本富士株式会社)法确定的临床标本。

4)批内差异：同一批次梅毒特异性IgG抗体免疫印迹试剂盒，用特征性血清检测，要求阳性血清检测结果显示色带的颜色深浅一致，阴性血清检测的结果阴性。

5)批间差异：不同批次梅毒特异性IgG抗体免疫印迹试剂盒，用特征性血清检测，要求阳性血清检测结果显示色带的颜色深浅一致，阴性血清检测的结果阴性。

6)干扰试验：检测结果不受标本溶血(n＝50)、脂血(n＝50)和黄疸(n＝50)的干扰。

7)交叉反应：采用本梅毒特异性IgG抗体免疫印迹试剂盒，进行系统性红斑狼疮(n＝30)、类风湿病(n＝30)、免疫性肝炎(n＝30)等自身免疫系统疾病的检测，未发现交叉反应。

8)稳定性检测：应用Arrhenius法则，将梅毒特异性IgG抗体免疫印迹试剂盒放置37℃20天后检测，以上各项指标无显著变化，确保成品在室温干燥条件下保存，有效期为18个月。

以下给出具体实施例。

实施例1

1)标本采用0.01mol/L PBS缓冲液进行1∶50稀释。

8)终止：吸去槽内液体，用蒸馏水清洗膜条3次，每次1min。

实施例2

与实施例1相似，其区别在于硝酸纤维膜检测线仅由TPN15、TPN17、TPN37、TPN44.5梅毒特异性重组抗原组成，不含有TPN47梅毒特异性重组抗原。结果判断与实施例1相同。

实施例3

与实施例1相似，其区别在于硝酸纤维膜检测线仅由TPN15、TPN17、TPN37、TPN47梅毒特异性重组抗原组成，不含有TPN44.5梅毒特异性重组抗原。结果判断与实施例1相同。

实施例4

与实施例1相似，其区别在于硝酸纤维膜检测线仅由TPN15、TPN17、TPN44.5、TPN47梅毒特异性重组抗原组成，不含有TPN37梅毒特异性重组抗原。结果判断与实施例1相同。

实施例5

与实施例1相似，其区别在于硝酸纤维膜检测线仅由TPN15、TPN37、TPN44.5、TPN47梅毒特异性重组抗原组成，不含有TPN17梅毒特异性重组抗原。结果判断与实施例1相同。

实施例6

与实施例1相似，其区别在于硝酸纤维膜检测线仅由梅毒特异性重组抗原TPN17、TPN37、TPN44.5、TPN47组成，不含有梅毒特异性重组抗原TPN15。结果判断与实施例1相同。

实施例7

与实施例1相似，其区别在于待检标本为脑脊液标本，结果判断与实施例1相同。

实施例8

性能验证试验：按实施例1的方案制备梅毒特异性IgG抗体免疫印迹试剂盒，然后进行性能验证。

2)阳性标本符合率：用TP-IgG阳性的不同滴度的阳性参比标本各50份采用梅毒特异性IgG抗体免疫印迹试剂盒检定，计算阳性符合率。阳性参比标本的确定采用FTA-ABS(德国欧蒙公司)法确定的临床标本。

3)阴性标本符合率：用50份阴性参比标本检定，计算阳性符合率。阴性参比标本的确定采用TPPA(日本富士株式会社)法确定的临床标本。

4)批内差异：同一批次梅毒特异性IgG抗体免疫印迹试剂盒，用特征性标本检测，要求阳性标本检测结果显示色带的颜色深浅一致，阴性标本检测的结果阴性。

5)批间差异：不同批次梅毒特异性IgG抗体免疫印迹试剂盒，用特征性标本检测，要求阳性标本检测结果显示色带的颜色深浅一致，阴性标本检测的结果阴性。

6)交叉反应：采用本梅毒特异性IgG抗体免疫印迹试剂盒，进行系统性红斑狼疮(n＝30)、类风湿病(n＝30)、免疫性肝炎(n＝30)等自身免疫系统疾病的检测，未发现交叉反应。

7)稳定性检测：应用Arrhenius法则，将梅毒特异性IgG抗体免疫印迹试剂盒放置37℃20天后检测，以上各项指标无显著变化，确保成品在室温干燥条件下保存，有效期为18个月。

Claims

1.梅毒特异性IgG抗体免疫印迹试剂盒，其特征在于设有载体板、硝酸纤维膜、梅毒特异性IgG抗体检测线、对照线，梅毒特异性IgG抗体检测线和对照线依次设在硝酸纤维膜上；在梅毒特异性IgG抗体检测线处包被梅毒特异性重组抗原，在对照线处包被人IgG抗体；辣根过氧化物酶标记抗人γ链抗体。

2.如权利要求1所述的梅毒特异性IgG抗体免疫印迹试剂盒，其特征在于所述梅毒特异性重组抗原为TPN15、TPN17、TPN37、TPN44.5、TPN47。

3.如权利要求1所述的梅毒特异性IgG抗体免疫印迹试剂盒，其特征在于所述载体板采用PVC板。

4.如权利要求1所述的梅毒特异性IgG抗体免疫印迹试剂盒的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

1)制备梅毒特异性重组抗原

2)硝酸纤维素膜的点样

3)制备抗人IgG特异性片段γ链单克隆抗体

4)抗人IgG特异性片段γ链单克隆抗体的辣根过氧化物酶标记

采用过碘酸钠法进行辣根过氧化物酶标记；

5)制备免疫印迹试剂盒

将硝酸纤维膜粘贴在载体板上表面，梅毒特异性IgG抗体检测线和对照线依次设在硝酸纤维膜上，在梅毒特异性IgG抗体检测线处包被梅毒特异性重组抗原，在对照线处包被人IgG抗体，用切条机切成条状，与酶标记的抗人γ链单克隆抗体及其底物共同组装成梅毒特异性IgG抗体免疫印迹试剂盒。

5.如权利要求4所述的梅毒特异性IgG抗体免疫印迹试剂盒的制备方法，其特征在于在步骤1)、2)、5)中，所述梅毒特异性重组抗原为TPN15、TPN17、TPN37、TPN44.5、TPN47。

6.如权利要求4所述的梅毒特异性IgG抗体免疫印迹试剂盒的制备方法，其特征在于在步骤2)中，所述梅毒特异性重组抗原和人IgG抗体的浓度为1～4mg/mL；点样量为1μL/cm。

7.如权利要求4所述的梅毒特异性IgG抗体免疫印迹试剂盒的制备方法，其特征在于在步骤3)中，采用ELISA的方法鉴定McAb效价在1∶10⁷以上。

8.如权利要求4所述的梅毒特异性IgG抗体免疫印迹试剂盒的制备方法，其特征在于在步骤4)中，所述辣根过氧化物酶的底物由0.03％(W/V)的过氧化氢和0.07％(W/V)的二氨基联苯胺组成。