CN114034868A - 一种重金属镉离子的定量检测方法 - Google Patents
一种重金属镉离子的定量检测方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种重金属镉离子的定量检测方法，属于生物检测技术领域，包括如下步骤：S1制备镉离子免疫金标速测卡，镉离子免疫金标速测卡的制备包括以下步骤：(1)制备含有检测线T和质控线C的硝酸纤维素膜；(2)制备金标垫；(3)组装免疫金标速测卡；S2设定镉离子免疫金标速测卡定量检测的标准曲线S3使用镉离子免疫金标速测卡定量检测样本；本发明中利用金标记技术，结合抗原抗体的免疫反应，利用侧向层析的原理，制备成了免疫金标速测卡，可用于快速免疫检测，并与呈色分析仪相结合，呈色分析仪测定C线和T线深度，计算T/C，然后通过线性拟合得到，并将对应参数设置于呈色分析仪，应用呈色分析仪，通过设置标准曲线来实现定量检测。
Description
技术领域
本发明属于生物检测技术领域，更具体地说，尤其涉及一种重金属镉离子的定量检测方法。
背景技术
镉，重有色金属元素，化学符号Cd，原子序数48，1817年发现，单质为银白色金属。镉的毒性较大，被镉污染的空气和食物对人体危害严重，且在人体内代谢较慢。镉会对呼吸道产生刺激，长期暴露会造成嗅觉丧失症、牙龈黄斑或渐成黄圈，镉化合物不易被肠道吸收，但可经呼吸被体内吸收，积存于肝或肾脏造成危害，尤以对肾脏损害最为明显，可导致骨质疏松和软化。欧盟将镉列为高危害有毒物质和可致癌物质并予以规管。
中国土壤污染的总体形势相当严峻，全国每年受重金属污染的粮食达1200万吨。土壤污染造成有害物质在农作物中积累，并通过食物链进入人体，引发各种疾病，最终危害人体健康。
通常认可的重金属分析方法有：紫外可分光光度法(UV)、原子吸牧法(AAS)、原子荧光法(APS)、电感耦合等离子体法(ICP)、X荧光光谱(XRF)、电感耦合等离子质谱法(ICPMS)，但是仪器成本高，对检测人员的技术要求也比较高。
金标记技术利用金颗粒具有高电子密度的特性，将蛋白结合于金颗粒形成标记物，当这些标记物在相应的配体处大量聚集的时候，就形成肉眼可见的黑色或者粉红色斑点或条带。利用金标记技术，结合抗原抗体的免疫反应，利用侧向层析的原理，就制备成了免疫金标速测卡，可用于快速免疫检测。
免疫金标色测卡通常都是肉眼观察结果，只能定性或者半定量，而无法进行定量检测，为此，我们提出一种重金属镉离子的定量检测方法来解决这个问题。
发明内容
本发明的目的是为了解决现有技术中存在的缺点，而提出的一种重金属镉离子的定量检测方法。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
一种重金属镉离子的定量检测方法，包括如下步骤：
S1、制备镉离子免疫金标速测卡，所述镉离子免疫金标速测卡的制备包括以下步骤：
(1)制备含有检测线T和质控线C的硝酸纤维素膜；
(2)制备金标垫；
(3)组装免疫金标速测卡；
S2、设定镉离子免疫金标速测卡定量检测的标准曲线，所述镉离子免疫金标速测卡定量检测的标准曲线设定包括以下步骤：
(1)用缓冲液配置0、1、5、10、20、50ppb的镉离子标品溶液；
(2)用吸管吸取标品溶液，滴加4滴于加样孔，在室温条件下反应8分钟后使用呈色分析仪读取C线和T线数值；
(3)计算T/C值，并绘制标准曲线；
S3、使用镉离子免疫金标速测卡定量检测样本，包括以下步骤：
(1)处理样本得到样本提取液；
(2)用吸管吸取样本提取液，滴加4滴于加样孔，在室温条件下反应8分钟后使用设置好标准曲线的呈色分析仪读数，读取定量值。
优选的，所述步骤S1中，含有检测线T和质控线C的硝酸纤维素膜的制备包括包被抗原的制备以及硝酸纤维素膜包被，其中包被抗原的制备包括以下步骤：将镉离子包被抗原用10mM、pH值为7.4的PBS缓冲溶液稀释到0.25mg/mL得到镉离子包被抗原溶液，作为检测线T的包被抗原；羊抗鼠IgG二抗溶液为将羊抗鼠IgG二抗用浓度为10mM、pH值为7.4的PBS缓冲溶液稀释到1mg/ml，作为质控线C的包被鼠单抗。
优选的，所述硝酸纤维素膜具体包被操作如下：选取PALL170的硝酸纤维素膜用划膜喷金机将浓度为0.25mg/mL的镉离子包被抗原溶液以1.0μL/cm划T线，作为检测线；浓度为1mg/mL的羊抗鼠IgG二抗溶液以1.0μL/cm划C线，作为质控线；37℃烘干24小时，待用；得到包被好的硝酸纤维素膜。
优选的，所述步骤S1中，制备金标垫包括以下步骤：
1)胶体金制备；
2)鼠单抗标记；
3)喷金。
优选的，所述胶体金制备包括以下步骤：
1)准备：将500mL烧杯、20mL小烧杯、转子、棕色瓶、玻璃棒等洗净后放入酸缸中浸泡24小时。取出先用自来水冲洗3-4次，再用超纯水冲洗3-4次，置于37℃烘箱中烘干备用；
2)烧金溶液A的配置：用塑料称量匙称取1g氯金酸粉末于棕色瓶中，加入99ml超纯水充分溶解，4℃避光保存；
3)烧金溶液B的配置：称取1g柠檬酸三钠溶解于99ml超纯水中，混匀；
胶体金的制备：量取99ml超纯水于烧杯中，加入1ml烧金溶液A，置于恒温磁力搅拌器上搅拌混匀，开启加热至溶液沸腾，迅速加入2ml新制备的烧金溶液B，继续搅拌加热，溶液逐渐变为蓝黑色，然后紫黑，再加热出现红色，继续沸煮出现透明的橙红色，继续沸煮10min，自然冷却至室温，加超纯水定容至100ml，倒入棕色瓶，4℃避光保存；得到胶体金溶液。
优选的，所述鼠单抗标记包括以下步骤：
1)鼠单抗的标记：取1.5ml制取好的胶体金溶液，用0.1M的K2CO3调节pH值，加入20ug镉离子鼠单抗，混合均匀，室温反应40min，加入10％的BSA终止，静置30min。
2)标记鼠单抗纯化：先用低速1500r/min离心上述静置产物，弃去由凝聚的金胶粒形成的沉淀，收集上清液；再用高速8500r/min离心30分钟，仔细吸去上清液，收集沉淀，用含1％BSA的0.1M PBS复溶沉淀，4℃保存；得到标记胶体金镉离子鼠单抗溶液，浓度为0.4mg/ml。
优选的，所述喷金包括以下步骤：将浓度为0.4mg/ml标记胶体金镉离子鼠单抗溶液以1.0μL/cm喷于预处理过的金标垫，烘干待用，得到固定有胶体金标记的特异性单克隆鼠单抗的金标垫。
优选的，所述步骤S1中免疫金标速测卡的组装包括以下步骤：
1)将样品垫和吸水垫裁剪成2.5cm宽，金标垫0.6cm宽；
2)在底板上粘贴包被抗原的硝酸纤维素膜；
3)粘贴金标垫，将金标垫的2-3mm覆盖在硝酸纤维素膜上；
4)粘贴样品垫，将样品垫的2-3mm覆盖在金标垫上；
5)粘贴吸水垫，将吸水垫的4-5mm覆盖在硝酸纤维素膜上；
6)用衔接胶带固定每层的衔接部分；
7)将组装好的底板裁剪成3mm宽的试纸条；
8)装入卡壳，得到免疫金标速测卡，密封保存备用。
本发明的技术效果和优点：本发明提出的一种重金属镉离子的定量检测方法，与现有技术相比，具有以下优点：
本发明中利用金标记技术，结合抗原抗体的免疫反应，利用侧向层析的原理，制备成了免疫金标速测卡，可用于快速免疫检测，并与呈色分析仪相结合，呈色分析仪测定C线和T线深度，计算T/C，然后通过线性拟合得到，并将对应参数设置于呈色分析仪，应用呈色分析仪，通过设置标准曲线来实现定量检测。
附图说明
图1为本发明标准曲线的示意图；
图2为本发明免疫金标速测卡的结构示意图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
本发明提供了如图1-2所示的一种重金属镉离子的定量检测方法，包括如下步骤：
S1、制备镉离子免疫金标速测卡，镉离子免疫金标速测卡的制备包括以下步骤：
(1)制备含有检测线T和质控线C的硝酸纤维素膜，含有检测线T和质控线C的硝酸纤维素膜的制备包括包被抗原的制备以及硝酸纤维素膜包被，其中包被抗原的制备包括以下步骤：将镉离子包被抗原用10mM、pH值为7.4的PBS缓冲溶液稀释到0.25mg/mL得到镉离子包被抗原溶液，作为检测线T的包被抗原；羊抗鼠IgG二抗溶液为将羊抗鼠IgG二抗用浓度为10mM、pH值为7.4的PBS缓冲溶液稀释到1mg/ml，作为质控线C的包被鼠单抗；
硝酸纤维素膜包被包括以下步骤：选取PALL170的硝酸纤维素膜用划膜喷金机将浓度为0.25mg/mL的镉离子包被抗原溶液以1.0μL/cm划T线，作为检测线；浓度为1mg/mL的羊抗鼠IgG二抗溶液以1.0μL/cm划C线，作为质控线；37℃烘干24小时，待用；得到包被好的硝酸纤维素膜；
(2)制备金标垫，制备金标垫包括以下步骤：1)胶体金制备；
a)准备：将500mL烧杯、20mL小烧杯、转子、棕色瓶、玻璃棒等洗净后放入酸缸中(重铬酸钾：浓硫酸：超纯水＝120g:200ml:1000ml)浸泡24小时。取出先用自来水冲洗3-4次，再用超纯水冲洗3-4次，置于37℃烘箱中烘干备用；
b)烧金溶液A的配置：用塑料称量匙称取1g氯金酸粉末于棕色瓶中，加入99ml超纯水充分溶解，4℃避光保存；
c)烧金溶液B的配置：称取1g柠檬酸三钠溶解于99ml超纯水中，混匀；
胶体金的制备：量取99ml超纯水于烧杯中，加入1ml烧金溶液A，置于恒温磁力搅拌器上搅拌混匀，开启加热至溶液沸腾，迅速加入2ml新制备的烧金溶液B，继续搅拌加热，溶液逐渐变为蓝黑色，然后紫黑，再加热出现红色，继续沸煮出现透明的橙红色，继续沸煮10min，自然冷却至室温，加超纯水定容至100ml，倒入棕色瓶，4℃避光保存；得到胶体金溶液
2)鼠单抗标记，鼠单抗标记包括以下步骤：
a)鼠单抗的标记：取1.5ml制取好的胶体金溶液，用0.1M的K2CO3调节pH值，加入20ug镉离子鼠单抗，混合均匀，室温反应40min，加入10％的BSA终止，静置30min。
b)标记鼠单抗纯化：先用低速1500r/min离心上述静置产物，弃去由凝聚的金胶粒形成的沉淀，收集上清液；再用高速8500r/min离心30分钟，仔细吸去上清液，收集沉淀，用含1％BSA的0.1M PBS复溶沉淀，4℃保存；得到标记胶体金镉离子鼠单抗溶液，浓度为0.4mg/ml；
3)喷金，喷金包括以下步骤：将浓度为0.4mg/ml标记胶体金镉离子鼠单抗溶液以1.0μL/cm喷于预处理过的金标垫，烘干待用，得到固定有胶体金标记的特异性单克隆鼠单抗的金标垫；
(3)组装免疫金标速测卡，免疫金标速测卡的组装包括以下步骤：将样品垫和吸水垫裁剪成2.5cm宽，金标垫0.6cm宽；(a)在底板上粘贴包被抗原的硝酸纤维素膜；(b)粘贴金标垫，将金标垫的2-3mm覆盖在硝酸纤维素膜上；(c)粘贴样品垫，将样品垫的2-3mm覆盖在金标垫上；(d)粘贴吸水垫，将吸水垫的4-5mm覆盖在硝酸纤维素膜上；(e)用衔接胶带固定每层的衔接部分；(f)将组装好的底板裁剪成3mm宽的试纸条；(g)装入卡壳，得到免疫金标速测卡，密封保存备用；
S2、设定镉离子免疫金标速测卡定量检测的标准曲线，镉离子免疫金标速测卡定量检测的标准曲线设定包括以下步骤：
(1)用缓冲液配置0、1、5、10、20、50ppb的镉离子标品溶液；
(2)用吸管吸取标品溶液，滴加4滴于加样孔，在室温条件下反应8分钟后使用呈色分析仪读取C线和T线数值；
(3)计算T/C值，并绘制标准曲线；
| 浓度(ppb) | T值 | C值 | T/C |
| 0 | 1076 | 1652 | 0.65 |
| 1 | 922 | 1681 | 0.55 |
| 5 | 521 | 1716 | 0.3 |
| 10 | 339 | 1671 | 0.2 |
| 20 | 169 | 1640 | 0.1 |
| 50 | 102 | 1702 | 0.06 |
将标准曲线数据设置入呈色分析仪，用于后续的定量检测。
S3、使用镉离子免疫金标速测卡定量检测样本，包括以下步骤：
(1)处理样本得到样本提取液；
(2)用吸管吸取样本提取液，滴加4滴于加样孔，在室温条件下反应8分钟后使用设置好标准曲线的呈色分析仪读数，读取定量值。
实施例2
请参照图2，本发明还公开了用于检测镉离子的免疫金标速测卡，免疫金标速测卡，包括底板2和放置在其上的样品垫6、包被有胶体金标记镉离子鼠单抗的金标垫5、含有检测线T和质控线C的硝酸纤维素膜3、和吸水垫4，检测线T包被有镉离子包被抗原，质控线C包被有羊抗鼠IgG二抗；检测卡的整体外部包裹有外壳1，该外壳1上对应于样品垫6处设置有加样孔7，外壳1上对应于质控线和检测线处设置有观察孔8。
上述速测卡中，包被有胶体金标记镉离子鼠单抗的金标垫5为将胶体金标记镉离子鼠单抗溶液喷于金标垫5上干燥形成；
胶体金标记镉离子鼠单抗溶液的浓度为0.4mg/ml；
上述速测卡中，检测线T包被的镉离子包被抗原浓度为0.25mg/mL；
质控线C包被的羊抗鼠IgG二抗溶液的浓度为1mg/ml。
应用呈色分析仪，通过设置标准曲线来实现定量检测。
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (8)
1.一种重金属镉离子的定量检测方法，其特征在于：包括如下步骤：
S1、制备镉离子免疫金标速测卡，所述镉离子免疫金标速测卡的制备包括以下步骤：
(1)制备含有检测线T和质控线C的硝酸纤维素膜；
(2)制备金标垫；
(3)组装免疫金标速测卡；
S2、设定镉离子免疫金标速测卡定量检测的标准曲线，所述镉离子免疫金标速测卡定量检测的标准曲线设定包括以下步骤：
(1)用缓冲液配置0、1、5、10、20、50ppb的镉离子标品溶液；
(2)用吸管吸取标品溶液，滴加4滴于加样孔，在室温条件下反应8分钟后使用呈色分析仪读取C线和T线数值；
(3)计算T/C值，并绘制标准曲线；
S3、使用镉离子免疫金标速测卡定量检测样本，包括以下步骤：
(1)处理样本得到样本提取液；
(2)用吸管吸取样本提取液，滴加4滴于加样孔，在室温条件下反应8分钟后使用设置好标准曲线的呈色分析仪读数，读取定量值。
2.根据权利要求1所述的一种重金属镉离子的定量检测方法，其特征在于：所述步骤S1中，含有检测线T和质控线C的硝酸纤维素膜的制备包括包被抗原的制备以及硝酸纤维素膜包被，其中包被抗原的制备包括以下步骤：将镉离子包被抗原用10mM、pH值为7.4的PBS缓冲溶液稀释到0.25mg/mL得到镉离子包被抗原溶液，作为检测线T的包被抗原；羊抗鼠IgG二抗溶液为将羊抗鼠IgG二抗用浓度为10mM、pH值为7.4的PBS缓冲溶液稀释到1mg/ml，作为质控线C的包被鼠单抗。
3.根据权利要求2所述的一种重金属镉离子的定量检测方法，其特征在于：所述硝酸纤维素膜具体包被操作如下：选取PALL170的硝酸纤维素膜用划膜喷金机将浓度为0.25mg/mL的镉离子包被抗原溶液以1.0μL/cm划T线，作为检测线；浓度为1mg/mL的羊抗鼠IgG二抗溶液以1.0μL/cm划C线，作为质控线；37℃烘干24小时，待用；得到包被好的硝酸纤维素膜。
4.根据权利要求1所述的一种重金属镉离子的定量检测方法，其特征在于：所述步骤S1中，制备金标垫包括以下步骤：
1)胶体金制备；
2)鼠单抗标记；
3)喷金。
5.根据权利要求4所述的一种重金属镉离子的定量检测方法，其特征在于：所述胶体金制备包括以下步骤：
1)准备：将500mL烧杯、20mL小烧杯、转子、棕色瓶、玻璃棒等洗净后放入酸缸中浸泡24小时。取出先用自来水冲洗3-4次，再用超纯水冲洗3-4次，置于37℃烘箱中烘干备用；
2)烧金溶液A的配置：用塑料称量匙称取1g氯金酸粉末于棕色瓶中，加入99ml超纯水充分溶解，4℃避光保存；
3)烧金溶液B的配置：称取1g柠檬酸三钠溶解于99ml超纯水中，混匀；
胶体金的制备：量取99ml超纯水于烧杯中，加入1ml烧金溶液A，置于恒温磁力搅拌器上搅拌混匀，开启加热至溶液沸腾，迅速加入2ml新制备的烧金溶液B，继续搅拌加热，溶液逐渐变为蓝黑色，然后紫黑，再加热出现红色，继续沸煮出现透明的橙红色，继续沸煮10min，自然冷却至室温，加超纯水定容至100ml，倒入棕色瓶，4℃避光保存；得到胶体金溶液。
6.根据权利要求4所述的一种重金属镉离子的定量检测方法，其特征在于：所述鼠单抗标记包括以下步骤：
1)鼠单抗的标记：取1.5ml制取好的胶体金溶液，用0.1M的K2CO3调节pH值，加入20ug镉离子鼠单抗，混合均匀，室温反应40min，加入10％的BSA终止，静置30min。
2)标记鼠单抗纯化：先用低速1500r/min离心上述静置产物，弃去由凝聚的金胶粒形成的沉淀，收集上清液；再用高速8500r/min离心30分钟，仔细吸去上清液，收集沉淀，用含1％BSA的0.1M PBS复溶沉淀，4℃保存；得到标记胶体金镉离子鼠单抗溶液，浓度为0.4mg/ml。
7.根据权利要求4所述的一种重金属镉离子的定量检测方法，其特征在于：所述喷金包括以下步骤：将浓度为0.4mg/ml标记胶体金镉离子鼠单抗溶液以1.0μL/cm喷于预处理过的金标垫，烘干待用，得到固定有胶体金标记的特异性单克隆鼠单抗的金标垫。
8.根据权利要求1所述的一种重金属镉离子的定量检测方法，其特征在于：所述步骤S1中免疫金标速测卡的组装包括以下步骤：
1)将样品垫和吸水垫裁剪成2.5cm宽，金标垫0.6cm宽；
2)在底板上粘贴包被抗原的硝酸纤维素膜；
3)粘贴金标垫，将金标垫的2-3mm覆盖在硝酸纤维素膜上；
4)粘贴样品垫，将样品垫的2-3mm覆盖在金标垫上；
5)粘贴吸水垫，将吸水垫的4-5mm覆盖在硝酸纤维素膜上；
6)用衔接胶带固定每层的衔接部分；
7)将组装好的底板裁剪成3mm宽的试纸条；
8)装入卡壳，得到免疫金标速测卡，密封保存备用。
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