CN103412125A - 铬离子快速检测金标试纸及其制备方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种用于快速检测铬离子的金标试纸及其制备方法与应用。金标试纸底层为支撑层，中间层为吸附层，保护膜固定在吸附层上，吸附层从测试端依次为样品垫、金标抗体结合垫、纤维素膜层及手柄端的吸水垫，在纤维素膜层上设有偶联铬离子的载体蛋白溶液印制的检测印迹，以及用兔抗或羊抗小鼠IgG抗体溶液印制的对照印迹；金标抗体结合垫中包被有胶体金标记的铬离子单克隆抗体。本发明能实现对土壤、水、食品中铬离子污染残留的快速检测，具有特异、敏感、快速、简便、结果形象直观、成本低廉等优点，既可用于大批样品的筛检，又可用于小批样品的快速检测，适用范围广。

Description

铬离子快速检测金标试纸及其制备方法与应用

技术领域

本发明属于免疫学和卫生检验学技术领域，特别是涉及一种用于快速检测铬离子的金标试纸及其制备方法与应用。

背景技术

铬是自然界中广泛存在的一种元素，分布于土壤、大气、水及生物体中，主要以三价铬（Cr³⁺）和六价铬（Cr⁶⁺）的形式存在。铬是人和动物体必须微量元素之一，Cr³⁺具有葡萄糖耐量因子（GTF）的活性，参与调节生物体内胆固醇和糖代谢作用，Cr³⁺缺乏会使机体血管内壁的脂肪产生沉积而导致动脉硬化。但Cr³⁺和Cr⁶⁺又是毒性物质，Cr⁶⁺的毒性是Cr³⁺毒性的100倍，许多研究证实，Cr³⁺具有致癌性和诱发基因突变的毒性作用；Cr⁶⁺具有致癌毒性、黏膜毒性、肝肾毒性。因此，我国《生活饮用水卫生标准》规定饮用水铬离子含量不得超过50ng/mL，食品铬含量（GB14961-94）粮食食品不超过1000 ng/mL，果蔬食品不超过500 ng/mL，动物性食品肉蛋不超过1000ng/mL，铬离子是食品安全监管的重点对象。

由于铬具有良好的性能，在电镀、电池、汽车、航空、颜料、油漆、印刷、塑料等行业中发挥着重要作用，铬环境污染日趋严重，对人体健康的危害也愈来愈大，铬污染超标事件屡有发生，已成为环境污染的公害之一。2011年8月，曲靖铬渣污染事件，地下水的出水口检测出的六价铬含量超标200多倍；2012年4月，铬超标药用胶囊事件造成经济损失达160余亿元。

目前，已建立的食品铬检测技术主要有石墨炉原子吸收光谱法（GFAAS）、火焰原子吸收光谱法（FAAS）、电感耦合等离子体质谱法（ICP-MS）、电感耦合等离子体原子发射光谱法（ICP-AES）、氢化物发生-原子荧光光谱法（HG-AFS）、电化学分析法等，但这些理化分析方法需要昂贵的仪器设备和熟练的专业人员，检测烦琐费时、周期长，费用高，不能现场操作，样品筛检量小等，其应用受到限制。

因此，研制快速、简便、敏感、特异、经济、筛检量大的铬离子快速检测技术，对于减少环境污染、提高食品质量、保障食品安全具有重要意义。

发明内容

本发明要解决的技术问题：针对现有铬离子检测技术的不足，提供一种能够快速、简便、敏感、特异的用于快速检测铬离子的金标试纸；

还提供了铬离子金标试纸的制备方法及其应用。

本发明的技术方案：

一种用于快速检测铬离子的金标试纸，底层为支撑层，中间层为吸附层，保护膜固定在吸附层上，吸附层从测试端依次为样品垫、金标抗体结合垫、纤维素膜层及手柄端的吸水垫，其中在纤维素膜层上设有偶联铬离子的载体蛋白溶液印制的检测印迹和用兔抗或羊抗小鼠IgG抗体溶液印制的对照印迹；所述金标抗体结合垫中包被有胶体金标记的特异性铬离子单克隆抗体。

所述纤维素膜层用硝酸纤维素膜、纯纤维素膜或羧化纤维素膜制成；所述样品垫和金标抗体结合垫用聚偏二氟乙烯膜、尼龙膜、玻璃纤维棉或聚酯膜制成；吸水垫用吸水滤纸制成，支撑层用不吸水的韧性材料制成。

所述                                                

偶联铬离子的载体蛋白为牛血清白蛋白、卵清蛋白、钥孔戚血蓝蛋白、人血清白蛋白和兔血清白蛋白中的一种；检测印迹上偶联铬离子的载体蛋白包被量为1 μL/cm，载体蛋白浓度为1 mg/mL；对照印迹上兔抗或羊抗小鼠IgG抗体溶液的包被量为1 μL/cm，抗体浓度为1 mg/mL；所述检测印迹和对照印迹为平行排列的“︱︱”直线式印迹或“十十”字型排列印迹。

所述保护膜覆盖在样品垫、金标抗体结合垫和吸水垫上，在样品垫与金标抗体结合垫交界处对应的保护膜上偏向样品垫一侧0.3-0.6 cm处印制有样品标记线。

所述偶联铬离子的载体蛋白溶液是由以下方法制备的：

（1）称取10 mg鳌合剂异硫氰酸苄基乙二胺四乙酸ITCBE溶于1 mL 二甲基亚砜DMSO中形成金属鳌合剂溶液；称取18.1mg CrCL₃·6H₂O溶于1 mL浓度为10 mmol/L、pH值为8.0的HEPES缓冲液中，形成Cr³⁺溶液；将金属鳌合剂溶液和Cr³⁺溶液混合，并用NaOH调节pH值至7.0，然后在室温条件下放在摇床上反应12 h，即形成Cr³⁺-ITCBE鳌合物半抗原溶液；

（2）称取20 mg 载体蛋白BSA或OVA溶于1 mL浓度为10 mmol/L、pH值为8.0的HEPES缓冲液中，形成载体蛋白溶液；

（3）取1 mL Cr³⁺-ITCBE鳌合物半抗原溶液加入到1mL载体蛋白溶液中，并用NaOH调节pH值至9.0，室温摇床反应24 h，然后移入透析袋中透析5 d，收集透析液，即形成Cr³⁺-ITCBE-BSA或Cr³⁺-ITCBE-OVA的免疫抗原，收集分装，－20℃冻存备用。 

所述胶体金标记的特异性铬离子单克隆抗体是通过以下方法制备的：

采用柠檬酸盐还原法制备，在三角烧瓶中加入975 mL双蒸水，煮沸后加入15 mL柠檬酸三钠，继续加热5 min，加入10 mL质量浓度为1%的氯金酸，继续加热至溶液呈橘红色，冷却至室温，得到胶体金溶液，4℃保存备用；

取胶体金溶液100 mL，用0.1 mol/L 的K₂CO₃溶液调节胶体金溶液的pH值至8.2，磁力搅拌下逐滴加入浓度为0.2 mg/mL的铬离子单克隆抗体溶液，室温温育20 min，10000 r/min离心30min，弃上清，沉淀物用每升含100 g BSA、浓度为0.02 mol/L 的Na₂B₄O₇溶液稀释，然后10000 r/min离心30 min，得到的沉淀物再用每升含10 g BSA、0.5 g叠氮钠、浓度为0.02 mol/L 的Na₂B₄O₇溶液稀释，即获得胶体金标记的铬离子单克隆抗体，4 ℃保存备用；所得的胶体金溶液中金颗粒的粒径为25 nm，每1 mL胶体金中含有3 ng三价铬离子单克隆抗体。

所述金标试纸的制备方法，其特征是：该方法包括以下步骤：

（1）铬离子载体蛋白偶联物的制备：

称取10 mg鳌合剂异硫氰酸苄基乙二胺四乙酸ITCBE溶于1 mL 二甲基亚砜中形成金属鳌合剂溶液；称取18.1 mgCrCL₃·6H₂O溶于1 mL浓度为10 mmol/L、pH值为8.0的HEPES缓冲液中，形成Cr³⁺溶液；将金属鳌合剂溶液和Cr³⁺溶液混合并用NaOH调节pH值至7.0，然后在室温条件下在摇床上反应12 h，即形成Cr³⁺-ITCBE鳌合物半抗原溶液；

称取20 mg 载体蛋白BSA或OVA，溶于1 mL浓度为10 mmol/L、pH值为8.0的HEPES缓冲液中，形成载体蛋白溶液；

取1 mL Cr³⁺-ITCBE鳌合物半抗原溶液，加入到1 mL载体蛋白溶液中，并用NaOH调节pH值至9.0，室温摇床反应24 h，然后移入透析袋中透析5 d，收集透析液，即形成Cr³⁺-ITCBE-BSA或Cr³⁺-ITCBE-OVA免疫抗原，收集分装，－20 ℃冻存备用；

（2）铬离子金标抗体的制备；

（3）金标抗体结合垫的制备；

（4）检测印迹和对照印迹的制备；

用所得的铬离子载体蛋白偶联物在纤维素膜层上制成检测印迹，用兔抗或羊抗小鼠IgG抗体溶液在纤维素膜层上制成对照印迹；检测印迹上偶联铬离子载体蛋白的包被量为1 μL/cm，载体蛋白浓度为1 mg/mL；对照印迹上兔抗或羊抗小鼠IgG抗体溶液的包被量为1 μL/cm，抗体浓度为1 mg/mL；

将样品垫、金标抗体结合垫、纤维素膜、吸水垫按顺序依次粘贴于支撑层上，切割成免疫金标试纸。

所述的铬离子特异性单克隆抗体由以下方法制备：

免疫动物：以Cr³⁺-ITCBE-BSA为免疫抗原，以Balb/c小鼠作为免疫动物，背部皮下多点注射，免疫剂量为每只每次50～100 μg，首免用弗氏完全佐剂，加强免疫用弗氏不完全佐剂，首免后3周进行第二次免疫，以后间隔2周免疫一次，共免疫5次；

选择细胞融合备用小鼠：间接ELISA检测抗血清中Cr³⁺螯合物多克隆抗体pAb效价，阻断ELISA检测Cr³⁺-EDTA pAb对Cr³⁺-EDTA的半数抑制浓度IC ₅₀，挑选效价最高、IC ₅₀最低的小鼠，超免用于细胞融合；

制备阳性杂交瘤细胞：取NS0骨髓瘤细胞与免疫小鼠脾细胞用PEG溶液进行细胞融合，经过四次有限稀释法亚克隆，获得稳定分泌抗铬离子的单克隆抗体细胞株；

制备单克隆抗体：对经产母鼠腹腔注射杂交瘤细胞株，采集腹水纯化，获得抗铬离子的单克隆抗体。 

所述的金标试纸在快速检测铬离子中的应用。

本发明的积极有益效果：

（1）本发明的金标试纸，检测铬离子速度快，5 min内出检测结果，比理化检测方法（3 d）大大节省检测时间。

（2）本发明的金标试纸，检测方法简便，不需要任何附加仪器和试剂，人人均可操作，携带方便，可现场检测。

（3）本发明的金标试纸，敏感性高，检测灵敏度为5 ng/mL，符合国家限量标准要求，与理化检测方法灵敏度相当。

（4）本发明的金标试纸，特异性强，与其它重金属离子无交叉反应；经济，与理化检测方法相比，检测费用低，其检测成本不到理化分析方法的1/20。

（5）本发明的金标试纸，存储方便，保质期长，且对存储温度要求不高，在2-8℃下有效期为一年，室温干燥条件下保质期为六个月，使用携带方便。

（6）本发明金标试纸的制备方法，制备出了铬离子载体蛋白偶联物，得到了适宜分子结合比的人工免疫抗原和包被抗原，获得了高效价、敏感、特异的抗血清；采用柠檬酸钠还原法制备胶体金溶液，反应过程比较温和，可在常温和中性pH条件下进行，易于操作和控制。

（7）本发明金标试纸的制备方法，制备了抗铬离子高效价、高亲和力、特异性强的单克隆抗体，抗体腹水效价为1∶6.4×10⁵，亲和常数Ka为1.65×10¹⁰L/moL，交叉反应率小于0.05%，为铬离子的痕量快速检测提供了保障。

（8）本发明的铬离子金标试纸可应用于快速检测土壤、水、食品等中铬离子微量残留，具有快速、简便、敏感、特异、经济等特性，既可用于大批样品的筛检，又可进行小批样品的快速检测，不仅为环境、食品安全提供技术支撑，也为食品进出口检验、食品检验执法、环境污染监测评价等提供有效的技术手段和检测方法，对于提高食品安全、保障人民身心健康、保持环境友好与可持续发展具有重要现实意义，该发明的实施将具有显著的经济效益和社会效益。

附图说明

图1为本发明金标试纸的俯视结构示意图。

图2为图1金标试纸的侧面结构示意图。

图3为铬离子载体蛋白偶联物合成的技术路线图。

图中，1为支撑层，2为样品垫，3为金标抗体结合垫，4为纤维素膜层，5为吸水垫，6为检测印迹，7为对照印迹，8-1为测试端保护膜，8-2为手柄端保护膜，9为样品标记线。

具体实施方式

以下用实施例具体说明本发明，但是并不表示对本发明的任何限制，如没有特别说明，其中的百分含量均为重量百分含量。

要制备铬离子金标试纸，首先要制备铬离子的人工免疫抗原，之后免疫Balb/c小鼠，制备抗铬离子的单克隆抗体，在此基础上组装成金标试纸。

实施例一、Cr³⁺离子人工免疫抗原的制备与鉴定

（一）抗原制备

（1）称取10 mg鳌合剂ITCBE溶于1 mL 二甲基亚砜中，形成金属鳌合剂溶液；称取18.1 mgCrCL₃·6H₂O溶于1 mL浓度为10 mmol/L、pH值为8.0的HEPES缓冲液中，形成Cr³⁺溶液；将金属鳌合剂溶液和Cr³⁺溶液混合并用NaOH调节pH值至7.0，然后在室温条件下放在摇床上反应12 h，即形成Cr³⁺-ITCBE鳌合物半抗原溶液；

（2）称取20 mg 载体蛋白BSA，溶于1 mL浓度为10 mmol/L、pH值为8.0的HEPES缓冲液中，形成载体蛋白溶液；

（3）取1 mLCr³⁺-ITCBE鳌合物半抗原溶液加入到1 mL载体蛋白溶液中，并用NaOH调节pH值至9.0，室温摇床反应24 h，然后移入透析袋中透析5 d，收集透析液，即形成Cr³⁺-ITCBE-BSA免疫抗原，收集分装，－20 ℃冻存备用；

所述螯合剂ITCBE是乙二胺四乙酸（EDTA)或二乙烯三胺五乙酸（DTPA）的化学修饰物，包括异硫氰酸苯基-EDTA、异硫氰酸苯基-DTPA、反式-环己基-DTPA。

（二）抗原鉴定

（1）载体蛋白浓度测定。采用二喹啉甲酸法测定Cr³⁺-ITCBE-BSA中载体蛋白BSA的浓度，以BSA作为标准蛋白，用二喹啉甲酸法构建浓度检测标准曲线。BSA浓度标准曲线的线性方程为：y=0.00048x＋0.0076，R²＝0.9991，其中y为样品在波长为562 nm处吸光度，x为样品蛋白浓度。测定结果：载体蛋白BSA的浓度为6.4 mg/mL。

（2）Cr³⁺离子浓度测定。采用ICP-AES法测定Cr³⁺-ITCBE-BSA中Cr³⁺的浓度。将100 μg/mL的Cr³⁺-ITCBE-BSA中Cr³⁺标准储备液用2%的硝酸稀释成0.1 μg/mL、0.3 μg/mL、0.9 μg/mL、2.7 μg/mL、8.1 μg/mL的浓度梯度，仪器软件自动绘制标准曲线，并得出线性回归方程；样品溶液50倍稀释，在267.7 nm波长的最佳优化实验条件下进行测定，仪器软件自动分析结果。测定结果Cr³⁺离子的质量浓度为3.1 mg/mL。

实施例二、抗Cr³⁺离子单克隆抗体的制备与鉴定

（一）抗Cr³⁺离子单克隆抗体制备

（1）免疫动物。用Cr³⁺-ITCBE-BSA免疫Balb/c小鼠5只，免疫剂量为50μg·0.2 mL/只，背部皮下多点注射。首免，用灭菌磷酸盐缓冲液（PBS）稀释Cr³⁺-ITCBE-BSA，与等量弗氏完全佐剂（CFA）混合乳化；加强免疫，用灭菌PBS稀释Cr³⁺-ITCBE-BSA，与等量弗氏不完全佐剂（IFA）混合乳化，首免后3周进行第二次免疫，以后间隔3周免疫一次，共免5次，第三次免疫后10天断尾取血，37℃水浴30 min，4 ℃放置过夜，800 r/min 4℃离心5 min，取上清后－20℃保存备用。

（2）细胞融合备用小鼠选择。间接ELISA检测抗血清中Cr³⁺与乙二胺四乙酸（EDTA）螯合物Cr³⁺-EDTA 的多克隆抗体（pAb）效价，阻断ELISA检测Cr³⁺-EDTA pAb对Cr³⁺-EDTA的半数抑制浓度（IC ₅₀），挑选效价最高、IC ₅₀最低的小鼠，超免用于细胞融合。

（3）阳性杂交瘤细胞株的筛选。细胞融合，将PEG溶液、GNK溶液预热至40℃，将制备好的脾细胞与NS0骨髓瘤细胞按10∶1的比例混合于50 mL离心管中，加GNK溶液至40 mL，1000 r/min离心10 min，弃上清，打散细胞团，将此融合管移入40 ℃水浴中。用1 mL吸管将预热的50% PEG（pH 8.0）滴加到融合管中，边加边轻轻摇动融合管，1 min内加完，并继续在水浴中缓缓摇动融合管1.5 min；然后慢慢补加GNK溶液至40 mL，37 ℃水浴静置5 min，1000 r/min离心10 min，弃上清；打散细胞团，加40 mL HAT吹打混匀，加到含饲养细胞的96孔细胞培养板上，每孔100 μL，置37℃ 5% 的CO₂培养箱中培养。 

阳性杂交瘤细胞的筛选。用间接ELISA和阻断ELISA进行阳性杂交瘤细胞株的筛选。选择强阳性、抑制效果好、细胞生长旺盛的孔进行3次有限稀释克隆化，分别于冻存15 d、30 d 和60 d后复苏杂交瘤细胞，培养后取上清液，间接ELISA测定抗体效价，考察杂交瘤细胞分泌的抗Cr³⁺离子单克隆抗体（Cr³⁺-EDTA mAb）的稳定性。

（4）单克隆抗体的制备。采用体内诱生腹水法制备单克隆抗体，取8周龄健康Balb/c雌性小鼠，腹腔注射FIA 0.5 mL/只，10～15天后使用。将培养的阳性杂交瘤细胞1000 r/min离心10min，弃上清，收集细胞沉淀。用灭菌的PBS将细胞沉淀悬浮、混匀，将细胞数调至10⁶个/mL，腹腔注射Balb/C小鼠0.5 mL/只。接种细胞7～10天后产生腹水，进行收集，于37 ℃水浴30 min，4 ℃放置过夜，12000 r/min离心5 min，弃去上层的脂肪、IFA和下层的沉淀，饱和硫酸铵盐析法提纯后测定IgG含量和效价，－20℃保存备用。 

（二）抗Cr³⁺离子单克隆抗体的鉴定

（1）亚型鉴定。取正在培养的杂交瘤细胞上清，按1∶50稀释后，参照小鼠单克隆抗体亚型鉴定试纸条说明书操作。取稀释液0.15 mL加入试剂盒小管中，室温放置1 min。待其自然溶解后，轻轻混匀；然后将试纸条插到小管底部，5 min后，当最前端条带在两对“+”中间出现时，即可见与杂交瘤细胞株所分泌的抗体亚类和轻链类型对应所在的位置，从而确定抗体亚型。鉴定结果，单克隆抗体亚型为IgG₁/λ。

（2）效价测定。间接ELISA测定其效价。测定结果，Cr³⁺-EDTA mAb的腹水效价为1∶6.4×10⁵。

（3）亲和力鉴定。饱和ELISA测定亲和常数（Ka），用浓度分别为3.4 μg/mL和1.7 μg/mL的Cr³⁺-ITCBE-BSA包被酶标板，加入倍比稀释的Cr³⁺-EDTA mAb，再加入酶标二抗GaMIgG-HRP，TMB显色测A _450nm值，以Cr³⁺-EDTA mAb浓度为横坐标，以A _450nm值为纵坐标，绘出相应的2条反应曲线，以每条曲线上部平坦段的A _450nm值作为100%，在曲线上算出50% A _450nm值时对应的Cr³⁺-EDTA mAb浓度，按照公式Kaff＝（n－1）/2（n[Ab']t－[Ab]t）计算Ka。鉴定结果，Cr³⁺-EDTA mAb的Ka为1.65×10¹⁰ L/moL，为高亲和力抗体。

（4）敏感性鉴定。用阻断ELISA测定Cr³⁺-EDTA mAb对不同浓度Cr³⁺-EDTA的抑制率，以抑制率B/B₀为纵坐标，以不同浓度Cr³⁺-EDTA的对数值为横坐标，绘制标准抑制曲线，进行相关回归分析，计算Cr³⁺-EDTA mAb对Cr³⁺-EDTA的IC ₅₀。鉴定结果，IC ₅₀为9.84 ng/mL。

（5）特异性鉴定。采用交叉反应试验鉴定其特异性。鉴定结果，与其它重金属离子交叉反应小于0.05%。 

实施例三、铬离子免疫金标试纸的制备

（1）胶体金溶液制备。采用柠檬酸盐还原法制备，取1000 mL三角烧瓶，加入975 mL双蒸水煮沸，加入15 mL柠檬酸三钠继续加热5 min，加入10 mL 质量浓度1%的氯金酸，继续加热至溶液呈现橘红色，冷却至室温后，4℃保存备用；

（2）金标抗体制备。将待标记的单克隆抗体溶液10000 r/min离心30 min，用0.1 mol/L K₂CO₃溶液调节胶体金溶液的pH值至8.2，在磁力搅拌下逐滴加入浓度为0.2 mg/mL单克隆抗体溶液，室温温育20 min，10000 r/min离心30 min，弃上清，沉淀物用0.02 mol/L Na₂B₄O₇溶液（含100 g/L BSA）稀释；10000 r/min离心30 min，沉淀物再用0.02 mol/L Na₂B₄O₇溶液（含10 g/L BSA、0.5 g/L叠氮钠）稀释，4 ℃保存备用。

（3）金标抗体结合垫制备。裁取规格为20×4 mm的玻璃纤维棉，将金标抗体用X-only单向喷点仪均匀喷洒于玻璃纤维棉上，37℃干燥1h，密封，4℃保存备用。

（4）纤维素膜上检测线、质控线的制备。将浓度为1mg/mL的Cr³⁺-ITCBE-BSA放于X-only单向喷点仪贮存池A，浓度为1 mg/mL的RaMIgG放于贮存池B，开机分别点射于膜中央，形成间距0.5cm的检测线和质控线，自然干燥，密封，4 ℃保存备用。

（5）免疫金标试纸组装。将样品垫、金标抗体结合垫、纤维素膜、吸水垫按顺序依次粘贴于支撑板上，并在样品垫与金标抗体结合垫表面粘贴MAX线，在切槽机上切割成宽度4 mm的免疫金标试纸。

实施例四：铬离子快速检测金标试纸的结构，参见图1、图2。图中支撑层1用塑胶薄片条制成，样品垫2用玻璃纤维棉制成，金标抗体结合垫3上吸附有抗铬离子的单克隆抗体，纤维素膜层4采用硝酸纤维素膜，吸水垫5用吸水滤纸制成，将编号2、3、4、5各层从右至左依次粘贴固定在支撑层1上，彼此交界处纤维互相交叉渗透。在纤维素膜层4上设有检测印迹6和对照印迹7，检测印迹用偶联铬离子的牛血清白蛋白（BSA）溶液印制，对照印迹用兔抗小鼠IgG抗体溶液印制，两条印迹平行排列成“︱︱”。8-1为覆盖在样品垫2和金标抗体结合垫3上面的测试端保护膜（白色），8-2为覆盖在吸水垫5上面的手柄端保护膜（如黄色），在样品垫2与金标抗体结合垫3交界处、对应的白色保护膜偏向样品垫2一侧约0.5 cm处印制有样品标记线9，在样品标记线右侧的保护膜上印有箭头及MAX字样。

其中各组件及金标抗体、人工免疫抗原、抗铬离子单克隆抗体等的制备参见以上实施例。

（1）检测反应原理

当铬离子金标试纸测试端插入待测样品溶液后，待测溶液通过虹吸作用带动待测铬离子及金标抗体一起向纤维素膜层扩散，并渗入手柄端的吸水垫。扩散过程中待测铬离子可与金标抗体相结合，进而封闭金标抗体上铬离子的抗原结合点，阻止金标抗体与纤维素膜层上偶联铬离子载体蛋白的检测印迹结合，不能显示检测印迹，而抗小鼠IgG抗体则可与金标抗体结合，形成棕红色对照印迹带“︱”，即一条棕红色带“︱”印迹为阳性表示；反之，样品溶液中无铬离子则不能阻止金标抗体与纤维素膜上偶联铬离子的载体蛋白检测印迹结合，显示棕红色检测印迹“︱”，同样抗小鼠IgG抗体也与金标抗体结合，显示棕红色对照印迹带“︱”，形成两条棕红色带“︱︱”为阴性表示。如果纤维素膜上没有棕红色带显示，则表明金标试纸已失效。

（2）待测样品制备及检测步骤：

样品中铬离子存在形式有Cr³⁺和Cr⁶⁺两种，只有Cr³⁺-EDTA能够被免疫试纸检测到。因此，样品前处理由两步完成，第一步，加入过量化学还原剂如SO₂、NaHSO₃、Na₂SO₃其中的一种，将酸酐形式的Cr⁶⁺完全还原为游离的Cr³⁺；第二步，用过量0.1 mol/L EDTA溶液处理样品，使Cr³⁺完全形成Cr³⁺-EDTA，离心取上清液，用于检测。

检测土壤：称取1.0 g土壤样品于100 mL锥形瓶内，加入1 mL双蒸水浸润后加入混酸溶液 6mL（3 mL浓H₃PO₄和3 mL浓H₂SO₄），盖上表面皿，置于电炉上加热至冒白烟，冷却后加入0.5 mL浓HNO₃，继续加热至土样变白色、消解液呈黄绿色，用双蒸水冲洗，全部转移入50 mL离心管内，5000 r/min离心10 min，将上清夜移入100 mL容量瓶中，加入1 0mL浓度为1 mol/L、pH 9.5的Na₂SO₃溶液，搅拌反应1 h，之后加入10 mL浓度为0.1 mol/L的EDTA鳌合剂溶液，搅拌反应8 h，定容至100 mL，得到土壤样品检测溶液。

操作方法：将金标试纸插入待测样品中，插入深度不超过标记线，约10～20秒钟取出检测金标试纸，水平放置，在5 min内观察判定检测结果。

实施例五：金标试纸结构和实施例四基本相同，不同之处在于：金标抗体结合垫吸附有抗铬离子的多克隆抗体，样品垫用尼龙膜制成，纤维素膜层采用纯纤维素膜，检测印迹和对照印迹均为“十”，覆盖在吸水垫上面的手柄端的保护膜为兰色。偶联铬离子载体蛋白溶液为人血清白蛋白（HSA）或兔血清白蛋白（RSA）。     

用于检测牛奶：取鲜牛奶5000 r/min离心10 min后，取上清液，按照8∶1∶1的体积比先加入浓度为1 mol/L、pH 9.5的Na₂SO₃溶液，搅拌反应1 h，之后加入浓度为0.1mol/L的EDTA鳌合剂溶液，搅拌反应8 h，得到牛奶样品检测溶液。

实施例六：金标试纸结构和实施例四基本相同，不同之处在于：样品垫和金标抗体结合垫用PVDF膜制成，偶联铬离子的载体蛋白溶液为鸡卵清白蛋白(OVA)，纤维素膜层采用羧化纤维素膜，覆盖在吸水垫上面的手柄端保护膜为绿色。

用于检测水：可直接在水样中按照8∶1∶1的体积比先加入浓度为1 mol/L、pH 9.5的Na₂SO₃溶液，搅拌反应1 h，之后加入浓度为0.1 mol/L的EDTA鳌合剂溶液，搅拌反应8 h，得到样品检测溶液。 

实施例七：金标试纸结构和实施例四基本相同，不同之处在于：

样品垫和金标抗体结合垫用聚酯膜制成，纤维素膜层采用羧化纤维素膜，偶联铬离子载体蛋白溶液为血蓝蛋白（KLH）。

实施例八、铬离子金标试纸的性能测定

（1）敏感性测定。用实施例四中的铬离子免疫金标试纸测定浓度分别为0ng/mL、1 ng/mL、2.5 ng/mL、5 ng/mL、10 ng/mL、20 ng/mL、40 ng/mL、80 ng/mL、160 ng/mL的Cr³⁺标准品，每个浓度设6个重复，根据试验结果判断其敏感性。结果见表1，由表1可知，Cr³⁺离子免疫金标试纸的目测检测限为5ng/mL。

表1  测定铬离子免疫金标试纸的敏感性试验（n=6）                      

Cr3+离子浓度（ng/mL）	0	1	2.5	5	10	20	40	80	160
										结果	-	-	-	+	+	+	+	+	+

注：“-”表示阴性，“+”表示阳性。

（2）特异性测定。采用交叉反应试验，选择汞、铅、镉、铜、锌、钴等金属离子与EDTA的螯合物、EDTA为抑制物，用Cr³⁺离子免疫金标试纸测定终浓度分别为0 ng/mL、1 ng/mL、2.5 ng/mL、5 ng/mL、10 ng/mL、20ng/mL、40 ng/mL、80 ng/mL、160 ng/mL的重金属离子标准品，每个浓度设6个重复，以此判断其特异性。结果见表2，Cr³⁺离子免疫金标试纸与Cr³⁺离子特异性结合，与其它重金属离子无交叉反应。

表2  测定铬离子免疫金标试纸的特异性试验（n=6）

注：“-”表示阴性，“+”表示阳性。

（3）重复性测定。取不同批次的6批铬离子免疫金标试纸分别在第6 天对Cr³⁺离子浓度为0 ng/mL、2.5 ng/mL、5 ng/mL、10 ng/mL的土壤样、水样、牛奶样进行检测，每个浓度设6个重复，检验其重复性。结果见表3，检测结果完全一致，证明不同批次生产的免疫金标试纸检测结果稳定可靠，具有良好的重复性。

表3  铬离子免疫金标试纸的重复性试验（n=6）             

注：“-”表示阴性，“+”表示阳性。

（4）保存期检验。将不同批次的铬离子免疫金标试纸分别保存于普通冰箱（2-8 ℃）12个月和室温干燥保存6个月，确定其保存期。结果表明，铬离子免疫金标试纸在保存期内其外观、准确性、敏感性、特异性等均未发生变化。可推知其保存期为2～8℃下12个月，室温干燥条件下保存期6个月。

Claims (10)

1.一种用于快速检测铬离子的金标试纸，底层为支撑层，中间层为吸附层，保护膜固定在吸附层上，其特征是：吸附层从测试端依次为样品垫、金标抗体结合垫、纤维素膜层及手柄端的吸水垫，其中在纤维素膜层上设有偶联铬离子的载体蛋白溶液印制的检测印迹和用兔抗或羊抗小鼠IgG抗体溶液印制的对照印迹；所述金标抗体结合垫中包被有胶体金标记的特异性铬离子单克隆抗体。

2.根据权利要求1所述的金标试纸，其特征是：所述纤维素膜层用硝酸纤维素膜、纯纤维素膜或羧化纤维素膜制成；所述样品垫和金标抗体结合垫用聚偏二氟乙烯膜、尼龙膜、玻璃纤维棉或聚酯膜制成；吸水垫用吸水滤纸制成，支撑层用不吸水的韧性材料制成。

3.根据权利要求1所述的金标试纸，其特征是：所述                                                

偶联铬离子的载体蛋白为牛血清白蛋白、卵清蛋白、钥孔戚血蓝蛋白、人血清白蛋白和兔血清白蛋白中的一种；

检测印迹上偶联铬离子的载体蛋白包被量为1 μL/cm，载体蛋白浓度为1 mg/mL；对照印迹上兔抗或羊抗小鼠IgG抗体溶液的包被量为1 μL/cm，抗体浓度为1 mg/mL；所述检测印迹和对照印迹为平行排列的“︱︱”直线式印迹或“十十”字型排列印迹。

4.根据权利要求1所述的金标试纸，其特征是：所述保护膜覆盖在样品垫、金标抗体结合垫和吸水垫上，在样品垫与金标抗体结合垫交界处对应的保护膜上偏向样品垫一侧0.3-0.6 cm处印制有样品标记线。

5.根据权利要求1-4任一项所述的金标试纸，其特征是：所述偶联铬离子的载体蛋白溶液是由以下方法制备的：

（1）称取10 mg鳌合剂异硫氰酸苄基乙二胺四乙酸ITCBE溶于1 mL 二甲基亚砜DMSO中形成金属鳌合剂溶液；称取18.1mg CrCL₃·6H₂O溶于1 mL浓度为10 mmol/L、pH值为8.0的HEPES缓冲液中，形成Cr³⁺溶液；将金属鳌合剂溶液和Cr³⁺溶液混合，并用NaOH调节pH值至7.0，然后在室温条件下放在摇床上反应12 h，即形成Cr³⁺-ITCBE鳌合物半抗原溶液；

（2）称取20 mg 载体蛋白BSA或OVA溶于1 mL浓度为10 mmol/L、pH值为8.0的HEPES缓冲液中，形成载体蛋白溶液；

（3）取1 mL Cr³⁺-ITCBE鳌合物半抗原溶液加入到1mL载体蛋白溶液中，并用NaOH调节pH值至9.0，室温摇床反应24 h，然后移入透析袋中透析5 d，收集透析液，即形成Cr³⁺-ITCBE-BSA或Cr³⁺-ITCBE-OVA的免疫抗原，收集分装，－20℃冻存备用。

6.根据权利要求1-4任一项所述的金标试纸，其特征是：所述胶体金标记的特异性铬离子单克隆抗体是通过以下方法制备的：

采用柠檬酸盐还原法制备，在三角烧瓶中加入975 mL双蒸水，煮沸后加入15 mL柠檬酸三钠，继续加热5 min，加入10 mL质量浓度为1%的氯金酸，继续加热至溶液呈橘红色，冷却至室温，得到胶体金溶液，4℃保存备用；

取胶体金溶液100 mL，用0.1 mol/L 的K₂CO₃溶液调节胶体金溶液的pH值至8.2，磁力搅拌下逐滴加入浓度为0.2 mg/mL的铬离子单克隆抗体溶液，室温温育20 min，10000 r/min离心30min，弃上清，沉淀物用每升含100 g BSA、浓度为0.02 mol/L 的Na₂B₄O₇溶液稀释，然后10000 r/min离心30 min，得到的沉淀物再用每升含10 g BSA、0.5 g叠氮钠、浓度为0.02 mol/L 的Na₂B₄O₇溶液稀释，即获得胶体金标记的铬离子单克隆抗体，4 ℃保存备用；所得的胶体金溶液中金颗粒的粒径为25 nm，每1 mL胶体金中含有3 ng三价铬离子单克隆抗体。

7.一种权利要求1所述金标试纸的制备方法，其特征是：该方法包括以下步骤：

（1）铬离子载体蛋白偶联物的制备：

称取10 mg鳌合剂异硫氰酸苄基乙二胺四乙酸ITCBE溶于1 mL 二甲基亚砜中形成金属鳌合剂溶液；称取18.1 mgCrCL₃·6H₂O溶于1 mL浓度为10 mmol/L、pH值为8.0的HEPES缓冲液中，形成Cr³⁺溶液；将金属鳌合剂溶液和Cr³⁺溶液混合并用NaOH调节pH值至7.0，然后在室温条件下在摇床上反应12 h，即形成Cr³⁺-ITCBE鳌合物半抗原溶液；

称取20 mg 载体蛋白BSA或OVA，溶于1 mL浓度为10 mmol/L、pH值为8.0的HEPES缓冲液中，形成载体蛋白溶液；

取1 mL Cr³⁺-ITCBE鳌合物半抗原溶液，加入到1 mL载体蛋白溶液中，并用NaOH调节pH值至9.0，室温摇床反应24 h，然后移入透析袋中透析5 d，收集透析液，即形成Cr³⁺-ITCBE-BSA或Cr³⁺-ITCBE-OVA免疫抗原，收集分装，－20 ℃冻存备用；

（2）铬离子金标抗体的制备；

（3）金标抗体结合垫的制备；

（4）检测印迹和对照印迹的制备；

用所得的铬离子载体蛋白偶联物在纤维素膜层上制成检测印迹，用兔抗或羊抗小鼠IgG抗体溶液在纤维素膜层上制成对照印迹；检测印迹上偶联铬离子载体蛋白的包被量为1 μL/cm，载体蛋白浓度为1 mg/mL；对照印迹上兔抗或羊抗小鼠IgG抗体溶液的包被量为1 μL/cm，抗体浓度为1 mg/mL；

将样品垫、金标抗体结合垫、纤维素膜、吸水垫按顺序依次粘贴于支撑层上，切割成免疫金标试纸。

8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征是：所述胶体金标记的特异性铬离子单克隆抗体的制备方法如下：

采用柠檬酸盐还原法制备，在三角烧瓶中加入975 mL双蒸水，煮沸，加入15 mL柠檬酸三钠，继续加热5 min，加入10 mL质量浓度为1%的氯金酸，继续加热至溶液呈橘红色，冷却至室温后得到胶体金溶液，4 ℃保存备用；

取胶体金溶液100 mL，用0.1 mol/L 的K₂CO₃溶液调节胶体金溶液的pH值至8.2，磁力搅拌下逐滴加入浓度为0.2 mg/mL的铬离子单克隆抗体溶液，室温温育20 min，10000 r/min离心30 min，弃上清，沉淀物用每升含100 g BSA、浓度为0.02 mol/L 的Na₂B₄O₇溶液稀释，然后10000 r/min离心30 min，得到的沉淀物再用每升含10 g BSA和0.5 g叠氮钠、浓度为0.02 mol/L Na₂B₄O₇溶液稀释，即获得胶体金标记的铬离子单克隆抗体，4 ℃保存备用；所得的胶体金溶液中金颗粒的粒径为25 nm，每1mL胶体金中含有3 ng三价铬离子单克隆抗体。

9.根据权利要求7或8所述的制备方法，其特征在于：所述的铬离子特异性单克隆抗体由以下方法制备：

免疫动物：以Cr³⁺-ITCBE-BSA为免疫抗原，以Balb/c小鼠作为免疫动物，背部皮下多点注射，免疫剂量为每只每次50～100 μg，首免用弗氏完全佐剂，加强免疫用弗氏不完全佐剂，首免后3周进行第二次免疫，以后间隔2周免疫一次，共免疫5次；

选择细胞融合备用小鼠：间接ELISA检测抗血清中Cr³⁺螯合物多克隆抗体pAb效价，阻断ELISA检测Cr³⁺-EDTA pAb对Cr³⁺-EDTA的半数抑制浓度IC ₅₀，挑选效价最高、IC ₅₀最低的小鼠，超免用于细胞融合；

制备阳性杂交瘤细胞：取NS0骨髓瘤细胞与免疫小鼠脾细胞用PEG溶液进行细胞融合，经过四次有限稀释法亚克隆，获得稳定分泌抗铬离子的单克隆抗体细胞株；

制备单克隆抗体：对经产母鼠腹腔注射杂交瘤细胞株，采集腹水纯化，获得抗铬离子的单克隆抗体。

10.一种权利要求1-6任一项所述的金标试纸在快速检测铬离子中的应用。

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