CN101408545A - 三聚氰胺快速检测试纸条和试纸卡 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种三聚氰胺快速检测试纸条和试纸卡。试纸条含有衬板、样品垫、金标结合垫、纤维素膜、吸水垫，试纸条两端粘贴有保护膜，金标结合垫为吸附三聚氰胺金标抗体的玻璃纤维棉，在纤维素膜上有用三聚氰胺－载体蛋白偶联物印制的隐形检测印迹，用羊抗或兔抗小鼠IgG、或羊抗兔IgG印制的隐形对照印迹。将不带保护膜的试纸芯放在特制的壳体中即得到试纸卡，壳体面板上设有加样孔和观察窗。本发明试纸条和试纸卡可现场操作，无需任何其它试剂和仪器，试纸条上加入被检样品液后，在10分钟内即可判定检测结果，并且特异性强、灵敏度高，使用简便、快速、直观、准确，适用范围广、成本较低，易推广应用。

Description

三聚氰胺快速检测试纸条和试纸卡

一、技术领域：

本发明涉及一种快速检测三聚氰胺的器具，特别是涉及一种快速分析三聚氰胺的快速检测试纸条和试纸卡。

二、技术背景：

2007年，在美国发生了多起狗、猫等宠物因食用含三聚氰胺的食品而发生中毒死亡的“毒粮”事件，2008年9月份，我国爆发了性质恶劣、危害严重的因食用含三聚氰胺奶粉导致婴幼儿肾结石甚至肾衰竭的“毒奶粉”事件。三聚氰胺引发的食品安全问题受到了国内外的极大关注。

三聚氰胺(Melamine，MEL)又名蜜胺，氰尿三酰胺，是一种重要的氮杂环有机化工原料，主要用来与甲醛缩合聚合制备三聚氰胺树脂，可用于塑料及涂料工业，也可作纺织物防褶、防缩处理剂。MEL因其分子中含有大量氮元素，以常用的凯氏定氮法测定产品中的蛋白质含量时，不能区分这种伪蛋白，因而一些不良厂家将MEL添加到饲料和食品中，以提高产品中蛋白质的检测数值，降低产品成本，牟取暴利。

目前，国内外测定饲料和食品中MEL的方法，主要是采用理化分析方法，包括高效液相色谱法(High performance liquid chromatography，HPLC)、液相色谱/质谱联用分析法(Liquid chromatography/PBSs spectrometry，LC/MS)、气相色谱/质谱联用分析法(Gas chromatograph/PBSs spectrometry，GC/MS)、电位滴定法、浊度法、重量法、苦味酸法和升华法等。这些检测方法，待检样品需经一系列复杂的处理净化，从样品处理到得出检测结果需要2天以上时间，繁琐费时；同时这些检测方法需要大型专门仪器设备和专业技术人员操作，无法进行现场检测，难以推广。由于这些方法的局限性和严重的滞后性，使监控三聚氰胺的非法使用变得异常困难，无法保证食品安全监控的有效性。

三、发明内容：

本发明要解决的技术问题：提供一种特异强、灵敏度高，能快速、简便地检测三聚氰胺试纸条和试纸卡。

本发明的技术方案是：

一种三聚氰胺快速检测试纸条，含有衬板，衬板上依次固定衔接有样品垫、金标结合垫、包被膜和吸水垫，试纸条两端设有保护层，所述金标结合垫为吸附三聚氰胺金标抗体的玻璃纤维棉，所述包被膜上设有用三聚氰胺偶联载体蛋白溶液印制的隐形检测印迹，包被膜上还设有用羊抗小鼠IgG、兔抗小鼠IgG或羊抗兔IgG溶液印制的隐形对照印迹。

所述衬板为硬质塑胶条或不吸水的硬纸条；所述样品垫为玻璃纤维棉、尼龙膜、聚偏二氟乙烯膜或聚酯膜；所述吸水垫为吸水滤纸或滤油纸；所述包被膜为硝酸纤维素膜、纯纤维素膜或羧化纤维素膜。

所述三聚氰胺金标抗体为胶体金标记的三聚氰胺单克隆抗体或多克隆抗体，所述三聚氰胺偶联载体蛋白为牛血清白蛋白、鸡卵清白蛋白或人血清白蛋白。

所述保护层为保护膜，该保护膜覆盖在样品垫、金标结合垫和吸水垫上，保护膜上印制有样品标记线，该标记线偏向样品垫一侧约0.5cm处。

所述隐形检测印迹和隐形对照印迹排列方式为“||”，或者为“+”，或者为“··”。

一种三聚氰胺快速检测试纸卡，含有壳体和位于壳体内的试纸芯，试纸芯包括衬板以及衬板上依次固定衔接的样品垫、金标结合垫、包被膜和吸水垫，其特征是：所述金标结合垫为吸附三聚氰胺金标抗体的玻璃纤维棉，所述包被膜上设有用三聚氰胺偶联载体蛋白溶液印制的隐形检测印迹，包被膜上还设有用羊抗小鼠IgG、兔抗小鼠IgG或羊抗兔IgG溶液印制的隐形对照印迹。

所述三聚氰胺金标抗体为胶体金标记的三聚氰胺单克隆抗体或多克隆抗体，三聚氰胺偶联载体蛋白为牛血清白蛋白、鸡卵清白蛋白或人血清白蛋白。

所述衬板为硬质塑胶条或不吸水的硬纸条；所述样品垫为玻璃纤维棉、尼龙膜、聚偏二氟乙烯膜或聚酯膜；所述吸水垫为吸水滤纸或滤油纸；所述包被膜为硝酸纤维素膜、纯纤维素膜或羧化纤维素膜。

所述壳体由底座和面盖构成，底座和面盖通过嵌合连在一起，底座上设有放置试纸芯的凹槽，面盖上设有观察窗、加样孔，观察窗与试纸芯的包被膜相对应，加样孔与试纸芯的样品垫相对应。

所述隐形检测印迹和隐形对照印迹排列方式为“||”，或者为“+”，或者为“··”。

本发明的检测试纸条和试纸卡具有下列优点：

①特异性强，敏感性高。该胶体金层析检测试纸条和试纸卡以胶体金标记高亲和力的单克隆抗体为基础制备而成，金标抗体中金颗粒与抗体分子之间无共价键形成，二者通过异性电荷间的范德华力相结合，胶体金标记对单克隆抗体的特异性和亲和力影响很小，且具有较高的标记率。因此，试纸条和试纸卡具有较强的特异性和较高的敏感性，检出MEL最低限量可达到10ppb。

②简便、快速、时效性强。使用胶体金层析检测试纸条和试纸卡，无需任何其它试剂和仪器，可现场操作，试纸条(卡)加入被检样品液后，在10分钟内即可判定检测结果。

③结果显示形象、直观、准确。检测试纸条和试纸卡均以显示棕红色线“|”和“||”作为检测结果阳性和阴性标记，即在包被膜上显示一条棕红色线“|”时，表示在被检样品中含有三聚氰胺，显示两条棕红色线“||”时，表示在被检样品中不含三聚氰胺。结果判定形象、直观、准确，简单明了，不易出现假阳性和假阴性等人为误判。

④节省费用，适用范围广，便于推广。使用检测试纸条和试纸卡，比用仪器分析和进口ELISA试剂盒的费用大幅下降。另外，试纸条和试纸卡的适用范围广，可满足不同层次人员需要，包括实验室检验、口岸检验、集贸市场卫生监督、加工企业和养殖场户等，便于推广应用，具有广阔的市场前景和明显的经济、社会效益。

四、附图说明：

图1、三聚氰胺快速检测试纸条俯视结构示意图。

图2、三聚氰胺快速检测试纸条剖面结构示意图。

图3、三聚氰胺快速检测试纸卡俯视结构示意图。

图4、三聚氰胺快速检测试纸卡剖面结构示意图。

图中，1：衬板，2：样品垫，3：金标结合垫，4：包被膜，5：检测线，6：对照线，7：吸水垫，8-1：样品浸入端保护膜，8-2：手柄端保护膜，9：标识线，10：加样孔，11：观察窗，12：面板，13：试纸芯固定槽，14：底座，15：面板凹槽。

五、具体实施方式：

要制成快速检测三聚氰胺试纸条(卡)，首先要制备偶联三聚氰胺载体蛋白和三聚氰胺金标抗体，从而制备检测线和金标抗体纤维。其次需制备羊抗或兔抗小鼠IgG(或羊抗兔IgG)抗体，用于制备对照线。

(1)三聚氰胺与载体蛋白偶联

采用戊二醛法，将三聚氰胺与载体蛋白进行偶联制备人工结合抗原。

戊二醛法反应偶联，取2mg MEL溶于1mL 1mol/L PBS溶液中，加入30μL戊二醛，常温下搅拌反应1h。然后加入含10mg BSA或OVA或KLH的PBS溶液，RT搅拌反应过夜。反应液用葡聚糖凝胶Sephadex G-25过柱纯化，制得人工结合抗原BSA-MEL或OVA-MEL或HSA-MEL，冻干，-20℃保存备用。

(2)抗三聚氰胺单克隆抗体或多克隆抗体的制备

单抗制备：以50μg～100μg/只的三聚氰胺载体蛋白偶联物免疫6～8周龄Balb/C小鼠3～4次，每次免疫间隔时间3～5周，确定抗体效价符合要求后超强免疫，之后3～4天，将免疫小鼠眶下窦采血，分离阳性血清；脱颈致死，用75％酒精浸泡小鼠5～10min消毒体表，无菌取其脾脏，将脾脏剪碎并研磨，经120目尼龙纱布过滤，1000rpm离心10min，收集脾细胞。将1×10⁸的脾细胞与NS0骨髓瘤细胞按10∶1的比例混合，1000rpm离心10min弃上清，细胞沉淀物于37℃水浴中缓缓加入0.7～1.0mL的50％PEG4000作用1min，然后缓缓加入无血清1640培养基15mL，以终止PEG的作用，37℃水浴5～10min，1000rpm离心10min弃上清，将细胞沉淀物重悬于HAT选择培养基中，并加入96孔细胞培养板孔(100μL～200μL/孔)，置于37℃、5％CO₂培养箱中培养。培养10～14天，用间接ELISA法进行阳性孔筛选，选择强阳性、抑制率高、细胞生长旺盛的孔进行3次有限稀释克隆化，而后扩大培养，建立杂交瘤细胞株。所制备的杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体可特异地与三聚氰胺反应，亲和力常数达到10⁹～10¹⁰，轻链亚型为κ或λ，重链亚型为IgG₁、IgG_2a、IgG_2b、IgG₃，针对三聚氰胺特异抗原决定簇的单克隆抗体，用于制备金标抗体玻璃纤维棉。

多抗制备：用三聚氰胺载体蛋白偶联物免疫新西兰白兔，免疫剂量为200μg～500μg/次，背部皮下分4～6点注射。首免，用无菌PBS溶解三聚氰胺载体蛋白偶联物，与等量FCA混合，充分乳化；加强免疫，用无菌PBS溶解三聚氰胺载体蛋白偶联物，与等量FIA混合，充分乳化，首免后2～3周进行，连续免疫4～5次，每次间隔2～3周，最后一次免疫后10～15天，以ELISA法测定其效价达到10⁵以上时，采血并分离收集高免血清。以饱和硫酸铵盐析法提取IgG抗体，即取1份高免血清加2份PBS(pH7.2)混匀，加等体积饱和硫酸铵溶液混匀，置4℃冰箱12h，4℃、2500rpm离心15min，弃上清，再以适量PBS(pH7.2)溶解沉淀，加饱和硫酸铵溶液至终浓度33％，置4℃冰箱2h，4℃、2500rpm离心15min，弃上清，以适量PBS(pH7.2)溶解沉淀，置4℃冰箱内用PBS(pH7.2)透析48～72h，中间换液数次，4℃、12000rpm离心15min，收集上清，得纯化的抗三聚氰胺多克隆抗体，-20℃冻存，用于制备金标抗体玻璃纤维棉。

(3)三聚氰胺金标抗体和金标抗体玻璃纤维棉的制备

采用柠檬酸钠还原法制备胶体金溶液，即在沸腾的200ML 0.01～0.02％氯金酸溶液中加入新鲜配制的1％柠檬酸钠8mL，获得直径约15nm的胶体金溶液，用0.1mol/L K₂CO₃调pH值至8.5～9.5，置2～8℃保存备用。以1∶2000的标记比将待标记的三聚氰胺单克隆抗体或多克隆抗体加入pH8.5～9.5的金溶胶中，标记10min后，加入20％的PEG10000至终浓度为0.05％，4℃、1500～3000rpm离心20min，除去未结合的胶体金颗粒，4℃、15000rpm离心1h，弃上清，获初步纯化的金标抗体蛋白混合物，再用丙烯葡聚糖S-400柱层析进行分离纯化，获得三聚氰胺胶体金标记抗体。将1∶100～1∶500稀释的胶体金标记抗体吸附于精制玻璃纤维棉中，4℃低温真空干燥，制备三聚氰胺金标抗体玻璃纤维棉。

(4)羊抗或兔抗小鼠IgG抗体的制备

羊抗或兔抗小鼠IgG(或羊抗兔IgG)抗体的制备

以饱和硫酸铵提取三聚氰胺阴性小鼠血清IgG(或阴性兔血清IgG)，即取1份小鼠血清(或兔血清)加2份PBS(pH7.2)混匀，加等体积饱和硫酸铵溶液混匀，置4℃冰箱12h，4℃、2500rpm离心15min，弃上清，再以适量PBS(pH7.2)溶解沉淀，加饱和硫酸铵溶液至终浓度33％，置4℃冰箱2h，4℃、2500rpm离心15min，弃上清，以适量PBS(pH7.2)溶解沉淀，置4℃冰箱内用PBS(pH7.2)透析48h，中间换液3次，4℃、12000rpm离心15min，收集上清，以紫外分光光度计测定其蛋白浓度，以50μg～100μg/kg体重的小鼠血清(或兔血清)IgG经皮下和肌肉注射健康山羊或家兔3～4次，末次注射10天后，以ELISA测定其血清效价达到1∶2000以上时，心脏或动脉采血，分离收集高免血清，以饱和硫酸铵提取羊抗或兔抗小鼠IgG(或羊抗兔IgG)抗体(方法与提取小鼠血清IgG相同，不再重述)，用于三聚氰胺快速检测试纸条对照线的制备。

(5)三聚氰胺快速检测试纸反应原理

当三聚氰胺快速检测试纸测试端加入待测样品溶液后，待测溶液通过虹吸作用带动待测三聚氰胺及金标抗体玻璃纤维棉中的金标抗体一起向包被膜扩散，并最终渗入手柄端吸水垫。在扩散过程中，待测三聚氰胺可与金标抗体相结合，进而封闭金标抗体上三聚氰胺的抗原结合点，阻止金标抗体与纤维素膜上偶联三聚氰胺载体蛋白的检测线结合，不显示检测线，而羊或兔抗小鼠IgG(或羊抗兔IgG)抗体则可与金标抗体结合，形成棕红色对照线“|”，即显示一条棕红色线“|”为阳性表示。反之样品溶液中无三聚氰胺则不能阻止金标抗体与纤维素膜上偶联三聚氰胺载体蛋白的检测线结合，显示棕红色检测线“|”，同样羊抗或兔抗小鼠IgG(或羊抗兔IgG)抗体也与金标抗体结合，显示棕红色对照线“|”，形成两条棕红色线“||”为阴性表示。如果纤维素膜上没有棕红色线显示，则表明试纸条已失效。

实施例一：MEL快速检测试纸条，参见图1和图2。图中衬板1用硬质塑胶条制成；样品垫2用玻璃纤维棉制成；金标结合垫3采用具体实施方式“5”中所述的方法制备，采用有胶体金标记的抗MEL单克隆抗体玻璃纤维棉；包被膜4采用硝酸纤维素膜；隐形检测线5用MEL-载体蛋白偶联物在包被膜4上印制，载体蛋白为牛血清白蛋白BSA；隐形对照线6用兔抗小鼠IgG抗体溶液在包被膜4上印制，两条线平行排列组合为“||”；手柄端的吸水垫7用吸水滤纸制成。将样品垫2、金标结合垫3、包被膜4、手柄端的吸水垫7从右至左依次粘贴固定在塑胶条1上，彼此之间交界处纤维互相搭接。样品端白色保护膜8-1覆盖在样品垫2和金标结合垫3上，黄色保护膜8-2覆盖在手柄端吸水垫7上，测试样品标示线9位于样品垫2与金标结合垫3交界处，即位于对应的白色保护膜8-1上且偏向样品垫2一侧约0.5cm处，在标示线9右侧保护膜上印有箭头及MAX字样，以方便使用。

检测样品制备：

①饲料样将样品磨细，以生理盐水进行1∶2～1∶5稀释，静置沉淀后取上清液，用于检测分析。

②奶样取奶样2ml在15℃条件下3000r/min离心5min，除去上层脂肪，取下层液用生理盐水作1∶2～1∶5稀释，静置沉淀或5000r/min离心5min，取上清液，用于检测分析。

检测方法：将MEL检测试纸条样品端插入待测样品液中，插入深度不超过标记线，约10～20秒钟取出检测试纸条，水平放置，10分钟内观察检测结果。

结果判定：①阳性如果在包被膜上显示有一条棕红色线“|”，表示检测结果为阳性，说明在待测样品中含有MEL；②阴性如果在包被膜上显示有两条棕红色线“||”，表示检测结果为阴性，说明在待测样品中不含MEL；③失效如果在包被膜上没有棕红色线显示，则表明试纸条已失效。

实施例二：检测试纸条结构和实施例一基本相同，不同之处在于：以抗MEL多克隆抗体替代抗MEL单克隆抗体，制备MEL金标抗体和金标结合垫；偶联MEL的载体蛋白为鸡卵清白蛋白OVA，用羊抗兔IgG替代兔抗小鼠IgG抗体溶液在包被膜上制备对照印迹。隐形检测印迹和隐形对照印迹排列为“+”，或者隐形检测印迹和隐形对照印迹排列为“··”。

其它包括检测样品、操作方法和结果判定等均同实施例一，不再重述。

实施例三：检测试纸条结构和实施例一基本相同，不同之处在于：

图中衬板1用硬质塑胶条制成；样品垫2用尼龙膜制成；包被膜4采用纯硝酸纤维素膜；MEL载体蛋白为鸡卵清白蛋白；隐形对照线6用羊抗小鼠IgG抗体溶液在包被膜上印制。

其它包括检测样品、操作方法和结果判定等均同实施例一，不再重述。

实施例四：检测试纸条结构和实施例一基本相同，不同之处在于：

图中衬板1用不吸水的硬纸条制成；样品垫2用聚偏二氟乙烯膜制成；包被膜4采用纯硝酸纤维素膜；MEL载体蛋白为人血清白蛋白；隐形对照线6用羊抗小鼠IgG抗体溶液在包被膜上印制。

其它包括检测样品、操作方法和结果判定等均同实施例一，不再重述。

实施例五：检测试纸条结构和实施例一基本相同，不同之处在于：

图中衬板1用不吸水的硬纸条制成；样品垫2用聚酯膜制成；以抗MEL多克隆抗体替代抗MEL单克隆抗体，制备MEL金标抗体和金标结合垫；包被膜4采用羧化纤维素膜；MEL载体蛋白为人血清白蛋白；隐形对照线6用羊抗兔IgG抗体溶液在包被膜上印制。

其它包括检测样品、操作方法和结果判定等均同实施例一，不再重述。

实施例六：MEL快速检测试纸卡，参见图3、图4。图中衬板1、样品垫2、金标结合垫3、包被膜4、隐形检测线5、隐形对照线6和吸水垫7，其制备方法与实施例一相同，共同组成试纸芯；试纸卡壳体材料为塑料，壳体底座14上设有固定试纸芯的固定槽13；面板12上的加样孔10与试纸芯的样品垫2相对应，加样孔10是滴加待检样品的位置；面板12上设有和底座相结合的凹槽15，在面板12上的观察窗11与试纸芯的包被膜4相对应，是观察判定结果的窗口，其旁边印有T和C，分别与包被膜4上的隐形检测线5和隐形对照线6相对应。

检测样品及检测样品制备和实施例一相同。

检测时，将试纸卡平放，从加样孔滴加待测样品液，10分钟内从观察窗判定检测结果。

结果判定：如在包被膜4上对应T的位置显示有一条棕红色线“|”时，表示检测结果为阳性，说明在待测样品中含有MEL；如在包被膜4上对应T、C的位置显示有两条棕红色线“||”时，表示检测结果为阴性，说明待测样品不含MEL；如在包被膜4上没有棕红色线显示，则表明试纸条已失效。

实施例七：检测试纸卡结构和实施例六基本相同，不同之处在于：以抗MEL多克隆抗体替代MEL单克隆抗体，制备MEL金标抗体和金标结合垫；偶联MEL的载体蛋白为鸡卵清白蛋白OVA，用羊抗兔IgG替代兔抗小鼠IgG抗体溶液在包被膜上制备对照线“|”。

另外，本发明试纸卡的试纸芯中衬板1、样品垫2、金标结合垫3、包被膜4、隐形检测线5、隐形对照线6和吸水垫7，可为实施例一～五的任意一种，试纸卡壳体除塑料外，还可用不吸水的木质或金属等材料制作，以及与本发明构思相同的其他类似变换均属于本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种三聚氰胺快速检测试纸条，含有衬板，衬板上依次固定衔接有样品垫、金标结合垫、包被膜和吸水垫，试纸条两端设有保护层，其特征是：所述金标结合垫为吸附三聚氰胺金标抗体的玻璃纤维棉，所述包被膜上设有用三聚氰胺偶联载体蛋白溶液印制的隐形检测印迹，包被膜上还设有用羊抗小鼠IgG、兔抗小鼠IgG或羊抗兔IgG溶液印制的隐形对照印迹。

2.根据权利要求1所述的试纸条，其特征是：所述衬板为硬质塑胶条或不吸水的硬纸条；所述样品垫为玻璃纤维棉、尼龙膜、聚偏二氟乙烯膜或聚酯膜；所述吸水垫为吸水滤纸或滤油纸；所述包被膜为硝酸纤维素膜、纯纤维素膜或羧化纤维素膜。

3.根据权利要求1所述的试纸条，其特征是：所述三聚氰胺金标抗体为胶体金标记的三聚氰胺单克隆抗体或多克隆抗体，所述三聚氰胺偶联载体蛋白为牛血清白蛋白、鸡卵清白蛋白或人血清白蛋白。

4.根据权利要求1所述的试纸条，其特征是：所述保护层为保护膜，该保护膜覆盖在样品垫、金标结合垫和吸水垫上，保护膜上印制有样品标记线，该标记线偏向样品垫一侧约0.5cm处。

5.根据权利要求1-4任一项所述的试纸条，其特征是：所述隐形检测印迹和隐形对照印迹排列方式为“||”，或者为“+”，或者为“··”。

6.一种三聚氰胺快速检测试纸卡，含有壳体和位于壳体内的试纸芯，试纸芯包括衬板以及衬板上依次固定衔接的样品垫、金标结合垫、包被膜和吸水垫，其特征是：所述金标结合垫为吸附三聚氰胺金标抗体的玻璃纤维棉，所述包被膜上设有用三聚氰胺偶联载体蛋白溶液印制的隐形检测印迹，包被膜上还设有用羊抗小鼠IgG、兔抗小鼠IgG或羊抗兔IgG溶液印制的隐形对照印迹。

7.根据权利要求6所述的试纸卡，其特征是：所述三聚氰胺金标抗体为胶体金标记的三聚氰胺单克隆抗体或多克隆抗体，所述三聚氰胺偶联载体蛋白为牛血清白蛋白、鸡卵清白蛋白或人血清白蛋白。

8.根据权利要求6所述的试纸卡，其特征是：所述衬板为硬质塑胶条或不吸水的硬纸条；所述样品垫为玻璃纤维棉、尼龙膜、聚偏二氟乙烯膜或聚酯膜；所述吸水垫为吸水滤纸或滤油纸；所述包被膜为硝酸纤维素膜、纯纤维素膜或羧化纤维素膜。

9.根据权利要求6所述的试纸卡，其特征是：所述壳体由底座和面盖构成，底座和面盖通过嵌合连在一起，底座上设有放置试纸芯的凹槽，面盖上设有观察窗、加样孔，观察窗与试纸芯的包被膜相对应，加样孔与试纸芯的样品垫相对应。

10.根据权利要求6-9任一项所述的试纸卡，其特征是：所述隐形检测印迹和隐形对照印迹排列方式为“||”，或者为“+”，或者为“··”。

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