CN109358197A - 一种基于桥联抗体偶联荧光微球的荧光检测器件及荧光检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种基于桥联抗体偶联荧光微球的荧光检测器件及荧光检测方法。荧光检测器件，其包括桥联抗体偶联荧光微球和试纸条，所述的试纸条包括衬板，衬板的一面从上到下依次粘贴吸水垫、检测垫和样品垫，相邻各垫在连接处交叠连接，所述检测垫以硝酸纤维素膜为基垫，硝酸纤维素膜上自上而下横向设置质控线和一条或一条以上的检测线，所述质控线上包被有可结合桥联抗体偶联荧光微球的结合物，所述检测线上包被有与不同待测物对应的各检测物抗原；所述的桥联抗体偶联荧光微球是利用桥联抗体作中间连接层得到的偶联有特异性识别各待检测物的抗体的桥联抗体偶联荧光微球。本发明荧光检测器件提高了体系的检测灵敏度，可实现不同待测物的快速检测。
Description
技术领域
本发明属于检测技术领域，具体涉及一种基于桥联抗体偶联荧光微球的荧光检测器件及荧光检测方法。
背景技术
免疫竞争反应是荧光检测器件的基本原理。免疫竞争反应是利用目标物与抗原竞争性结合抗体的反应，实现目标物的定性或定量检测。试纸条检测技术主要是将待测物对应的抗原固定在检测线上，通过检测线上的抗原与样品提取液中的待测物竞争性结合微球上修饰的特异性抗体，再利用待测物含量与荧光强度之间的关系，实现待测物的定量检测。然而该方法存在单抗用量大，灵敏度低的缺点。
发明内容
本发明提供一种基于桥联抗体偶联荧光微球的荧光检测器件及荧光检测方法。
本发明采用以下技术方案：
本发明提供一种基于桥联抗体偶联荧光微球的荧光检测器件，其包括桥联抗体偶联荧光微球和试纸条，所述的试纸条包括衬板，衬板的一面从上到下依次粘贴吸水垫、检测垫和样品垫，相邻各垫在连接处交叠连接，所述检测垫以硝酸纤维素膜为基垫，硝酸纤维素膜上自上而下横向设置质控线和一条或一条以上的检测线，所述质控线上包被有可结合桥联抗体偶联荧光微球的结合物，所述检测线上包被有与不同待测物对应的各检测物抗原；所述的桥联抗体偶联荧光微球是利用桥联抗体作中间连接层得到的偶联有特异性识别各待检测物的抗体的桥联抗体偶联荧光微球。
按上述方案，所述的桥联抗体偶联荧光微球包括荧光微球、修饰在荧光微球表面的桥联抗体和与桥联抗体结合的特异性识别待检测物的鼠源性抗体如鼠源性单抗，所述的桥联抗体为抗鼠源性单抗的二抗如兔抗鼠二抗。特异性识别待检测物的鼠源性抗体主要通过桥联抗体偶联在荧光微球上。
按上述方案，所述的桥联抗体偶联荧光微球上桥联抗体和特异性识别待检测物的抗体的摩尔比为(100-1000)：1。
按上述方案，所述的待检测物为黄曲霉毒素M1、三聚氰胺小分子或疟疾抗原；与待测物对应的特异性抗体为抗黄曲霉毒素M1、抗三聚氰胺抗体和抗疟疾抗原的抗体、所述的检测线上各检测物抗原的包被量为0.1-0.35μg/cm检测线。
按上述方案，所述的检测线为两条，分别包被有黄曲霉毒素M1(AFM1)抗原和三聚氰胺(MEL)抗原。
按上述方案，所述桥联抗体偶联荧光微球包埋的荧光基团为銪、镱等镧系元素。
按上述方案，所述的试纸条包括有质控线，所述的质控线上包被有抗鼠源性单抗的二抗或鼠源性单抗，所述质控线上抗鼠源性单抗的二抗或鼠源性单抗的包被量为0.01-0.14μg/cm质控线。
按上述方案，所述荧光微球的粒径为500nm-1μm，具体可选择聚苯乙烯荧光微球，荧光微球包埋有荧光基团，表面修饰有羧基，具体地，所述的荧光微球通过表面羧基和桥联抗体的氨基共价结合，得到微球-桥联抗体偶联物；再加入特异性识别检测物的抗体，桥联抗体和特异性识别检测物的抗体结合，获得荧光微球-桥联抗体-特异性抗体偶联物荧光微球，即实现特异性抗体在微球上的标记。
具体可采用以下步骤：所述步骤为：将荧光微球先加入到调节pH值为6.0-9.0的缓冲液中；再加偶联剂进行活化，反应时间为10-30min；加入桥联抗体，桥联抗体和微球的偶联比为100：1至500：1，室温反应一段时间，反应时间为8-12h；离心得到的沉淀物重新溶解在含0.5％BSA的硼酸缓冲液中；加入特异性抗体，特异性抗体和桥联抗体的比为1：1至100：1，4℃下反应一段时间，反应时间为8-12h；离心得到的沉淀物重新溶解在含2％蔗糖，1％吐温-20，0.5％BSA和1％聚吡咯烷酮的缓冲液中。
一种基于桥联抗体偶联荧光微球的检测器件检测待测物含量的方法，包括下步骤：
将修饰有桥联抗体和特异性抗体的桥联抗体偶联荧光微球加入到样品提取液中，插入试纸条，室温反应；
测试试纸条检测线的荧光强度，基于荧光强度-待测物浓度关系曲线，获得待测样品提取液中待测物的含量。
按上述方案，室温反应时间为10min。
按上述方案，所述荧光强度-待测物浓度关系曲线的获得方法：用空白样品液或空白样品提取液加标配制一系列待测物的标准品溶液，在上述加标样品液中加入修饰有桥联抗体和特异性抗体的桥联抗体偶联荧光微球，插入试纸条，反应一段时间后，读取检测线上的荧光强度，以标准品浓度为横坐标，荧光强度为纵坐标，绘制荧光强度-待测物浓度信号响应曲线。
按上述方案，黄曲霉毒素M1(AFM1)标准品溶液的终浓度分别为0，0.02，0.04，0.1，0.2，0.3，0.4ng/mL；三聚氰胺标准品溶液的终浓度分别为0，5，10，25，50，100，150ng/mL。
以黄曲霉毒素M1(AFM1)和三聚氰胺(MEL)为例，当样品中不含AFM1和MEL中的任何一种时，荧光微球表面偶联的特异性抗体识别检测线上对应的抗原，发生抗原抗体特异性结合反应，荧光微球被固定在对应的检测线上，紫外照射下检测线具有荧光。
当样品中含有AFM1和MEL中的任何一种时，待测物AFM1或者MEL与检测线上固定的对应的抗原(AFM1抗原或MEL抗原)竞争结合荧光微球表面对应的偶联特异性抗体，使固定在检测线上的荧光微球减少，荧光强度降低。且AFM1或者MEL的含量越高，荧光强度越弱。由此通过荧光值的大小实现AFM1和MEL的同步定量检测。未被结合的荧光微球在毛细管力的作用下迁移到质控线，质控线与其结合，如质控线上的抗鼠源性单抗的二抗或鼠源性单抗与荧光微球表面的单抗或者桥联抗体结合产生荧光信号。
本发明的有益效果：
(1)本发明采用桥联抗体作为桥梁连接特异性抗体和荧光微球，提高了特异性抗体在荧光微球上分布的有序性，使特异性抗体的结合位点充分暴露，增强了特异性抗体的结合能力，提高了反应体系的灵敏度，灵敏度提高了一个数量级。
(2)桥联抗体的引入增强了特异性抗体的有效数量，因此降低了特异性抗体的使用量，降低了成本。
(3)本发明通过对对应抗原抗体的选取，可实现不同待测物的同步检测的切换。
(4)本发明可以同时检测多种待测物，操作简单，降低成本，适用于现场检测。
附图说明
图1为本发明提供的一种基于桥联抗体偶联荧光微球的检测器件及同时检测多种待测物含量方法的原理图，以黄曲霉毒素M1(AFM1)和三聚氰胺(MEL)为例；
图2为桥联抗体连接荧光微球和特异性抗体的原理图；
图3基于桥联抗体偶联荧光微球的荧光检测器件检测黄曲霉毒素M1和三聚氰胺的线性范围；
图4黄曲霉毒素M1-荧光强度信号响应曲线；
图5三聚氰胺-荧光强度信号响应曲线；
具体实施方式
现结合附图与具体实施案例对本发明作进一步说明。
本发明提供一种基于桥联抗体偶联荧光微球的荧光检测试纸条，原理图如图1所示。桥联抗体连接荧光微球与特异性抗体的结合原理如图2所示。桥联抗体作为桥联先与荧光微球共价结合，然后再特异性结合特异性抗体，实现特异性抗体与荧光微球的偶联，提高了特异性抗体在荧光微球表面的有序性分布，提高了灵敏度；可以同时检测多种待测物，降低了检测成本。
本发明的技术方案主要包括以下内容：
荧光微球与特异性抗体的偶联；试纸条的组装，以获得检测器件；
以及将上述得到的检测器件用于待测物含量的检测。
下面通过具体的实施例以及附图表对本发明做进一步的阐释，但本发明的技术方案不以具体实施例为限。
实施例
基于桥联抗体偶联荧光微球的检测器件及检测方法：
基于桥联抗体偶联特异性抗体的荧光微球：
铕标记的聚苯乙烯微球荧光微球，表面修饰有羧基基团，微球粒径为1μm，先用pH为8.18的硼酸缓冲液稀释，加入偶联剂1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐，室温反应15min，离心后沉淀重新用硼酸缓冲液溶解，加入桥联抗体，反应过夜。桥联抗体和荧光微球的摩尔比为400：1，桥联抗体的用量为100μg。将上述反应液以13300g的条件下离心10min，沉淀用含有0.5％牛血清蛋白的硼酸缓冲液溶解，室温反应3h；将上述反应液13300g的条件下离心10min，沉淀重新溶解在含2％蔗糖，1％吐温-20，0.5％BSA和1％聚吡咯烷酮的缓冲液中，加入0.01μg的抗黄曲霉毒素M1的单抗(由专利申请号2011保藏编号为CCTCCNO.C201018的杂交瘤细胞株2C9分泌产生的抗黄曲霉毒素M1单克隆抗体)和1.1μg的抗三聚氰胺鼠源性单抗(深圳市常量医学工程有限公司)，4℃下反应过夜；将上述反应液13300g的条件下离心10min，重复3次，得到的沉淀物重新溶解在含2％蔗糖，1％吐温-20，0.5％BSA和1％聚吡咯烷酮的缓冲液中，保存在4℃冰箱中备用。
试纸条的组装：
包括衬板，衬板的一面从上到下依次粘贴吸水垫、检测垫和样品垫，相邻各垫在连接处交叠连接，所述检测垫以硝酸纤维素膜为基垫，硝酸纤维素膜上自上而下横向设置一条质控线和两条检测线，所述质控线包被鼠源性单抗如抗杂色曲霉单抗，所述检测线上包被有与不同待测物对应的各检测物抗原。包被方法：用点膜仪(XYZ 3050，Bio Dot有限公司，美国)以0.7μL/cm的速率分别在T1检测线上包被浓度为0.25mg/mL的黄曲霉毒素M1抗原，在T2检测线上包被浓度为0.48mg/mL的三聚氰胺抗原，在质控线上包被浓度为0.1mg/mL的抗杂色曲霉单抗。包被液为含1％(m/v)牛血清蛋白和0.02％(m/v)叠氮钠的磷酸缓冲液(0.01mol/L，pH值为7.4)。
具体应用
荧光强度-待测物浓度关系曲线的获得方法：用空白牛奶样品加标配制一系列待测物的标准品溶液，在上述加标样品提液中加入修饰有桥联抗体和特异性抗体的荧光微球，插入试纸条，反应一段时间后，在365nm激发波长和613nm发射波长下读取检测线上的荧光强度，以标准品浓度为横坐标，荧光强度为纵坐标，绘制荧光强度-待测物浓度信号响应曲线。以基质空白产生的背景信号平均值加上3倍的均数标准差计算检测限。
黄曲霉毒素M1标准品溶液的终浓度为0，0.02，0.04，0.1，0.2，0.3，0.4ng/mL；三聚氰胺标准品溶液的终浓度为0，5，10，25，50，100，150ng/mL。
将特异性抗体修饰的荧光微球和样品提取液混合，特异性识别黄曲霉毒素M1的桥联抗体偶联荧光微球分散液、特异性识别三聚氰胺(MEL)抗原的桥联抗体偶联荧光微球分散液和牛奶样品液的体积比为1：1：2，其中特异性识别黄曲霉毒素M1的桥联抗体偶联荧光微球分散液、特异性识别三聚氰胺(MEL)抗原的桥联抗体偶联荧光微球的终浓度为1.66nmol/L,插入试纸条，室温反应10min，检测荧光强度，基于上述荧光强度-待测物浓度关系曲线分析得到黄曲霉毒素M1和三聚氰胺的含量。
荧光测定及分析：
结果如图3，4，5和表1所示。图3所示为紫外照射下基于桥联抗体偶联微球与特异性抗体的试纸条检测黄曲霉毒素M1和三聚氰胺的线性范围和特异性，图4和5分别为黄曲霉毒素M1和三聚氰胺与荧光强度之间的线性响应。本发明检测黄曲霉毒素M1和三聚氰胺的线性范围分别为0.02-0.4ng/mL和5-150ng/mL。以基质空白产生的背景信号平均值加上3倍的均数标准差计算检测限，见表1，黄曲霉毒素M1和三聚氰胺的检测限分别为0.009ng/mL和0.024ng/mL。
表1
,用两种方式在微球上偶联特异性抗体，一种是通过桥联抗体作为桥梁实现偶联，另一种是直接在微球表面通过共价结合偶联特异性抗体。利用不同合成方式合成的微球以及试纸条检测黄曲霉毒素M1和三聚氰胺，建立标准曲线，并以基质空白产生的背景信号平均值加上3倍的均数标准差计算检测限，进行比较。表1所示为本发明与特异性抗体直接偶联微球的试纸条检测黄曲霉毒素M1和三聚氰胺的灵敏度的比较；本发明的检测限比直接偶联微球的试纸条检测黄曲霉毒素M1和三聚氰胺的检测限显著提高。
Claims (10)
1.一种基于桥联抗体偶联荧光微球的荧光检测器件，其特征在于：其包括桥联抗体偶联荧光微球和试纸条，所述的试纸条包括衬板，衬板的一面从上到下依次粘贴吸水垫、检测垫和样品垫，相邻各垫在连接处交叠连接，所述检测垫以硝酸纤维素膜为基垫，硝酸纤维素膜上自上而下横向设置质控线和一条或一条以上的检测线，所述质控线上包被有可结合桥联抗体偶联荧光微球的结合物，所述检测线上包被有与不同待测物对应的各检测物抗原；所述的桥联抗体偶联荧光微球是利用桥联抗体作中间连接层得到的偶联有特异性识别各待检测物的抗体的桥联抗体偶联荧光微球。
2.根据权利要求1所述的基于桥联抗体偶联荧光微球的荧光检测器件，其特征在于：所述的桥联抗体偶联荧光微球包括荧光微球、修饰在荧光微球表面的桥联抗体和与桥联抗体结合的特异性识别待检测物的鼠源性抗体，所述的桥联抗体为抗鼠源性单抗的二抗。
3.根据权利要求1或2所述的基于桥联抗体偶联荧光微球的荧光检测器件，其特征在于：所述的检测线上各检测物抗原的包被量为0.1-0.35μg/cm检测线；所述的待检测物为黄曲霉毒素M1、三聚氰胺小分子或疟疾抗原；与待测物对应的特异性抗体为抗黄曲霉毒素M1、抗三聚氰胺抗体和抗疟疾抗原的抗体。
4.根据权利要求1所述的基于桥联抗体偶联荧光微球的荧光检测器件，其特征在于：所述的检测线为两条，分别包被有黄曲霉毒素M1抗原和三聚氰胺抗原。
5.根据权利要求1或2所述的基于桥联抗体偶联荧光微球的荧光检测器件，其特征在于：所述桥联抗体偶联荧光微球包埋的荧光基团为镧系元素。
6.根据权利要求1或2所述的基于桥联抗体偶联荧光微球的荧光检测器件，其特征在于：所述的质控线上包被有抗鼠源性单抗的二抗或鼠源性单抗，所述质控线上抗鼠源性单抗的二抗或鼠源性单抗的包被量为0.01-0.14μg/cm质控线。
7.根据权利要求1或2所述的基于桥联抗体偶联荧光微球的荧光检测器件，其特征在于：所述的桥联抗体偶联荧光微球上桥联抗体和特异性识别各检测物的抗体的摩尔比为(100-10000)：1。
8.根据权利要求1所述的基于桥联抗体偶联荧光微球的荧光检测器件，其特征在于：所述荧光微球的粒径为500nm-1μm，为聚苯乙烯荧光微球，荧光微球包埋有荧光基团，表面修饰有羧基，所述的荧光微球通过表面羧基和桥联抗体的氨基共价结合，得到微球-桥联抗体偶联物；再加入特异性识别检测物的抗体，桥联抗体和特异性识别检测物的抗体结合，获得荧光微球-桥联抗体-特异性抗体偶联物荧光微球即基于桥联抗体偶联荧光微球，实现特异性抗体在微球上的标记。
9.一种基于桥联抗体偶联荧光微球的检测器件检测待测物含量的方法，包括下步骤：
将修饰有桥联抗体和特异性抗体的桥联抗体偶联荧光微球加入到样品提取液中，插入试纸条，室温反应；
测试试纸条检测线的荧光强度，基于荧光强度-待测物浓度关系曲线，获得待测样品提取液中待测物的含量。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于：室温反应时间为10min；所述荧光强度-待测物浓度关系曲线的获得方法：用空白样品液或空白样品提取液加标配制一系列待测物的标准品溶液，在上述加标样品液中加入修饰有桥联抗体和特异性抗体的桥联抗体偶联荧光微球，插入试纸条，反应一段时间后，读取检测线上的荧光强度，以标准品浓度为横坐标，荧光强度为纵坐标，绘制荧光强度-待测物浓度信号响应曲线。
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