CN101451998A

CN101451998A - 镉离子胶体金免疫层析快速检测试纸条及制备方法和用途

Info

Publication number: CN101451998A
Application number: CNA2008102206094A
Authority: CN
Inventors: 向军俭; 唐勇; 陈耀强; 王建华; 王宏; 邓宁
Original assignee: Jinan University
Current assignee: Jinan University; University of Jinan
Priority date: 2008-12-30
Filing date: 2008-12-30
Publication date: 2009-06-10

Abstract

本发明公开了一种镉离子胶体金免疫层析快速检测试纸条及其制备方法和用途。试纸条的制备方法：(1)胶体金溶液的制备；(2)抗镉离子单抗标记的胶体金溶液的制备；(3)喷金；(4)硝酸纤维素膜上包被C，T线；(5)镉离子胶体金免疫层析快速检测试纸条的组装。利用此试纸条进行镉离子检测的方法，包括以下步骤：a.在待测样品消解液中加入EDTA螯合剂，使镉离子与EDTA充分螯合；b.用滴管吸取待检样品溶液，滴加3滴于试纸条的样品垫上，加样后开始计时；c.在加样后3～5min读取结果，读取时，将试纸条以样品垫一端向下的方式垂直置于观察者正面；d.结果判断。本发明可以大规模地对环境与水产类食品中残留的重金属镉进行快速、方便的检测。

Description

镉离子胶体金免疫层析快速检测试纸条及制备方法和用途

技术领域

本发明涉及一种镉离子胶体金免疫层析快速检测试纸条及其制备方法和用途，属于免疫学技术领域。

背景技术

镉(Cdmium，Cd)的原子序数是48，是严重危害人类健康的重金属之一，主要来源于镉矿、镉冶炼厂。因镉与锌同族，常与锌共生，所以冶炼锌的排放物中必有ZnO，CdO，它们挥发性强，以污染源为中心可波及数千米远。随着我国工农业的迅速发展，环境中重金属的污染越来越严重。重金属污染引起的毒害持久存在，会随土壤、水体再次循环而进入食物链，对食品安全构成威胁，危害人类生命和健康。镉中毒能使肾功能受到破坏，镉进入呼吸道可引起肺炎、肺气肿作用于消化系统则引起肠胃炎。镉中毒者常常伴有贫血，骨骼中有过量镉积累会使骨骼软化、变形、骨折、萎缩，还会引起癌症。我国各类食品中重金属的国家限量卫生标准，农产品安全质量无公害水产品安全要求(2001)中对镉含量都有限定≤0.1mg/kg。欧盟，美国，日本，韩国等我国水产品的主要出口国对水产品的重金属含量的限定也越来越严格，法规和标准也越来越苛刻。

目前重金属镉的检测方法主要有：

1.物理和化学的方法：原子吸收分光光度法(AAS)，电感耦合等离子体—原子发射光谱法(ICP-AES)，电感耦合等离子体质谱分析(ICP-MS)，原子荧光光谱分析(AFS)等。这些方法的特点是灵敏、准确，但是需要复杂的仪器设备，专门的分析技术人员，且标准品价格昂贵，前处理麻烦，不能同时检测大量样品，不适合现场及大规模的推广应用。

2.免疫学检测技术：

酶联免疫吸附检测法(ELISA)：其检测的原理是利用样品中的镉离子与标准品中镉离子竞争结合抗体并以此对样品中的镉进行定性或定量分析。该方法比较简便、快速，可同时分析大批量样品。目前国外已研制出重金属镉的酶联检测试剂盒。国内也有重金属镉的ELISA检测的报道。

胶体金免疫层析法(GICA)：其检测的原理是将各种反应试剂(抗原和抗体)以条带状固定在同一试纸条上，待检样品加在试纸条的一端，通过毛细作用在试纸条上渗滤、移行并与纸上另一种试剂发生抗原抗体特异性免疫反应，层析过程中免疫复合物被截留、聚集在层析材料的一定区域(检测带)，通过可目测的胶体金标记物得到直观的显色结果，而游离的标记物则越过检测带，达到与结合标记物自动分离的目的。

胶体金免疫层析试纸条因具有体积小、携带方便、不需要仪器设备、操作简单、可现场检测、3～5min出结果以及结果可由肉眼根据T线颜色深浅判断等诸多优点，非常适合对大批量样品进行现场初筛，近几年在食品安全快速检测中颇受关注。目前国内外尚未见镉离子胶体金免疫层析快速检测方法的报道，国内市场尚无该试纸条产品，因此，自主知识产权的重金属镉离子胶体金免疫层析快速检测方法及试纸条具有重要价值。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术存在的缺点和不足，为了实现大规模地对环境(水体和土壤等)与水产类食品中残留的重金属镉进行快速、方便的检测，保障我国海产品食用安全及维护我国在相关国际贸易领域中的利益，提供一种镉离子胶体金免疫层析快速检测试纸条。

本发明的另一目的在于提供上述镉离子胶体金免疫层析快速检测试纸条的制备方法.

本发明的再一目的在于提供一种利用上述镉离子胶体金免疫层析快速检测试纸条进行镉离子检测的方法。

本发明的目的通过下述技术方案实现：一种镉离子胶体金免疫层析快速检测试纸条，该试纸条是以聚氯乙烯底板为底部支撑，将样品垫、喷金后的结合垫、包被后的硝酸纤维素膜和吸水纸以依次相连的方式粘贴在聚氯乙烯底板上制成的；所述包被后的硝酸纤维素膜上设置检测线T线和质控线C线，其中检测线T线靠近样品垫一端。

所述试纸条是以聚氯乙烯底板为底部支撑，将样品垫、喷金后的结合垫、包被后的硝酸纤维素膜和吸水纸粘贴在聚氯乙烯底板上，其中样品垫和吸水纸位于两端，包被后的硝酸纤维素膜的两端分别位于结合垫和吸水纸的下面，结合垫的一端设置于样品垫的下面，另一端设置于包被后的硝酸纤维素膜的上面。

所述结合垫和样品垫是将玻璃纤维在摩尔浓度为0.015mol/L的磷酸盐缓冲液、质量体积比为10g/L的牛血清白蛋白、质量体积比为5g/L的聚乙烯吡咯烷酮和质量体积比为0.2g/L的叠氮化钠组成的混合液中浸泡5～24h，取出后于37～45℃抽风烘干得到；所述磷酸盐缓冲液的pH值为7.4。

上述镉离子胶体金免疫层析快速检测试纸条的制备方法，包括以下操作步骤：

(1)胶体金溶液的制备；

(2)抗镉离子单抗标记的胶体金溶液的制备；

(3)喷金：把步骤(2)所得抗镉离子单抗标记的胶体金溶液按2～10μl/cm的喷量喷在结合垫上，37℃～45℃抽风烘干，时间为5～24h，得到喷金后的结合垫；

(4)硝酸纤维素(NC)膜上包被C，T线：在硝酸纤维素膜上包被C线和T线，其中C线为质控线，包被羊抗鼠免疫球蛋白G，浓度为0.2～1.5mg/ml；T线为检测线，包被镉的完全抗原Cd-iEDTA-BSA(镉-双功能乙二胺四乙酸-牛血清白蛋白)，浓度为0.1～0.9mg/ml；37℃～45℃抽风烘干，时间为2～24h；得到包被后的硝酸纤维素膜；

(5)镉离子胶体金免疫层析快速检测试纸条的组装：将聚氯乙烯底板、样品垫、步骤(3)所得喷金后的结合垫、步骤(4)所得包被后的硝酸纤维素膜和吸水纸按照权利要求1所述方式组装，切割成条，得到镉离子胶体金免疫层析快速检测试纸条。

步骤(1)所述胶体金溶液的制备包括以下操作步骤：取质量浓度为0.01％的氯金酸水溶液100mL，搅拌加热至沸腾，一次性快速加入质量浓度为1％的柠檬酸三钠水溶液2.5mL，继续搅拌加热0.5～24小时，直至溶液呈酒红色，室温冷却，得到含有粒径为20～40nm的胶体金颗粒的胶体金溶液。

步骤(2)所述抗镉离子单抗标记的胶体金溶液的制备包括以下操作步骤：取步骤(1)所得胶体金溶液100mL，用摩尔浓度为0.1mol/L的碳酸钾溶液将其pH值调至8.5；将抗镉离子单抗1.6mg加入到胶体金溶液中，搅拌均匀，静置0.5～24小时；逐滴加入质量浓度为10％的无菌牛血清白蛋白(BSA)11mL，搅拌0.5～24小时，4℃～30℃静置过夜；将上述标记后的胶体金溶液于2000～5000r/min离心10-20min，弃去沉淀，然后于10000～20000r/min离心10～30min，弃去上清液；加入摩尔浓度为50mmol/L的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐(Tris-HCl)清洗2～3次，最后用上述三羟甲基氨基甲烷盐酸盐10mL重悬，得到抗镉离子单抗标记的胶体金溶液。

所述抗镉离子单抗的制备步骤如下：用双功能改构乙二胺四乙酸(iEDTA)螯合剂将镉离子偶联到血蓝蛋白(KLH)上，混合弗式不完全佐剂免疫BALB/c小鼠，取免疫小鼠脾细胞和SP2/0骨髓瘤细胞融合，筛选出稳定分泌抗镉离子单克隆抗体(MAb-Cd)的阳性细胞株并扩大培养，注射细胞进小鼠体内诱生腹水，纯化获得抗镉离子单抗。

所述三羟甲基氨基甲烷盐酸盐的pH值是8.5，其含有质量体积比为10g/L的牛血清白蛋白和质量体积比为0.2g/L的叠氮化钠。

步骤(4)所述镉的完全抗原Cd-iEDTA-BSA是用双功能改构乙二胺四乙酸螯合剂将镉离子偶联到牛血清白蛋白上获得检测抗原Cd-iEDTA-BSA。

一种利用上述方法制备的镉离子胶体金免疫层析快速检测试纸条进行镉离子检测的方法，包括以下操作步骤：

a、在镉离子标准液或待测样品消解液中按照9∶1的体积比加入摩尔浓度为100mmol/L的乙二胺四乙酸螯合剂，混合均匀，使镉离子与EDTA充分螯合，得到待检样品溶液。

b、用滴管吸取步骤a所得待检样品溶液80～150μL，滴加于试纸条的样品垫上，滴加样品后开始计时；

c、在滴加样品后3～5min读取结果，读取时，将试纸条以样品垫一端向下的方式垂直置于观察者正面；

d、结果判断：C线显示为红色线条，当T线显色与C线相近，结果为阴性，待测样品中的镉离子浓度小于100ng/ml；当T线显色比C线浅，结果为阳性，待测样品中的镉离子浓度大于100ng/ml。

步骤a所述待测样品消解液是将待测样品加酸后进行微波或加热消解，然后调PH值至中性获得。

为了更好地实现本发明，可以将镉离子胶体金免疫层析快速检测试纸条装入塑料板中，该塑料板的上面有两个孔：加样孔和检测显示窗口。其中，加样孔正对试纸条的样品垫，检测结果显示窗口正对NC膜。检测时，将待检样品溶液滴于加样孔中，根据检测结果窗口显示的T、C线颜色进行判断。

为了更好地实现本发明，水产类样品按下述方法预处理：准确称取1.0g鱼肉样品，在聚四氟乙烯坩埚中加入硝酸2ml，室温下放置4～6小时。然后将肉样转移进消化管内，用共计4ml的硝酸多次润洗坩埚，全部转移进消化管，再加入1.5ml的30％的过氧化氢。拧紧消化管盖，按规定位置置于微波消解仪内，调节时间为15min，进行微波加热。加热15min，取出，静置半个小时让其冷却。开盖取样品消解液，用NaOH溶液调节PH至7.4，用50ml容量瓶定容待测。

环境水体类样品按下述方法预处理：取摇匀水体样品20mL，移入50mL聚四氟乙烯烧杯中，在通风橱内，将烧杯置于放有石棉网的电热炉上加热，加入1ml硝酸。待浓缩至2ml左右时取下冷却，沿杯壁加入2ml硝酸和0.8ml高氯酸。继续加热消解，待溶液清澈后，加入少许三蒸水，加热煮沸，驱尽氯气和氮氧化合物。用三蒸水溶解，滤入烧杯中，用NaOH溶液调节PH至7.4，用50ml容量瓶定容待测。

环境土壤类样品按下述方法预处理：准确称取1.2g土壤样品于50mL微波管中，用少许水湿润后加入2mLHNO₃和6mL HCl，在室温下放置过夜，再置于微波消解炉中，编定微波程序，使其从室温逐渐升温至180℃并保持15min，然后逐渐降温至室温，取下，用NaOH溶液调节PH至7.4，用50ml容量瓶定容待测。

本发明的原理是：将螯合剂—镉离子半抗原与载体蛋白偶联成为完全抗原免疫动物，获得针对镉离子特异性抗体，再将该抗镉离子的单克隆抗体与胶体金偶联，Cd-iEDTA-BSA包被于NC膜的T线上。当滴加镉离子标准品竞争物(Cd-EDTA)或待测样品(X-EDTA)于加样孔中时，由于毛细作用液体向前移动。到达T线时，样品中的Cd-EDTA与固定在T线上的Cd-iEDTA-BSA复合物竞争结合抗镉离子单抗-胶体金复合物，若样品中的镉离子浓度小于100ng/ml，则胶体金结合垫中的抗镉离子单抗-胶体金复合物与T线上Cd-iEDTA-BSA及C线上羊抗鼠IgG大量结合，T线显色与C线相近，结果为阴性；若样品中镉离子的浓度大于100ng/ml，则抗镉离子单抗-胶体金复合物大部分与检测样品中的Cd-EDTA结合，很少与T线上的Cd-iEDTA-BSA结合，因此T线将比C线浅或完全看不到线，而且样品中镉离子浓度越高，T线显色越浅，结果为阳性。

本发明相对现有技术具有如下的优点及有益效果：(1)本发明利用得到的分泌抗镉离子单克隆抗体的阳性细胞可大量制得抗镉离子的单克隆抗体，所建立的方法成本低廉，可快速、简便、灵敏地测定样品中Cd²⁺的含量；(2)本发明制备的镉离子胶体金免疫层析试纸条体积小、携带方便、不需要大型仪器设备、操作简单，非常适合对大批量样品进行现场初筛，可以大规模地对海洋贝类食品中残留的重金属镉进行快速、方便的检测，保障我国海产品食用安全及维护我国在相关国际贸易领域中的利益。

附图说明

图1是镉离子胶体金免疫层析快速检测试纸条的结构示意图，

其中，1是聚氯乙烯底板；2是包被后的硝酸纤维素膜；3是喷金后的结合垫；4是样品垫；5是吸水纸；6是质控线(C线)；7是检测线(T线)。

图2是镉离子胶体金免疫层析快速检测试纸条装入塑料板的外形图，

其中，1是加样孔；2是检测结果显示窗口；3是C线位置；4是T线位置。

图3是利用镉离子胶体金免疫层析快速检测试纸条进行镉离子检测的操作示意图。

图4是利用镉离子胶体金免疫层析快速检测试纸条进行镉离子检测的操作示意图。

图5是利用镉离子胶体金免疫层析快速检测试纸条进行镉离子检测的结果判断示意图。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明做进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例1

(A)用iEDTA将镉离子偶联到血蓝蛋白(KLH)上，混合弗式不完全佐剂免疫BALB/c小鼠，取免疫小鼠脾细胞和SP2/0骨髓瘤细胞融合，筛选出稳定分泌抗镉离子单克隆抗体(MAb-Cd)的阳性细胞株并扩大培养，注射细胞进小鼠体内诱生腹水，纯化获得抗镉离子的单克隆抗体。

(B)用用iEDTA将镉离子偶联到载体蛋白BSA上获得检测抗原Cd-iEDTA-BSA。

(C)镉离子胶体金免疫层析快速检测试纸条的制备：

(1)胶体金溶液的制备：取质量分数为0.01％的氯金酸水溶液100mL，用恒温电磁搅拌器加热至沸腾，一次性快速加入质量分数为1％的柠檬酸三钠水溶液2.5mL，继续搅拌加热20min，直至溶液呈酒红色，室温冷却，4℃保存备用。通过透射电镜及紫外分光光度计检测胶体金溶液中胶体金颗粒的粒径为20nm。

(2)抗镉离子单抗标记的胶体金溶液的制备：取步骤(1)所得胶体金溶液100mL，用摩尔浓度为0.1mol/L的K₂CO₃溶液将pH调至8.5，将1.6mg抗镉离子单抗加入到胶体金溶液中，搅拌后静置30min，再逐滴加入11mL经微孔滤膜过滤的10％BSA，搅拌15min，4℃过夜；标记后的抗体溶液于4000r/min离心15min，弃沉淀，然后15000r/min离心30min，弃上清，加入10mL 50mM Tris-HCl(pH8.5，含1％BSA、0.02％叠氮化钠)清洗2～3次，最后用10mL上述Tris-HCl重悬，得到抗镉离子单抗标记的胶体金溶液，分装后4℃保存。

(3)喷金：把标记好镉离子单抗的胶体金溶液按2μl/cm的喷量喷在已处理好的结合垫上，37℃抽风烘干，时间为5小时。

(4)硝酸纤维素(NC)膜上包被C，T线：在NC膜上喷C，T线。C线为质控线，包被羊抗鼠IgG，浓度为0.2mg/ml；T线为检测线，包被重金属镉的完全抗原Cd-iEDTA-BSA，浓度为0.1mg/ml。37℃抽风烘干，时间为2小时。

(5)重金属镉的检测试纸条组装：以聚氯乙烯底板为底部支撑，将步骤(4)所得包被后的硝酸纤维素膜、步骤(3)所得喷金后的结合垫、样品垫和吸水纸以从左至右、依次相连的方式粘贴在聚氯乙烯底板上，其中硝酸纤维素膜的检测线T线位于左侧，质控线C线位于左侧(见图1所示)；切割成条，宽度为0.384厘米，得到镉离子胶体金免疫层析快速检测试纸条，再放入带干燥剂的铝箔袋中密闭储存。

实施例2

(C)镉离子胶体金免疫层析快速检测试纸条的制备：

(3)喷金：把标记好镉离子单抗的胶体金溶液按10μl/cm的喷量喷在已处理好的结合垫上，45℃抽风烘干，时间为24小时。

(4)硝酸纤维素(NC)膜上包被C，T线：在NC膜上喷C，T线。C线为质控线，包被羊抗鼠IgG，浓度为1.5mg/ml；T线为检测线，包被重金属镉的完全抗原Cd-iEDTA-BSA，浓度为0.9mg/ml，45℃抽风烘干，时间为24小时。

(5)重金属镉的检测试纸条组装：以聚氯乙烯底板为底部支撑，将步骤(4)所得包被后的硝酸纤维素膜、步骤(3)所得喷金后的结合垫、样品垫和吸水纸以从左至右、依次相连的方式粘贴在聚氯乙烯底板上，其中硝酸纤维素膜的检测线T线位于左侧，质控线C线位于左侧(见图1所示)；切割成条，宽度为0.384厘米，得到镉离子胶体金免疫层析快速检测试纸条。

(6)将步骤(5)所得试纸条装入塑料板中，该塑料板的上面有两个孔：加样孔和检测显示结果窗口；其中，加样孔正对试纸条的样品垫，检测结果显示窗口正对NC膜。检测时，将待检样品溶液滴于加样孔中，根据检测结果窗口显示的T、C线颜色进行判断。(见图2所示)

实施例3

验证本发明的可靠性试验：(步骤b和c见图3所示，步骤d见图4所示)

a、先配制好Cd²⁺系列梯度的标准溶液(0、100、200、400、800、1600ng/mL)各90μL，再分别加入10μ L100m mol/L EDTA溶液作为螯合剂，混合均匀，使镉离子与EDTA充分螯合成Cd-EDTA，作为待测样品溶液。

从密封铝箔袋取出镉离子胶体金快速检测试纸条，用滴管吸取待检样品溶液，滴加3滴于加样孔中，加样后开始计时；结果应在3～5分钟读取，其他时间判读无效；读取结果时，检测试剂应如下图右侧所示摆放方式置于观察者正面。

每个试样做3个重复，5min后观察结果，检测线(T线)颜色呈梯度递减，结果显示如图5所示。

从图5可以看到，从左到右，样品中Cd²⁺的浓度分别为0，100，200，400，800，1600ng/mL，随着样品浓度的升高，镉离子胶体金检测试纸条的T线颜色逐渐变浅。本检测试纸条检测重金属镉的最低检测水平(LDL)的判断标准是当检测线(T线)比质控线(C线)的颜色淡时，样品中镉离子的含量大于或者等于100ng/ml。当样品中的镉离子浓度大于1600ng/ml时，检测线完全消失；当镉离子浓度小于100ng/ml时，检测线与控制线在肉眼下没有明显区别。由上图可知，本检测试纸条的LDL可达到100ng/ml。

实施例4

验证本发明的检测特异性试验：

针对以下重金属运用实施例制得的镉离子胶体金免疫层析快速检测试纸条进行特异性交叉反应测试，结果如下：

表1 重金属镉其他几种的交叉反应

结果显示，抗体除对Cd²⁺以外，对Hg²⁺有明显的交叉，对其他几种金属交叉反应几乎没有，因此此胶体金试纸条可以用来同时检测Cd²⁺和Hg²⁺两种重金属，扩大了应用范围。

实施例5

验证本发明的稳定性试验：

每隔5天，从密闭储存的铝箔袋中取出实施例1制得的镉离子胶体金免疫层析快速检测试纸条，用同一批次不同检测试纸条检测同一样品，及用不同批次检测试纸条测定同一样品，其质控线、测试线的显色时间及颜色深浅和最终结果判读相同。

实施例6

先将待测样品预处理成消解液：准确称取1.0g鱼肉样品，在聚四氟乙烯坩埚中加入硝酸2ml，室温下放置4～6小时。然后将肉样转移进消化管内，用共计4ml的硝酸多次润洗坩埚，全部转移进消化管，再加入1.5ml的30％的过氧化氢。拧紧消化管盖，按规定位置置于微波消解仪内，调节时间为15min，进行微波加热。加热15min，取出，静置半个小时让其冷却。开盖取鱼肉样品消解液，用NaOH溶液调节PH至7.4，用50ml容量瓶定容待测。

利用实施例1制备的镉离子胶体金免疫层析快速检测试纸条对上述鱼肉样品消解液进行镉离子检测，包括以下操作步骤：(步骤b和c见图3所示，步骤d见图4所示)

a、在鱼肉样品消解液中按照9：1的体积比加入摩尔浓度为100mmol/L的EDTA螯合剂，混合均匀，使镉离子与EDTA充分螯合，得到鱼肉样品溶液。

b、用滴管吸取步骤a所得鱼肉样品溶液150μL，滴加于试纸条的加样孔中，加样后开始计时；

c、在加样后3～5min读取结果，读取时，将试纸条以加样孔向下的方向垂直置于观察者正面；

实施例7

先将待测样品预处理成消解液：取摇匀水体样品20mL，移入50mL聚四氟乙烯烧杯中，在通风橱内，将烧杯置于放有石棉网的电热炉上加热，加入1ml硝酸。待浓缩至2ml左右时取下冷却，沿杯壁加入2ml硝酸和0.8ml高氯酸。继续加热消解，待溶液清澈后，加入少许三蒸水，加热煮沸，驱尽氯气和氮氧化合物。用三蒸水溶解，滤入烧杯中，用NaOH溶液调节PH至7.4，用50ml容量瓶定容待测。

利用实施例1制备的镉离子胶体金免疫层析快速检测试纸条对上述水体样品消解液进行镉离子检测，包括以下操作步骤：(步骤b和c见图3所示，步骤d见图4所示)

a、在水体样品消解液中按照9：1的体积比加入摩尔浓度为100mmol/L的EDTA螯合剂，混合均匀，使镉离子与EDTA充分螯合，得到鱼肉样品溶液。

b、用滴管吸取步骤a所得水体样品溶液80μL，滴加于试纸条的加样孔中，加样后开始计时；

实施例8

先将待测样品预处理成消解液：准确称取1.2g土壤样品于50mL微波管中，用少许水湿润后加入2mLHNO₃和6mL HCl，在室温下放置过夜，再置于微波消解炉中，编定微波程序，使其从室温逐渐升温至180℃并保持15m in，然后逐渐降温至室温，取下，用NaOH溶液调节PH至7.4，用50ml容量瓶定容待测。

利用实施例1制备的镉离子胶体金免疫层析快速检测试纸条对上述土壤样品消解液进行镉离子检测，包括以下操作步骤：(步骤b和c见图3所示，步骤d见图4所示)

a、在土壤样品消解液中按照9：1的体积比加入摩尔浓度为100mmol/L的EDTA螯合剂，混合均匀，使镉离子与EDTA充分螯合，得到鱼肉样品溶液。

b、用滴管吸取步骤a所得土壤样品溶液100μL，滴加于试纸条的加样孔中，加样后开始计时；

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1、一种镉离子胶体金免疫层析快速检测试纸条，其特征在于：该试纸条是以聚氯乙烯底板为底部支撑，将样品垫、喷金后的结合垫、包被后的硝酸纤维素膜和吸水纸以依次相连的方式粘贴在聚氯乙烯底板上制成的；所述包被后的硝酸纤维素膜上设置检测线T线和质控线C线，其中检测线T线靠近样品垫一端。

2、根据权利要求1所述的镉离子胶体金免疫层析快速检测试纸条，其特征在于：所述试纸条是以聚氯乙烯底板为底部支撑，将样品垫、喷金后的结合垫、包被后的硝酸纤维素膜和吸水纸粘贴在聚氯乙烯底板上，其中样品垫和吸水纸位于两端，包被后的硝酸纤维素膜的两端分别位于结合垫和吸水纸的下面，结合垫的一端设置于样品垫的下面，另一端设置于包被后的硝酸纤维素膜的上面。

3、根据权利要求1或2所述的镉离子胶体金免疫层析快速检测试纸条，其特征在于：所述结合垫和样品垫是将玻璃纤维在摩尔浓度为0.015mol/L的磷酸盐缓冲液、质量体积比为10g/L的牛血清白蛋白、质量体积比为5g/L的聚乙烯吡咯烷酮和质量体积比为0.2g/L的叠氮化钠组成的混合液中浸泡5～24h，取出后于37～45℃抽风烘干得到；所述磷酸盐缓冲液的pH值为7.4。

4、根据权利要求1所述的镉离子胶体金免疫层析快速检测试纸条的制备方法，其特征在于包括以下操作步骤：

(1)胶体金溶液的制备；

(2)抗镉离子单抗标记的胶体金溶液的制备；

(4)硝酸纤维素膜上包被C，T线：在硝酸纤维素膜上包被C线和T线，其中C线为质控线，包被羊抗鼠免疫球蛋白G，浓度为0.2～1.5mg/ml；T线为检测线，包被镉的完全抗原Cd-iEDTA-BSA，浓度为0.1～0.9mg/ml；37℃～45℃抽风烘干，时间为2～24h；得到包被后的硝酸纤维素膜；

5、根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于：步骤(1)所述胶体金溶液的制备包括以下操作步骤：取质量浓度为0.01％的氯金酸水溶液100mL，搅拌加热至沸腾，一次性加入质量浓度为1％的柠檬酸三钠水溶液2.5mL，继续搅拌加热8～30min，直至溶液呈酒红色，室温冷却，得到含有粒径为20-40nm的胶体金颗粒的胶体金溶液；

步骤(2)所述抗镉离子单抗标记的胶体金溶液的制备包括以下操作步骤：取步骤(1)所得胶体金溶液100mL，用摩尔浓度为0.1mol/L的碳酸钾溶液将其pH值调至8.5；将抗镉离子单抗1.6mg加入到胶体金溶液中，搅拌均匀，静置0.5～24小时；逐滴加入质量浓度为10％的无菌牛血清白蛋白11mL，搅拌0.5～24小时，4℃～30℃静置过夜；将上述标记后的胶体金溶液于2000～5000r/min离心10～20min，弃去沉淀，然后于10000～20000r/min离心10～30min，弃去上清液；加入摩尔浓度为50mmol/L的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐清洗2～3次，最后用上述三羟甲基氨基甲烷盐酸盐10mL重悬，得到抗镉离子单抗标记的胶体金溶液。

6、根据权利要求4或5所述的制备方法，其特征在于：所述抗镉离子单抗的制备步骤如下：用双功能改构乙二胺四乙酸螯合剂将镉离子偶联到血蓝蛋白上，混合弗式不完全佐剂免疫BALB/c小鼠，取免疫小鼠脾细胞和SP2/0骨髓瘤细胞融合，筛选出稳定分泌抗镉离子单克隆抗体的阳性细胞株并扩大培养，注射细胞进小鼠体内诱生腹水，纯化获得抗镉离子单抗。

7、根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于：所述三羟甲基氨基甲烷盐酸盐的pH值是8.5，其含有质量体积比为10g/L的牛血清白蛋白和质量体积比为0.2g/L的叠氮化钠。

8、根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于：步骤(4)所述镉的完全抗原Cd-iEDTA-BSA是用双功能改构乙二胺四乙酸螯合剂将镉离子偶联到牛血清白蛋白上获得检测抗原Cd-iEDTA-BSA。

9、一种利用权利要求1所述镉离子胶体金免疫层析快速检测试纸条进行镉离子检测的方法，其特征在于：包括以下操作步骤：

a、在镉离子标准液或待测样品消解液中按照9：1的体积比加入摩尔浓度为100mmol/L的乙二胺四乙酸螯合剂，混合均匀，使镉离子与乙二胺四乙酸充分螯合，得到待检样品溶液。

10、根据权利要求9所述的方法，其特征在于：步骤a所述待测样品消解液是将待测样品加酸后进行微波或加热消解，然后调PH值至中性获得。