CN105652008B - 人Lp‑PLA2生物素‑链霉亲和素荧光免疫层析检测卡及其制备方法 - Google Patents

人Lp‑PLA2生物素‑链霉亲和素荧光免疫层析检测卡及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种人Lp‑PLA2生物素‑链霉亲和素荧光免疫层析检测卡及其制备方法；旨在提供一种能快速结合，而且反应不受外界干扰，具有高度特异性和稳定性的检测卡及其制备方法；其技术方案是这样的：该人Lp‑PLA2生物素‑链霉亲和素荧光免疫层析检测卡，所述的检测试纸包括底板，所述的底板上衔接样品垫，标记垫、包被膜和吸收垫，其特征在于，所述的标记上偶联荧光微球的抗Lp‑PLA2单克隆抗体1和偶联生物素抗Lp‑PLA2单克隆抗体2；所述的包被膜上设有一条链霉亲和素检测线T线和一条羊抗鼠多克隆抗体质控线C线，两条线平行排列；属于荧光免疫层析检测领域。

Description

人Lp-PLA2生物素-链霉亲和素荧光免疫层析检测卡及其制备 方法
技术领域
本发明公开了一种检测试剂卡，具体的说是，一种测定人血清、血浆或全血等样本中的脂蛋白相关磷脂酶A2检测试剂卡，属于荧光免疫层析检测领域。
背景技术
近年来，随着人们生活水平的提高，心脑血管疾病的发病率和死亡率都呈逐年上升的趋势。心脑血管报告指出，我国心脑血管病现患人数达2.9亿，每5个成年人就有1人患心脑血管病，每10秒钟就有1人死于心脑血管病，因此预防治疗心脑血管疾病已经刻不容缓。
心脑血管疾病的基础是动脉粥样硬化，而动脉粥样硬化是一种炎性反应性疾病，在动脉粥样斑块的形成、进展和破裂的过程中均有炎性反应介质的参与，目前国际上已经发现了一种新的炎性标志物，即Lp-PLA2。
Lp-PLA2，属于磷脂酶A2家族，主要由炎症细胞分泌。Lp-PLA2是由441个氨基酸组成的蛋白质，其分子量为45KDa。它能水解低密度脂蛋白上的氧化卵磷脂，生成促炎物质溶血磷脂酰胆碱和氧化型游离脂肪酸，能促进动脉粥样硬化的形成和发展。
Lp-PLA2的检测能直接准确的反映血管内炎症的程度，并且可作为一个动态指标，确定动脉粥样硬化疾病的进程；通过监测Lp-PLA2水平的变化，可以了解发生粥样硬化相关的心脑血管栓塞性疾病的风险，并及时采取预防和治疗措施。
目前，Lp-PLA2的检测方法主要有以下五种方法：
(1)酶联免疫分析法，该方法的检测灵敏度较高，但是操作过程繁琐，测定时间较长，不太适合临床应用。
(2)连续监测法，该方法是根据酶的特性及定量原理，测定酶活力，然而许多因素会干扰酶促反应过程，如时间、温度、pH、抗凝剂等；此法对配制的底物浓度要求严格，所需仪器设备昂贵。
(3)化学发光酶免疫分析法，中国专利申请No.201510225148.X公开了一种基于化学发光法检测Lp-PLA2试剂盒。该方法灵敏度高，但操作繁琐，需要特殊的发光底物-抗原/抗体连接物、容易出现交叉污染、需要大型分析仪器、试剂成本较高等缺点，限制了其大规模的发展使用。
(4)胶体金检测法，该方法操作简单，但是灵敏度低，特别是样本中被测物质浓度过低时很可能会出现漏检的情况，不利于心血管栓塞性疾病的预防。
(5)普通免疫层析法，中国专利申请No.201310242801.4公开了一种检测人Lp-PLA2蛋白的荧光免疫层析试纸。该方法操作简单，但是灵敏度低，采用的荧光物质为异硫氰酸荧光素、四乙基罗丹明、四甲基异硫氰酸罗丹明、5-羧基-X-罗丹明。异硫氰酸荧光素的最大吸收光波长为490～495nm，最大发射光波长为520～530nm，呈现黄绿色荧光；罗丹明最大吸收光波长为570nm，最大发射光波长为595～600nm，呈现橘红色荧光。这些荧光物质的荧光寿命比较短，Stokes位移小，只有几十纳米，激发光谱和发射光谱通常有部分重叠，互相干扰严重。
发明内容
针对上述问题，本发明的目的是提供一种人Lp-PLA2生物素-链霉亲和素荧光免疫层析检测卡，该检测卡能快速结合，而且反应不受外界干扰，具有高度特异性和稳定性。
本发明提供的第一个技术方案是这样的：
一种人Lp-PLA2生物素-链霉亲和素荧光免疫层析检测卡，所述的检测试纸包括底板，所述的底板上衔接样品垫，第一标记垫、第二标记垫、包被膜和吸收垫，其特征在于，所述的标记垫包括第一标记垫和第二标记垫，所述的第一标记垫偶联荧光微球的抗Lp-PLA2单克隆抗体1，所述的第二标记垫偶联生物素抗Lp-PLA2单克隆抗体2；所述的包被膜上设有一条链霉亲和素检测线T线和一条羊抗鼠多克隆抗体质控线C线，两条线平行排列。
为制备上述人Lp-PLA2生物素-链霉亲和素荧光免疫层析检测卡，本发明提供的第二个技术方案是这样的：
在PVC底上依次衔接样品垫，第一标记垫、第二标记垫、包被膜和吸收垫，其特征在于，所述的第一标记垫的制备方法是将标记好的偶联荧光微球的抗Lp-PLA2抗体1的溶液喷至第一标记垫；所述的第二标记垫的制备方法是将偶联生物素的抗Lp-PLA2抗体2的溶液喷至第二标记垫上，放入35-40℃烘箱，干燥2～5小时；所述的包被膜的制备方法是：在硝酸纤维素膜上缘，用0.01M PH7.4的PBS将羊抗鼠多克隆抗体稀释到0.8-1.2mg/mL进行包被划线；在硝酸纤维素膜下缘，用0.01M PH9.5的碳酸盐缓冲液将链霉亲和素稀释到4-6μg/mL进行包被划线；
其中：
所述的偶联荧光微球的抗Lp-PLA2抗体1的制备方法依次包括下述步骤：
1)向1ml 0.1M的2-(N-吗啡啉)乙磺酸加入0.24-0.36mg 0.3μM稀土元素荧光微球；再加入24-36μL，8-12mg/mL的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸溶液和24-36μL 40-60mg/ml N-羟基琥珀酰亚胺，室温震荡反应1～2小时，离心弃上清，收集沉淀,用0.1M的MES缓冲液重悬，超声分散微球；
2)取15μg抗Lp-PLA2单克隆抗体1加入至步骤1)中，室温震荡反应1～2小时；
3)按16-25μg/1mL的量，向步骤2)中加入牛血清白蛋白，封闭未偶联抗体的活化羧基位点，反应30～60min；
4)将偶联抗体的荧光微球溶液离心分离后弃去上清，加入500μL抗体保存液；
所述的偶联生物素的抗Lp-PLA2抗体2的制备方法依次包括下述步骤：
1)用DMSO配制浓度8-12mg/ml N-羟基琥珀酰亚胺生物素溶液；
2)用硼酸盐缓冲液配制浓度为1～3mg/ml的抗体溶液；
3)向步骤2)的每毫升的抗体溶液中加入80-120μg步骤1)制备N-羟基琥珀酰亚胺生物素溶液，混合均匀并放入34-40℃恒温箱中避光温育25-35min，
4)向步骤3)每微克N-羟基琥珀酰亚胺生物素溶液加入0.16μL 1mol/L的氯化铵，室温孵育10min后，用PBS透析除去未结合的生物素，收集样品；
5)将样品上1ml的分子筛柱，再加0.2ml硼酸盐缓冲液至分子柱中，吹打，将滤芯倒转放置于另一个离心管中，离心分离并且收集离心管中的溶液，即为生物素标记的抗体，置4℃保存。
进一步的，上述的一种人Lp-PLA2生物素-链霉亲和素荧光免疫层析检测卡的制备方法，所述的样品垫的制备方法是将样品垫浸泡在样品垫缓冲液中，1小时之后取出，于室温干燥16-18小时。
进一步的，上述的一种人Lp-PLA2生物素-链霉亲和素荧光免疫层析检测卡的方法，所述的样品垫缓冲液是含2wt％BSA、0.5wt％蔗糖、0.5wt％Tween的0.01M PB缓冲液。
进一步的，上述的一种人Lp-PLA2生物素-链霉亲和素荧光免疫层析检测卡的方法，所述的偶联荧光微球的抗Lp-PLA2抗体1的溶液和的偶联生物素的抗Lp-PLA2抗体2的溶液的喷量均为1～5μL/cm。
进一步的，上述的一种人Lp-PLA2生物素-链霉亲和素荧光免疫层析检测卡的制备方法，所述的抗Lp-PLA2抗体1源于人Lp-PLA2抗原表位肽(1)，所述的人Lp-PLA2抗原表位肽(1)的序列氨基酸序列SEQ ID NO.1所示。
进一步的，上述的一种人Lp-PLA2生物素-链霉亲和素荧光免疫层析检测卡的制备方法，所述的抗Lp-PLA2抗体2来源于人Lp-PLA2抗原表位肽(2)：所述的人Lp-PLA2抗原表位肽(1)的序列氨基酸序列SEQ ID NO.2所示。
进一步的，上述的一种人Lp-PLA2生物素-链霉亲和素荧光免疫层析检测卡的制备方法，所述的质控线C线和检测线T线包被时的划线浓度均为为1μL/cm，速度100mm/s。
进一步的，上的一种人Lp-PLA2生物素-链霉亲和素荧光免疫层析检测卡的方法，所述的2-(N-吗啡啉)乙磺酸的pH6.5。
进一步的，上述的一种人Lp-PLA2生物素-链霉亲和素荧光免疫层析检测卡的制备方法，所述的抗体保存液为含1wt％BSA，20wt％蔗糖，0.1wt％吐温-20和0.1wt％聚乙烯吡咯烷酮的0.05M的pH9.0的Tris-HCl缓冲液。
与现有技术相比，本发明提供的技术方案具有如下有益效果：
(1)本发明提供的技术方案采用用链霉亲和素替代抗体包被硝酸纤维素膜，可避免抗体包被硝酸纤维素膜时容易发生失活(或不易保存)的现象。
(2)本发明提供的技术方案通过生物素将抗体结合于链霉亲和素包被的硝酸纤维素膜上，可克服传统双抗体夹心法由于包被的抗体结合能力不足产生的钩状效应，使检测范围增宽。
生物素标记捕获抗体、荧光微球标记检测抗体和样品中的抗原三者在标记垫上形成复合物后，再通过生物素结合于链霉亲和素包被的硝酸纤维素膜上。由于链霉亲和素与生物素之间亲和力极强，并且具有高度的特异性和稳定性，生物素化抗体分子上连有多个生物素，因此，最终形成的抗体-抗原-生物素化抗体-亲和素复合物，可积聚大量荧光微球，因而可提高检测灵敏度。
(4)采用两层标记垫，使抗原先与标记荧光微球的抗体充分结合后，再与偶联生物素的抗体结合，与一层标记垫相比，有利于提高检测灵敏度。
(5)采用时间分辨荧光物质的荧光免疫层析技术，将特异性荧光与非特异性性荧光分辨开来，荧光微球中含有铕离子，紫外光激发能够产生具有较高量子产率、较大Stokes位移、较窄发射光谱，避免激发光谱和荧光发射光谱以及生物基质发射的光谱重合。
附图说明
图1是本发明提供的一种人Lp-PLA2生物素-链霉亲和素荧光免疫层析检测卡结构示意图；
图2生物素-链霉亲和素免疫层析法检测原理；
图3生物素-链霉亲和素免疫层析法与普通免疫层析法线性比较曲线；
图中符号代表元件或类似元件如下：底板1，样品垫2，第一标记垫31，第二标记垫32，包被膜4，吸收垫5。
具体实施方式
下面结合具体实施例的方式对本发明型的权利要求做进一步的详细说明，但并不构成对本发明型的任何限制，任何人在本发明型权利要求范围内所做的有限次的修改，仍在本发明型的权利要求范围之内。
实施例1
本发明提供的一种人Lp-PLA2生物素-链霉亲和素荧光免疫层析检测卡，请参阅图1，所述的检测试纸包括底板1，底板1为PVC底板，在底板1上依次衔接有样品垫2、偶联荧光微球的抗Lp-PLA2单克隆抗体1的第一标记垫31，偶联生物素抗Lp-PLA2单克隆抗体2的第二标记垫32、包被膜4和吸收垫5，在包被膜4上设有一条链霉亲和素检测线T线和一条羊抗鼠多克隆抗体质控线C线，两条线平行排列。为了达到快速、准确的检测结果，所述的样品垫2优选玻璃纤维样品垫；所述的包被膜4优选硝酸纤维素膜；所述的标记垫3为聚酯纤维素膜。
更具体的说，所述的包被膜4压贴在底板1中间部位，包被膜4的两端分别与吸收垫5和第二标记垫32相互交叠连接，第一标记垫32粘附于标记垫31下缘，在标记垫31下缘标记垫上压贴有样品垫2。
样品垫2覆盖在标记垫31上2mm左右，链霉亲和素检测线T线距离包被膜4下端10mm，羊抗鼠多克隆抗体质控线C线距离包被膜4上端10mm，C、T线间距5mm，吸收垫压在包被膜2mm处。
该Lp-PLA2生物素-链霉亲和素荧光免疫层析检测卡的制备方法，其中：
(1)样品垫2的制备方法如下：
将样品垫裁成20mm×300mm的大小，浸泡在样品垫缓冲液中，1小时之后取出，于室温干燥16-18小时。
样品垫的缓冲液配方如下：2％BSA、0.5％蔗糖、0.5％Tween溶解于0.01M PB(pH7.4)缓冲液中。
(2)标记垫的制备方法如下：
将聚酯纤维素膜裁为7mm×300mm，将标记好的偶联荧光微球的抗Lp-PLA2抗体1和偶联荧光微球的抗Lp-PLA2抗体2，分别用喷金划膜仪喷至聚酯纤维素膜上，喷量为1～5μL/cm(优选3μL/cm)，放入37℃烘箱，干燥2～5小时。
A：偶联荧光微球标记抗Lp-PLA2抗体1，其具体步骤如下：
①在1ml 0.1M pH6.5的2-(N-吗啡啉)乙磺酸(MES)加入0.3mg 0.3μM稀土元素荧光微球；加入30μL 10mg/mL的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸溶液和30μL50mg/ml N-羟基琥珀酰亚胺，室温震荡反应1～2小时。16000rpm离心30min，弃上清，收集沉淀。
②用1ml的0.1M pH6.5的MES缓冲液重悬，超声分散微球。
③取15μg抗Lp-PLA2单克隆抗体1加入②中，室温震荡反应1～2小时。
④按20μg/1mL的量，向步骤③中加入牛血清白蛋白，封闭未偶联抗体的活化羧基位点，反应30～60min。
⑤将偶联抗体的荧光微球溶液16000rpm离心30min，弃去上清，加入500μL抗体保存液。
所述的保存液为含1wt％BSA，20wt％蔗糖，0.1wt％吐温-20和0.1wt％聚乙烯吡咯烷酮的0.05M的pH9.0的Tris-HCl缓冲液。
B：偶联生物素的抗Lp-PLA2抗体2的制备步骤如下：
①用无水DMSO配制10mg/ml N-羟基琥珀酰亚胺生物素(BNHS)溶液。
②用硼酸盐缓冲液(0.1mol/L，pH8.8)配制浓度至少为1～3mg/ml的抗体溶液，若抗体储存时加入了叠氮钠，则标记前须先在硼酸盐缓冲液中充分透析以除去叠氮钠。
③向1mg抗体溶液中加入100μgN-羟基琥珀酰亚胺生物素，混合均匀并放入37℃恒温箱中避光温育30min。在完成结合反应之前DMSO的终浓度不能低于5％，否则生物素酯会出现沉淀。
④每25μg N-羟基琥珀酰亚胺酯加入4μL 1mol/L的氯化铵，室温孵育10min。
⑤将上述溶液用PBS充分透析，以除去未结合的生物素。由于生物素分子较大，故透析比预料中的要慢。
⑥将样品上1ml分子筛柱，加0.2ml硼酸盐缓冲液至分子筛柱中，轻轻吹打。将滤芯倒转放置于另一个离心管中，6,000x g离心10min。收集离心管中的溶液，即为生物素标记的抗体；
⑦最后，样品加入叠氮钠(终浓度0.5g/L)及1.0g/L BSA。将结合产物置4℃，避光保存，亦可加入50％重蒸甘油，置-20℃保存。
(3)包被膜4的制备方法是：
①包被
质控线(C线)：C线与硝酸纤维素膜上缘的距离为10mm，用0.01M的PBS(pH7.4)将羊抗鼠多克隆抗体稀释到1.0mg/mL进行包被，划线浓度为1μL/cm，速度100mm/s。
检测线(T线)：C线和T线的距离为5mm，T线与硝酸纤维素膜下缘的距离为10mm，用0.01M的碳酸盐缓冲液(pH9.5)将链霉亲和素稀释到5μg/mL进行包被，划线浓度为1μL/cm，速度100mm/s。
②干燥
放入37℃烘箱，干燥2～5小时。
Lp-PLA2生物素-链霉亲和素荧光免疫层析检测卡的组装方法如下：
各组件在底板上的排列顺序依次为吸收垫5—硝酸纤维素膜4—第二标记垫32—第一标记垫31—样品垫2
①吸收垫5的粘贴：将底板平铺于工作台面上；轻轻揭开底板上缘吸收垫粘贴处的保护膜，将吸收垫粘附于其上，均匀、轻微滚动式推进，以加强粘合力，并防止产生气泡，吸收垫覆盖在硝酸纤维素膜上2mm。
②标记垫粘贴：轻轻揭开硝酸纤维素膜下缘标记垫粘贴处的保护膜，将第一标记垫31粘附于其上.再粘上第二标记垫32，方法同吸收垫5，标记垫3覆盖在硝酸纤维素膜上2mm
③样品垫的粘贴：将样品垫粘附于第一标记垫31下部，方法同吸收垫。
④试纸条切割：将粘贴好的底板切成4.0mm宽的试纸条。
⑤装卡与入袋：将每一试纸条装入塑料卡内，将每一试剂卡置于铝膜袋中，并加入1g干燥剂1包，热合封口。
本发明采用了荧光免疫层析技术。其原理如下，请参阅图2所示：当血清、血浆、全血样本加入样品孔时，由于毛细管作用样品将沿着试剂条向吸收垫端移动，当样品中有Lp-PLA2时，样品中的Lp-PLA2首先与第一标记垫31中偶联荧光微球的抗Lp-PLA2单克隆抗体1特异性结合，继续层析，再与第二标记垫32中偶联生物素抗Lp-PLA2单克隆抗体2发生特异结合，形成双抗体夹心结构；然后继续移动与包被在硝酸纤维素膜上的链霉亲和素结合，从而形成链霉亲和素-生物素-抗体2-Lp-PLA2抗原-荧光微球抗体1复合物。由于链霉亲和素由4个相同的亚基组成，能结合4个分子的生物素，与传统的双抗体夹心反应，可以起到信号放大的作用，进一步提高了检测灵敏度。
检测原理：
由于人Lp-PLA2蛋白质共有441个氨基酸，预测其表位，获得两个较好的表位肽，SEQ ID NO.1所示
表位肽1：79-92(14aa)
(1)Thr-Phe-Leu-Arg-Leu-Tyr-Tyr-Pro-Ser-Gln-Asp-Asn-Asp-Arg
表位肽2SEQ ID NO.2所示:133-145(14aa)
(2)Asn-Trp-Asn-Ser-Pro-Leu-Arg-Pro-Gly-Glu-Lys-Tyr-Pro-Leu
ELISA鉴定表位肽免疫反应性，两段表位肽与相应的Lp-PLA2抗体的反应效价均>1ⅹ104。
其中：所述双抗体夹心法采用标记有荧光微球的Lp-PLA2单克隆抗体1作为捕获抗体，所述Lp-PLA2单克隆抗体1来源于人Lp-PLA2抗原表位肽(1)；所述标记有生物素的Lp-PLA2单克隆抗体2来源于人Lp-PLA2抗原表位肽(2)；所述人Lp-PLA2抗原表位肽(1)和(2)分别为：
(1)Thr-Phe-Leu-Arg-Leu-Tyr-Tyr-Pro-Ser-Gln-Asp-Asn-Asp-Arg
(2)Asn-Trp-Asn-Ser-Pro-Leu-Arg-Pro-Gly-Glu-Lys-Tyr-Pro-Leu
Lp-PLA2单克隆抗体1是由Lp-PLA2抗原①制备而成的，该Lp-PLA2抗原①是通过使所述人Lp-PLA2抗原表位肽(1)与载体蛋白偶联制备而成的；并且所述Lp-PLA2单克隆抗体2是由Lp-PLA2抗原②制备而成的，该Lp-PLA2抗原②是通过使所述人Lp-PLA2抗原表位肽(2)与载体蛋白偶联制备而成的。
所用的Lp-PLA2单克隆抗体1、Lp-PLA2单克隆抗体2均购自上海领潮生物科技有限公司。
该Lp-PLA2生物素-链霉亲和素荧光免疫层析检测卡的具体使用方法：
打开仪器，插入与试剂批号相同的芯片；使用时除去试剂卡外包装，取出试剂卡，水平放置；精确吸取75μl血清/血浆，或100μl全血，加入到检测卡的加样孔中，然后开始计时；待室温反应10min后，将检测卡放入到仪器的卡槽中；点击仪器上的“测试”按键，仪器将开始测试，并显示结果；点击“打印”，可打印检测结果报告。
当血清、血浆、全血加入样品孔时，由于毛细管作用样品将沿着试剂条向吸收垫端移动，当样品中有Lp-PLA2时，样品中的Lp-PLA2可与第一标记垫31中偶联荧光微球的抗Lp-PLA2单克隆抗体1发生特异性结合，继续移动，再与第二标记标记垫32中偶联生物素抗Lp-PLA2单克隆抗体2发生特异结合，形成双抗体夹心结构，然后继续移动与包被在硝酸纤维素膜上的链霉亲和素结合，从而形成链霉亲和素-生物素-抗体1-Lp-PLA2抗原-抗体2复合物。用荧光读卡仪对其进行检测，即可测出样本中Lp-PLA2的含量，进行心血管疾病的早期预防。
结果判断：Lp-PLA2是血管内皮炎症、心脑血管栓塞性疾病标志物，如果Lp-PLA2测试值小于175ng/ml时，为正常水平，Lp-PLA2测试值大于175ng/ml时，提示该病人可能有患心梗死风险；质控线未出现荧光，则代表操作有误或检测结果无效，需重复试验。
为了更好的说明本发明型的有益效果，下面给出采用本发明提供的检测试剂与传统的酶联免疫分析法，连续监测法，化学发光酶免疫分析法，胶体金法、普通免疫层析法在检测Lp-PLA2时的结果对比实验，如表1、图3所示。
表1不同Lp-PLA2检测试剂性能比较
综上所述，本发明提供的技术与酶联免疫分析法相比：酶联免疫分析法要5-6小时，本发明型只需要10-15min，大大缩短了检测时间，提高了工作效率；与连续监测法相比：其检测结果更加准确，并且不需要大型仪器设备，无需专门技术人员操作，节约了检测成本；与胶体金法相比：提高了灵敏度和检出率，胶体金检测试剂的灵敏度为100ng/mL，本发明型检测试剂的灵敏度为5ng/mL，明显优于胶体金法；与普通免疫层析法比较，检测范围更宽，普通免疫层析法的检测范围为20～1000ng/ml。本发明型检测试剂的检测范围为8～1500ng/ml，优于普通免疫层析法。

Claims (9)

1.一种人Lp‐PLA2生物素‐链霉亲和素荧光免疫层析检测卡，所述的检测试纸包括底板，所述的底板上衔接样品垫，第一标记垫、第二标记垫、包被膜和吸收垫，其特征在于，所述的标记垫包括第一标记垫和第二标记垫，所述的第一标记垫偶联荧光微球的抗Lp‐PLA2单克隆抗体1，所述的第二标记垫偶联生物素抗Lp‐PLA2单克隆抗体2；所述的包被膜上设有一条链霉亲和素检测线T线和一条羊抗鼠多克隆抗体质控线C线，两条线平行排列；
所述的第一标记垫的制备方法是将标记好的偶联荧光微球的抗Lp‐PLA2抗体1的溶液喷至第一标记垫；所述的第二标记垫的制备方法是将偶联生物素的抗Lp‐PLA2抗体2的溶液喷至第二标记垫上，放入35‐40℃烘箱，干燥2～5小时；所述的包被膜的制备方法是：在硝酸纤维素膜上缘，用0.01M PH7.4的PBS将羊抗鼠多克隆抗体稀释到0.8‐1.2mg/mL进行包被划线；在硝酸纤维素膜下缘，用0.01M PH9.5的碳酸盐缓冲液将链霉亲和素稀释到4‐6μg/mL进行包被划线；
其中：
所述的偶联荧光微球的抗Lp‐PLA2抗体1的制备方法依次包括下述步骤：
1)向1ml 0.1M的2‐(N‐吗啡啉)乙磺酸加入0.24‐0.36mg 0.3μM稀土元素荧光微球；再加入24‐36μL，8‐12mg/mL的1‐(3‐二甲氨基丙基)‐3‐乙基碳二亚胺盐酸溶液和24‐36μL 40‐60mg/ml N‐羟基琥珀酰亚胺，室温震荡反应1～2小时，离心弃上清，收集沉淀,用0.1M的MES缓冲液重悬，超声分散微球；
2)取15μg抗Lp‐PLA2单克隆抗体1加入至步骤1)中，室温震荡反应1～2小时；
3)按16‐25μg/1mL的量，向步骤2)中加入牛血清白蛋白，封闭未偶联抗体的活化羧基位点，反应30～60min；
4)将偶联抗体的荧光微球溶液离心分离后弃去上清，加入500μL抗体保存液；
所述的偶联生物素的抗Lp‐PLA2抗体2的制备方法依次包括下述步骤：
1)用DMSO配制浓度8‐12mg/ml N‐羟基琥珀酰亚胺生物素溶液；
2)用硼酸盐缓冲液配制浓度为1～3mg/ml的抗体溶液；
3)向步骤2)的每毫升的抗体溶液中加入80‐120μg步骤1)制备N‐羟基琥珀酰亚胺生物素溶液，混合均匀并放入34‐40℃恒温箱中避光温育25‐35min，
4)向步骤3)每微克N‐羟基琥珀酰亚胺生物素溶液加入0.16μL 1mol/L的氯化铵，室温孵育10min后，用PBS透析除去未结合的生物素，收集样品；
5)将样品上1ml的分子筛柱，再加0.2ml硼酸盐缓冲液至分子柱中，吹打，将滤芯倒转放置于另一个离心管中，离心分离并且收集离心管中的溶液，即为生物素标记的抗体，置4℃保存；
所述的抗Lp‐PLA2抗体1源于人Lp‐PLA2抗原表位肽(1)，所述的人Lp‐PLA2抗原表位肽(1)的氨基酸序列SEQ ID NO.1所示。
2.制备权利要求1所述的一种人Lp‐PLA2生物素‐链霉亲和素荧光免疫层析检测卡的方法，在PVC底上依次衔接样品垫，第一标记垫、第二标记垫、包被膜和吸收垫，其特征在于，所述的第一标记垫的制备方法是将标记好的偶联荧光微球的抗Lp‐PLA2抗体1的溶液喷至第一标记垫；所述的第二标记垫的制备方法是将偶联生物素的抗Lp‐PLA2抗体2的溶液喷至第二标记垫上，放入35‐40℃烘箱，干燥2～5小时；所述的包被膜的制备方法是：在硝酸纤维素膜上缘，用0.01M PH7.4的PBS将羊抗鼠多克隆抗体稀释到0.8‐1.2mg/mL进行包被划线；在硝酸纤维素膜下缘，用0.01M PH9.5的碳酸盐缓冲液将链霉亲和素稀释到4‐6μg/mL进行包被划线；
其中：
所述的偶联荧光微球的抗Lp‐PLA2抗体1的制备方法依次包括下述步骤：
1)向1ml 0.1M的2‐(N‐吗啡啉)乙磺酸加入0.24‐0.36mg 0.3μM稀土元素荧光微球；再加入24‐36μL，8‐12mg/mL的1‐(3‐二甲氨基丙基)‐3‐乙基碳二亚胺盐酸溶液和24‐36μL 40‐60mg/ml N‐羟基琥珀酰亚胺，室温震荡反应1～2小时，离心弃上清，收集沉淀,用0.1M的MES缓冲液重悬，超声分散微球；
2)取15μg抗Lp‐PLA2单克隆抗体1加入至步骤1)中，室温震荡反应1～2小时；
3)按16‐25μg/1mL的量，向步骤2)中加入牛血清白蛋白，封闭未偶联抗体的活化羧基位点，反应30～60min；
4)将偶联抗体的荧光微球溶液离心分离后弃去上清，加入500μL抗体保存液；
所述的偶联生物素的抗Lp‐PLA2抗体2的制备方法依次包括下述步骤：
1)用DMSO配制浓度8‐12mg/ml N‐羟基琥珀酰亚胺生物素溶液；
2)用硼酸盐缓冲液配制浓度为1～3mg/ml的抗体溶液；
3)向步骤2)的每毫升的抗体溶液中加入80‐120μg步骤1)制备N‐羟基琥珀酰亚胺生物素溶液，混合均匀并放入34‐40℃恒温箱中避光温育25‐35min，
4)向步骤3)每微克N‐羟基琥珀酰亚胺生物素溶液加入0.16μL 1mol/L的氯化铵，室温孵育10min后，用PBS透析除去未结合的生物素，收集样品；
5)将样品上1ml的分子筛柱，再加0.2ml硼酸盐缓冲液至分子柱中，吹打，将滤芯倒转放置于另一个离心管中，离心分离并且收集离心管中的溶液，即为生物素标记的抗体，置4℃保存。
3.根据权利要求2所述的一种人Lp‐PLA2生物素‐链霉亲和素荧光免疫层析检测卡的制备方法，所述的样品垫的制备方法是将样品垫浸泡在样品垫缓冲液中，1小时之后取出，于室温干燥16‐18小时。
4.根据权利要求3所述的一种人Lp‐PLA2生物素‐链霉亲和素荧光免疫层析检测卡的制备方法，其特征在于，所述的样品垫缓冲液是含2wt％BSA、0.5wt％蔗糖、0.5wt％Tween的0.01M PB缓冲液。
5.根据权利要求2所述的一种人Lp‐PLA2生物素‐链霉亲和素荧光免疫层析检测卡的制备方法，其特征在于，所述的偶联荧光微球的抗Lp‐PLA2抗体1的溶液和的偶联生物素的抗Lp‐PLA2抗体2的溶液的喷量均为1～5μL/cm。
6.根据权利要求2所述的一种人Lp‐PLA2生物素‐链霉亲和素荧光免疫层析检测卡的制备方法，其特征在于，所述的抗Lp‐PLA2抗体1源于人Lp‐PLA2抗原表位肽(1)，所述的人Lp‐PLA2抗原表位肽(1)的氨基酸序列SEQ ID NO.1所示。
7.根据权利要求2所述的一种人Lp‐PLA2生物素‐链霉亲和素荧光免疫层析检测卡的方法，其特征在于，所述的质控线C线和检测线T线包被时的划线浓度均为为1μL/cm，速度100mm/s。
8.根据权利要求2所述的一种人Lp‐PLA2生物素‐链霉亲和素荧光免疫层析检测卡的制备方法，其特征在于，所述的2‐(N‐吗啡啉)乙磺酸的pH6.5。
9.根据权利要求2所述的一种人Lp‐PLA2生物素‐链霉亲和素荧光免疫层析检测卡的制备方法，其特征在于，所述的抗体保存液为含1wt％BSA，20wt％蔗糖，0.1wt％吐温‐20和0.1wt％聚乙烯吡咯烷酮的0.05M的pH9.0的Tris‐HCl缓冲液。
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