CN103353525A

CN103353525A - 金霉素残留检测试纸条及试纸卡

Info

Publication number: CN103353525A
Application number: CN2012105320774A
Authority: CN
Inventors: 邓瑞广; 职爱民; 杨艳艳; 柴书军; 李靓; 杨继飞; 张改平
Original assignee: Henan Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Henan Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2012-12-12
Filing date: 2012-12-12
Publication date: 2013-10-16

Abstract

本发明涉及一种快速检测微量金霉素的胶体金试纸条及试纸卡。它含有底层为支撑层，中间层为吸附层，保护层固定在吸附层上，吸附层从测试端依次为测试端吸附纤维层、吸附金标抗体纤维层、纤维素膜层及手柄端的吸水材料层，其中在纤维素膜层上有用偶联金霉素的载体蛋白溶液印制的直线式检测印迹，用羊抗或兔抗小鼠IgG或羊抗兔IgG抗体溶液印制的直线式对照印迹。金霉素金标抗体为胶体金标记的金霉素单克隆抗体或多克隆抗体，偶联金霉素的载体蛋白溶液为金霉素与载体蛋白偶联的复合溶液。偶联金霉素的载体蛋白为牛血清白蛋白BSA，或鸡卵清白蛋白OVA，或为血蓝蛋白KLH。本发明的试纸条及试纸卡具有特异性强，灵敏度高，简便，直观，准确，适用范围广，成本低，易于推广应用。

Description

金霉素残留检测试纸条及试纸卡

一、技术领域

本发明涉及一种快速检测金霉素残留的器具，特别是涉及一种金霉素残留分析的金标层析检测试纸条及试纸卡。

二、背景技术

金霉素是四环素类(Tetracyclines,TCs)是从链霉菌培养液中提取或经半合成制得的抗菌特性和抗菌谱相似的一类碱性广谱抗生素，TCs在20世纪40年代被发现并显示出良好的抗菌性质，1948年M.D.本杰明和M.达格尔自金黄色链丝菌中首先分离出金霉素，1950年和1953年分别获得土霉素和四环素。金霉素不仅对大多数革兰氏阳性（G+）菌和阴性（G-）菌有抑制作用（高浓度时有杀菌作用），还对立克次体、衣原体、支原体、放线菌及某些原虫均有抑制作用。

由于金霉素具有抗菌范围较广、疗效显著、价格便宜等优点，广泛用于在畜禽、水生生物、药物添加剂等产业领域，可预防和治疗动物疾病、促进动物生长、用于防治肠道感染，带来了可观的经济效益；同时，因为滥用，导致了细菌耐药性的增加等问题，给人类疾病控制和环境控制带来了一系列的难题。另外，食用含金霉素残留的动物食品及其制品后，会引起胃、肠、肝脏的损害、牙齿的染色，以及过敏反应、二重感染、生殖毒性，严重时甚至还会出现中毒死亡现象。

金霉素残留的检测方法中理化检测主要有薄层色谱法(Thin layer chromatography，TLC)、毛细管电泳法(Capillary electrophoresis,CE)、高效液相色谱法(High performance liquid chromatographic，HPLC)、化学发光法(Chemiluminescence,CL)，液相色谱-质谱联用技术(Liquid chromatography-mass spectrometry, LC-MS)等。生物学检测方法主要分为微生物法（Microorganism method，M）、免疫分析法（Immunoassay,IA)等。但这些方法有的需要昂贵的仪器设备，需要熟练的专业人员操作，操作过程复杂，需要时间较长，限制了其应用范围，难以在生产实际中推广应用。免疫试纸法具有半定量和一定的定量能力，可以提供待测物的初步信息，该法灵敏度高，分析过程简单，是需要优先发展的检测技术，但目前金霉素残留试纸检测技术在国内尚属空白，急待研究解决。

三、发明内容

本发明要解决的技术问题：提供一种适用于现场检测的特异、敏感、快速和简便的金霉素微量残留检测试纸卡。

本发明的技术方案：同权利要求书，暂略。

四、发明技术方案

一种金霉素快速检测试纸条及试纸卡，含有壳体和位于壳体内的试纸芯，试纸芯包括衬板以及衬板上依次固定衔接的样品垫、金标结合垫、包被膜和吸水垫，其特征是：所述金标结合垫为吸附金霉素金标抗体的玻璃纤维棉，所述包被膜上设有用金霉素偶联载体蛋白溶液印制的隐形检测印迹，包被膜上还设有用羊抗小鼠IgG、兔抗小鼠IgG或羊抗兔IgG溶液印制的隐形对照印迹。

所述金霉素金标抗体为胶体金标记的金霉素单克隆抗体或多克隆抗体，金霉素偶联载体蛋白为牛血清白蛋白、鸡卵清白蛋白。

所述衬板为硬质塑胶条或不吸水的硬纸条；所述样品垫为玻璃纤维棉、尼龙膜、聚偏二氟乙烯膜或聚酯膜；所述吸水垫为吸水滤纸或滤油纸；所述包被膜为硝酸纤维素膜、纯纤维素膜或羧化纤维素膜。

所述壳体由底座和面盖构成，底座和面盖通过嵌合连在一起，底座上设有放置试纸芯的凹槽，面盖上设有观察窗、加样孔，观察窗与试纸芯的包被膜相对应，加样孔与试纸芯的样品垫相对应。

所述隐形检测印迹和隐形对照印迹排列方式为“︱︱”，或者为“＋”，或者为“··”。

五、发明积极有益效果

本发明的金霉素金标层析检测试纸条及试纸卡具有以下突出优点:

特异性强，敏感性高，最低检出限可达到符合我国金霉素的限量检测要求。

实现了金霉素残留金标层析的快速检测，大大节省了检测时间，在提高工作效率的同时节省了检测成本。

使用本发明时无需其它额外试剂和仪器，用于现场检测在5min内即可判定检测结果，简便、快速。

试纸条及试纸卡以棕红色线条“︱”显示检测结果，判定依据形象、直观，简单明了，不易出现人为误判。

⑤本发明可节省检测费用，适用范围广。使用该发明比用仪器分析和常规单项检测试纸条的费用大幅下降；本发明适用范围广，可满足不同层次人员的需要，包括专业检验、海关检疫、卫生检疫、质量监测、加工企业和养殖场户等，可保持对非法添加金霉素的威慑，保障食品安全，便于推广应用。

六、附图说明：

图1、金霉素快速检测试纸条剖面结构示意图。

图2、金霉素快速检测试纸条俯视结构示意图。

图中，1：衬板，2：样品垫，3：金标结合垫，4：包被膜，5：吸水垫，6：检测线，7：对照线，8-1：样品浸入端保护膜，8-2：手柄端保护膜，9：标识线，

七、具体实施方式

在制备金霉素残留检测层析试纸卡时，需要先制备某种金霉素-载体蛋白结合抗原、金霉素金标物，制备羊抗或兔抗小鼠IgG抗体或羊抗兔IgG抗体，或兔抗载体蛋白IgG抗体，进而制备成试纸芯，并安装在塑料壳底座的固定槽中，最后和面板嵌合在一起。

法制备CTC-载体蛋白结合抗原

称3.1mgBSA用1mlPBS溶解于螺口瓶，称2.6mgCTC用1 mol/L NaOH-0.1mol/LHCL调溶液体系pH为6.5，将CTC溶液缓慢加入到BSA溶液中置于磁力搅拌器上，匀速滴加溶解好的EDC溶液避光搅拌4h，反应产物在常温搅拌下用PBS透析3天，每天换液数次，透析后得到纯化的BSA-CTC。同法，制得人工抗原OVA-CTC。制备BSA-CTC时的反应过程如下。

抗金霉素多克隆抗体及单克隆抗体的制备

多抗制备：用CTC-载体蛋白结合抗原免疫六周龄BALB/c小鼠，免疫剂量为0.2ml/只、50μg/只，采取背部皮下4-6点注射的免疫方式。首免，取PBS（0.22 μm滤膜无菌过滤）溶液溶解免疫原至600μg/ml与等量的弗氏完全佐剂（FCA）混合充分乳化后免疫小鼠，一个月后加强免疫，方法与剂量同首次免疫，不同的是弗氏完全佐剂（FCA）换成弗氏不完全佐剂（FIA）。四次免疫过后十天断尾采血，免疫间隔为一个月，将采到的血样用离心机调至5000rpm，离心5min，分离血清，4℃保存血清进行备用。以阻断ELISA法测定其效价达到10³以上时，采血并分离收集高免血清；

单抗制备：用CTC-载体蛋白结合抗原免疫八周龄BALB/c小鼠四次后采取超强免疫，无菌取其脾细胞并与NS0骨髓瘤细胞杂交融合，置37℃、5%CO₂培养箱中，培养14天，用间接ELISA方法选择强阳性、抑制率高、细胞生长旺盛的孔进行2次有限稀释克隆化，而后扩大培养，建立杂交瘤细胞株，其分泌的单克隆抗体能可特异地与CTC反应。以体内诱生法进行单抗制备，置-20℃冻存备用。

金标物结合垫的制备

金标抗体结合垫的制备：柠檬酸钠还原法为例，首先制备胶体金溶液：在沸腾的200ml 0.01～0.02％氯金酸溶液中加入新鲜配制的1％柠檬酸钠8ml，获得直径约15nm的胶体金溶液，用0.1mol/L 的K2CO3调pH值至8.5～9.5，置2～8℃保存备用；以1:2000的标记比将待标记的单克隆抗体或多克隆抗体加入pH8.5～9.5的金溶胶中，标记10min后，加入20％的PEG10000至终浓度为0.05％，4℃、1500～2000rpm离心20min，除去未结合的胶体金颗粒，4℃、15000rpm离心1h，弃上清，获初步纯化的金标抗体蛋白，再用丙烯葡聚糖S-400柱层析进行分离纯化，获得胶体金标记抗体。将1:100～500稀释的胶体金标记抗体（单克隆抗体或多克隆抗体）吸附于精制玻璃纤维棉中，4℃低温真空干燥，制备金标抗体结合垫。

羊抗或兔抗小鼠IgG（或羊抗兔IgG）抗体的制备

以饱和硫酸铵盐析法提取金霉素阴性小鼠血清IgG（或阴性兔血清IgG），用小鼠血清（或兔血清）IgG以50～100μg/kg体重的剂量经皮下和肌肉注射健康山羊或家兔3～4次，末次注射10天后，测定其血清琼扩效价达到1:40以上时，心脏或动脉采血，分离收集高免血清，以饱和硫酸铵盐析法或硫酸钠法等提取羊抗或兔抗小鼠IgG（或羊抗兔IgG）抗体（方法与提取小鼠血清IgG相同，不再重述），置于-20℃冻存备用。

兔抗载体蛋白IgG抗体的制备

用载体蛋白BSA免疫新西兰白兔，免疫剂量为200～500μg /次，背部皮下分4～6点注射。首免，用无菌PBS溶解BSA，与等量FCA混合，充分乳化；加强免疫，用无菌PBS溶解BSA，与等量FIA混合，充分乳化，首免后2～3周进行，连续免疫3～4次，每次间隔2～3周，末次免疫后10～15天，测定其血清琼扩效价达到105以上时，采血并分离收集高免血清。以饱和硫酸铵盐析法提取抗BSA抗体，置-20℃冻存备用。

试纸卡检测反应原理

由于胶体金标记对象不同，其检测反应原理稍有差异。

当胶体金标记物是抗体时，加入待测样品溶液后，待测溶液通过虹吸作用带动待测物及金标物结合垫中的金标抗体一起向层析膜扩散；在扩散过程中待测药物可与金标抗体相结合，从而封闭了金标抗体上的结合位点，阻止金标抗体被层析膜上的结合抗原检测线拦截，检测线不显示，而羊抗或兔抗小鼠IgG（或羊抗兔IgG）抗体则可拦截金标抗体，显示一条棕红色对照线“︱”，为阳性表示；否则，样品溶液中无待测药物时，则不能阻止金标抗体被层析膜上的结合抗原检测线拦截，显示棕红色检测线“︱”，但羊抗或兔抗小鼠IgG（或羊抗兔IgG）抗体也拦截金标抗体，显示棕红色对照线“︱”，为阴性表示；如果层析膜上没有棕红色线显示，则表明试纸卡已失效。

当胶体金标记物是结合抗原时，加入待测样品溶液后，样品溶液通过虹吸作用带动待测药物及金标物结合垫中的金标结合抗原一起向层析膜扩散，样品中的游离待测药物和抗体竞争性结合，阻止金标结合抗原与层析膜上的抗体检测线结合，检测线不显示，而抗载体蛋白抗体则可拦截金标结合抗原，显示一条棕红色对照线“︱”，为阳性表示；否则，样品溶液中无待测药物时，金标结合抗原到达层析膜上的检测线时即被相应的检测线抗体拦截，显示棕红色检测线“︱”，同时抗载体蛋白抗体也可拦截金标结合抗原，显示棕红色对照线“︱”，为阴性表示；如果层析膜上没有棕红色线显示，则表明试纸卡已失效。

Claims

1.一种金霉素快速检测试纸条及试纸卡，含有衬板，衬板上依次固定衔接有样品垫、金标结合垫、包被膜和吸水垫，试纸条两端设有保护层，其特征是：所述金标结合垫为吸附金霉素金标抗体的玻璃纤维棉，所述包被膜上设有用金霉素偶联载体蛋白溶液印制的隐形检测印迹，包被膜上还设有用羊抗小鼠IgG、兔抗小鼠IgG或羊抗兔IgG溶液印制的隐形对照印迹。

2.根据权利要求1所述的试纸条，其特征是：所述衬板为硬质塑胶条或不吸水的硬纸条；所述样品垫为玻璃纤维棉、尼龙膜、聚偏二氟乙烯膜或聚酯膜；所述吸水垫为吸水滤纸或滤油纸；所述包被膜为硝酸纤维素膜、纯纤维素膜或羧化纤维素膜。

3.根据权利要求1所述的试纸条，其特征是：所述金霉素金标抗体为胶体金标记的金霉素单克隆抗体或多克隆抗体，所述金霉素偶联载体蛋白为牛血清白蛋白、鸡卵清白蛋白。

4.根据权利要求1所述的试纸条，其特征是：所述保护层为保护膜，该保护膜覆盖在样品垫、金标结合垫和吸水垫上，保护膜上印制有样品标记线，该标记线偏向样品垫一侧约0.5cm处。

5.根据权利要求1-4任一项所述的试纸条，其特征是：所述隐形检测印迹和隐形对照印迹排列方式为“︱︱”，或者为“＋”，或者为“··”。

6.一种金霉素快速检测试纸卡，含有壳体和位于壳体内的试纸芯，试纸芯包括衬板以及衬板上依次固定衔接的样品垫、金标结合垫、包被膜和吸水垫，其特征是：所述金标结合垫为吸附金霉素金标抗体的玻璃纤维棉，所述包被膜上设有用金霉素偶联载体蛋白溶液印制的隐形检测印迹，包被膜上还设有用羊抗小鼠IgG、兔抗小鼠IgG或羊抗兔IgG溶液印制的隐形对照印迹。

7.根据权利要求6所述的试纸卡，其特征是：所述金霉素金标抗体为胶体金标记的金霉素单克隆抗体或多克隆抗体，所述金霉素偶联载体蛋白为牛血清白蛋白、鸡卵清白蛋白。

8.根据权利要求6所述的试纸卡，其特征是：所述衬板为硬质塑胶条或不吸水的硬纸条；所述样品垫为玻璃纤维棉、尼龙膜、聚偏二氟乙烯膜或聚酯膜；所述吸水垫为吸水滤纸或滤油纸；所述包被膜为硝酸纤维素膜、纯纤维素膜或羧化纤维素膜。

9.根据权利要求6所述的试纸卡，其特征是：所述壳体由底座和面盖构成，底座和面盖通过嵌合连在一起，底座上设有放置试纸芯的凹槽，面盖上设有观察窗、加样孔，观察窗与试纸芯的包被膜相对应，加样孔与试纸芯的样品垫相对应。

10.根据权利要求6-9任一项所述的试纸卡，其特征是：所述隐形检测印迹和隐形对照印迹排列方式为“︱︱”，或者为“＋”，或者为“··”。